په خمیر کې د میتیلین بلو ازموینې: د ژوندیو حجرو شمېرل او د تنفس وخت اندازه کول

د کار پر مېز دوه ټیوبونه ایښي دي. دواړه آبي دي. په یوه کې، د مایکروسکوپ لاندې آبي حجرې د خمیر مړې حجرې ښيي. په بل کې، هغه ټیوب چې له آبي څخه بې‌رنګه کېږي، ښيي چې خمیر ژوندی دی او تنفس کوي. رنګ یو دی، خو تعبیرونه یې یو د بل مخالف دي. که دا دوه ازموینې سره ګډې کړئ، هره پایله سرچپه کېږي.

همدا توپیر د ټولې مقالې موضوع ده. میتیلین بلو د اکسیداسیون او اختزال رنګ دی: په اکسید شوې بڼه آبي وي او په اختزال شوې بڼه بې‌رنګه لیوکومیتیلین بلو وي. د ژوندي پاتې کېدو وړتیا شمېرنه له دې کیمیاوي ځانګړنې څخه په یوې لنډې مایکروسکوپي کتنې کې کار اخلي. د تنفس تجربه یې بیا په یو ټولیز، د وخت له مخې څارل کېدونکي تعامل کې کاروي. هره یوه خپل پروتوکول، خپل کنټرولونه او خپل انتقادي احتیاط ته اړتیا لري.

د ژوندي پاتې کېدو وړتیا شمېرنه: لنډ رنګول او سمدستي لوستل

د بیر جوړونې پروتوکول تر ټولو معیاري بڼه ده. په 2% سوډیم سیټرېټ کې 0.01% w/v میتیلین بلو چمتو کړئ، د خمیر له سوسپانسیون سره یې په 1:1 نسبت ګډ کړئ او مخلوط له یوې لنډې، ټاکلې مودې وروسته وګورئ. په خپرو شویو سرچینو کې دا موده د بیر جوړونې د ساینس انسټیټیوټ په لارښود کې له 1 تر 2 دقیقو او په څېړنیزو پروتوکولونو کې شاوخوا 5 دقیقې ده، خو د OIV د شرابو د مایکروبیولوژۍ طریقه په 10 دقیقو کې دننه کتنه غواړي. د شمېرنې په مخلوط کې د رنګ وروستی غلظت نږدې 0.005% کېږي. یو اصلاح شوی Neubauer د شمېرنې چیمبر ډک کړئ او په شاوخوا 400x لویوالي کې تیاره آبي حجرې د غیرژوندیو او بې‌رنګه حجرې د ژوندیو په توګه طبقه‌بندي کړئ. په OIV طریقه کې روښانه آبي حجرې ژوندۍ شمېرل کېږي؛ دا لا له وړاندې د هغه شخصي قضاوت ستونزې ته اشاره کوي چې لاندې پرې بحث کېږي.

د حجرو غلظت د چیمبر له هندسي ابعادو محاسبه کېږي. کله چې بشپړه مرکزي 1 mm مربع وشمېرل شي، په هر mL کې د حجرو شمېر له N ضرب د رقیقولو ضریب ضرب 10^4 سره برابر وي؛ N په هماغه ساحه کې د حجرو شمېر دی، لکه څنګه چې د ASBC د خمیر په طریقو کې بیان شوی. د ژوندي پاتې کېدو وړتیا محاسبه ساده ده: د بې‌رنګه حجرو شمېر د ټولو حجرو پر شمېر ووېشئ او په 100 یې ضرب کړئ. د FEMS د بیر جوړونې د پرتلیزې څېړنې او د OIV د کړنلارې له مخې، د ژوندي پاتې کېدو وړتیا د اټکل لپاره شاوخوا 400 حجرې وشمېرئ. د پولو یوه قاعده په ثابت ډول وکاروئ؛ د بېلګې په توګه، د جال پر لاندې او کیڼو کرښو پرتې حجرې وشمېرئ او پر پورته او ښیو کرښو پرتې حجرې مه شمېرئ.

د شمېرنې له پیل مخکې باید د غوټیو لپاره قاعده وټاکل شي. د یوې عامې قاعدې له مخې، کله چې غوټۍ د مور حجرې شاوخوا نیمې اندازې ته ورسېږي، جلا حجره شمېرل کېږي؛ تر دې کوچنۍ غوټۍ له مور حجرې سره یوځای شمېرل کېږي. هره قاعده چې غوره کوئ، په هره مربع کې یې پلي کړئ او په کاري پاڼه کې یې ولیکئ، څو بل کس هم هماغه قاعده تکرار کړي.

د شمېرنې کاري پاڼه (دا چاپ کړئ)

دا کاري پاڼه د دې مقالې لپاره ځانګړې جوړه شوې ده. په کتابچه کې یې نقل کړئ یا د هرې نمونې لپاره یوه کاپي چاپ کړئ.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4، چې N د چیمبر له ټاکل شوې ساحې اخیستل کېږي. د پایلې ترڅنګ د رنګولو موده ثبت کړئ، ځکه د ژوندي پاتې کېدو وړتیا هغه شمېره چې وخت یې نه وي ثبت شوی، د بیا تولید وړ نه ده.

ولې د ژوندي پاتې کېدو وړتیا شمېرې بدلېږي

وخت لومړۍ مداخله ده او په دواړو لورو اغېز کوي. له میتابولیک پلوه فعالې حجرې رنګ اختزالوي، نو ژر لوستل ښايي ژوندۍ حجرې مخکې له دې وښيي چې اختزال بشپړ کړي او په تېروتنه یې مړې وبلل شي. خو اوږده تماس پخپله زهرجن دی او رښتیا زیانمنې شوې آبي حجرې رامنځته کوي، چې د مړینې ناسمه رنګي نښه ورکوي. له همدې امله یو لابراتواري تدریسي پروتوکول په 5 دقیقو کې دننه ارزونه ټاکي، لکه څنګه چې د ویسکانسن د خمیر په تدریسي پروتوکول کې مستند شوي. محتاط بیان دا دی چې د میتیلین بلو ارزونه پر وخت پورې تړلې ده؛ نو یوه لنډه موده وټاکئ او د یوې لړۍ په ټولو نمونو کې یې ثابته وساتئ.

هغه نمونې چې د ژوندي پاتې کېدو وړتیا یې ټیټه وي، دویمه خطا هم لري. معیاري طریقه خبرداری ورکوي چې میتیلین بلو تر شاوخوا 80% لاندې د ژوندي پاتې کېدو رښتینې وړتیا تر واقعي کچې لوړه اټکلولای شي، ځکه هغه حجرې چې لا هم رنګ اختزالوي، اړینه نه ده چې د تکثیر وړتیا هم وساتي. د بیر جوړونې ادبیات هم هغه مهال ورته بې‌باوري بیانوي چې د ژوندي پاتې کېدو وړتیا ډېره ټیټه شوې وي. میتیلین بلو یو چټک او نږدې اټکل وبولئ، او د ټیټې وړتیا اړوند مهمې پرېکړې، لکه د یوه کلتور بیا ورګډول، د کلتوري پلېټونو په شمېرنې یا یوه بشپړوونکي رنګ سره تایید کړئ.

د نمونې د چاپېریال اغېزې درېیم ځای لري. د OIV طریقه نږدې په pH 4.6 کې ترسره کېږي او خبرداری ورکوي چې د ټیټ pH هغه نمونې چې قوي بفر لري، د رنګ د سم چلند مخه نیسي. دا طریقه همدارنګه له 100 g/L څخه د زیاتې بورې په شتون کې د ازموینې نه ترسره کولو سپارښتنه کوي، ځکه حجرې په تېروتنه روښانه آبي لوستل کېږي. د رنګولو د pH یوې تجربوي پرتله د ازمویل شوې کچې په اوږدو کې په حساسیت کې د پام وړ بدلون موندلی، چې د میتیلین بلو د pH پورې تړلې طریقې له څېړنې سره سمون لري. پاتې شوني جلا دام دی: په ناپاکو مَش مخلوطونو کې رنګ شوې ذرې مړو حجرو ته ورته ښکاري او د کارکوونکو ترمنځ د پایلو توپیر زیاتوي.

دا توپیر په شمیرو اندازه شوی، یوازې نقل شوې تجربه نه ده. د بیر جوړونې په یوې شپږمیاشتنۍ ازموینه کې چې د FEMS د خمیر په پرتله کې راپور شوې، د میتیلین بلو د دوه ځلي اندازه‌ګیرو منځنی معیاري انحراف 6.1% و، په داسې حال کې چې د اوکسونول د جریاني سایتومېټرۍ لپاره 0.2% و؛ د دوو کارکوونکو پایلو په یوه نمونه کې تر 13 سلنه ټکو پورې توپیر درلود. د ژوندي پاتې کېدو وړتیا د طریقو یوې کمیتي پرتله په 2023 کې وموندله چې فلورېسنس مایکروسکوپي او جریاني سایتومېټري د پام وړ ډېرې دقیقې دي، او دا یې هم وښوده چې د طریقې کارکردګي په نوعه او د نمونې په چاپېریال پورې تړلې ده. د Painting او Kirsop (PMID 24430080) د کلاسیکې طریقې تشریح لا هم د رجوع بنسټ دی، او د خمیر د ژوندي پاتې کېدو وړتیا او حیاتي فعالیت د ازموینو پراخه بیاکتنه (PMID 25154541) میتیلین بلو د قطعي ازموینو پر ځای د بشپړوونکو ازموینو په ډله کې راولي. ټریپان بلو دلته په خپله غوره بدیل نه دی: هغه د غشا د بشپړتیا له لاسه ورکول ښيي، خو میتیلین بلو د رنګ اخیستل او د اختزال فعالیت ښيي؛ نو تر فشار لاندې حجرې د دغو دوو رنګونو په کارولو سره په بېلابېلو ډلو کې راتلای شي.

د تنفس تجربه: د آبي رنګ د ورکېدو وخت اندازه کړئ

دویمه ازموینه هېڅکله مایکروسکوپ نه کاروي. خمیر، ګلوکوز او رقیق میتیلین بلو په یوه تړلي ټیوب کې اچول کېږي، او ساعت اندازه کوي چې آبي رنګ په څومره وخت کې ورکېږي. کله چې حجرې میتابولیزم کوي، اختزالوونکي معادلونه تولیدوي چې آبي رنګ بې‌رنګې بڼې ته اړوي؛ په همدې وخت کې حل شوی اکسیجن بېرته هغه اکسیدوي. کله چې حجرې اکسیجن کم کړي، خالص اختزال غالبېږي او ټیوب بې‌رنګه کېږي. له همدې امله وروستی ټکی د تنفس، د رنګ د غلظت او د اکسیجن د شتون ترمنځ توازن څرګندوي، او باید د میتیلین بلو د اختزال یا بې‌رنګېدو د وخت په توګه راپور شي، نه د مالیکولي اکسیجن د مصرف د مستقیم سرعت په توګه.

د ژوندیو حجرو د شمېرنې په پرتله ډېر رقیق رنګ وکاروئ، څو وخت په یوه مناسب حد کې راشي. د AQA د A کچې د اړینو عملي کارونو لارښود دا ښه معیاري کوي: په هر 100 mL اوبو کې 1 g ګلوکوز چې شاوخوا 30 C ته تودې شوې وي، 5 g وچ خمیر چې له کارولو سمدستي مخکې ورزیاتېږي، او نږدې 0.001% کاري رنګ چې د 1% اصلي محلول د 0.1 mL په رقیقولو سره تر 100 mL پورې چمتو کېږي. د خمیر او ګلوکوز 2 mL سوسپانسیون له 2 mL کاري رنګ سره ګډ کړئ، د ازموینې له تودوخې سره یې برابر کړئ، یو ځل یې د 10 ثانیو لپاره وخوځوئ، وخت‌سنج پیل کړئ او بیا یې مه خوځوئ. خوځول اکسیجن بېرته ورګډوي او ټیوب بیا آبي کوي؛ دا د کړنلارې تر ټولو لویه مصنوعي اغېزه ده. AQA یادونه کوي چې دا چمتووالی باید په عادي حالت کې په 35 C کې شاوخوا په 5 دقیقو کې بې‌رنګه شي؛ په ازموینو کې منځني وختونه په 20 C کې 275 s، په 35 C کې 128 s او په 45 C کې 145 s وو. دا د یوه ځانګړي ترتیب بېلګې دي، نه نړیوال معیارونه. په کنټرول شویو شرایطو کې د اختزال د سرعت او له میتابولیک پلوه د فعال خمیر ترمنځ کمیتي اړیکه د اختزال ځانګړې څېړنې تاییدوي، چې د PMID 25773544 لاندې ثبت شوی کار او په Yeast (2014) کې د میکانیزم څېړنه هم پکې شامل دي.

د وخت په تېرېدو د بدلون بېلګه (ځانګړې جوړه شوې)

لاندې جدول د دې مقالې لپاره یوه ځانګړې جوړه شوې بېلګه ده چې پورته بیان شوی د AQA په څېر ترتیب کاروي: 2 mL د خمیر او ګلوکوز مخلوط له 2 mL نږدې 0.001% کاري رنګ سره، یو ځل د 10 ثانیو لپاره خوځول او بیا بې له خوځولو انکوبېشن. ثبتونه بېلګه‌ییزې اندازې دي، په هغه بڼه چې د زده‌کوونکو یوه ډله یې باید ثبت کړي؛ د سرعت شاخص داسې تعریف شوی چې 1 د بې‌رنګېدو پر وخت په ثانیو کې وېشل کېږي. همدا ټیوبونه وازمویئ او دا ثبتونه په خپلو اندازه شویو ارزښتونو بدل کړئ.

د A، B او C ټیوبونو لپاره د سرعت شاخص د تودوخې په مقابل کې رسم کړئ. منحني لوړېږي او بیا هوارېږي یا ښکته کېږي؛ دا د انزایمونو له خوا د پرمخ وړل کېدونکي بهیر تمه کېدونکې بڼه ده، نه یوه نېغه کرښه. D، E او F ټیوبونه د دې منحني د معلوماتو ټکي نه دي. دا هغه کنټرولونه دي چې د منحني تعبیر ممکنوي.

هغه کنټرولونه چې هرې ازموینې ته مانا ورکوي

د تنفس هره ازموینه درې ملګرو ته اړتیا لري. جوش شوی یا وژل شوی خمیر له ګلوکوز او رنګ سره باید آبي پاتې شي؛ دا ثابتوي چې چټک اختزال په ژوندي میتابولیزم پورې تړلی دی. ژوندی خمیر له رنګ سره، خو له ورزیات شوي ګلوکوز پرته، د سبسټرېټ کنټرول دی؛ بیا هم د ورو بې‌رنګېدو تمه ولرئ، ځکه خمیر خپلې داخلي زېرمې مصرفوي. ګلوکوز او رنګ، له خمیر پرته، کیمیاوي بلانک دی؛ دا اړین دی، ځکه په قلوي شرایطو کې ګلوکوز د هېڅ حجرو له شتون پرته میتیلین بلو اختزالولای شي.

د ژوندي پاتې کېدو وړتیا شمېرنه بل ډول کنټرول ته اړتیا لري: د کړنلارې ثبات. د رنګ هماغه اصلي محلول، د ګډولو هماغه نسبت، د رنګولو هماغه موده، د چیمبر هماغه ساحه او د غوټیو او پولو هماغه قواعد وکاروئ؛ چېرې چې ممکنه وي، شمېرونکی دې د نمونې له هویت او تمه کېدونکې پایلې ناخبره وي. کله چې د دوو کارکوونکو پایلې لس ټکي توپیر ولري، کاري پاڼه معمولاً لامل څرګندوي: بېلابېل وختونه، د آبي رنګ بېلابېل حدونه یا د غوټیو بېلابېل قواعد. د رنګ شويو حجرو د چمتو کولو او لیدلو تخنیکونه د باکتریاوو د ساده رنګولو له طریقو سره تړاو لري، او د دې پراخه کتنه چې رنګ په بېلابېلو نمونو کې څه نښه کوي، د مایکروسکوپي رنګولو په اطلس کې موندل کېږي. د هر آبي شدت د کمیتي لوستلو تر شا د فزیک لپاره، هغه د جذب مرجع چې شرایط یې مشخص شوي وي، روښانوي چې ولې هر ضریب باید د خپل محلل، pH او غلظت له شرایطو سره یوځای وړاندې شي.

ازموینه د پوښتنې له مخې غوره کړئ. دا چې همدا اوس څومره حجرې ژوندۍ دي، د شمېرنې پوښتنه ده چې د مایکروسکوپ او کاري پاڼې په مرسته ځوابېږي. دا چې دغه کلتور څومره فعال تنفس کوي، د سرعت او وخت پوښتنه ده چې د وخت‌سنج او کنټرول شویو ټیوبونو په مرسته ځوابېږي. میتیلین بلو د دواړو لپاره کارېږي، خو هېڅکله په یوه ټیوب کې په یوه وخت د دواړو لپاره نه کارېږي.