د G6PD په لابراتواري ازموینو کې مېتیلین بلو: دا رنګ په حقیقت کې څه کوي

یو زده کوونکی له انکیوبېشن وروسته دوو ټیوبونو ته ګوري. یوه یې تمه کېدونکی رنګ اخیستی دی. بل یې نه دی اخیستی. زده کوونکی دې پایلې ته رسېږي چې دویم ناروغ د ګلوکوز-6-فاسفېټ ډيهایډروجنیز کمښت لري. ښايي دا پایله سمه وي، خو دا استدلال هغه مفهوم له پامه غورځوي چې ازموینه پرې کار کوي. په ټیوب کې هېڅ شی انزایم په مستقیم ډول نه اندازه کوي. ټیوب هغه څه اندازه کوي چې انزایم یې تولیدوي، او مېتیلین بلو د منځګړي په توګه کاروي.

کله چې دا غیرمستقیمه اړیکه روښانه شي، کړنلاره، کنټرولونه او د ناسمو پایلو اوږد لړ نور خپل‌سري نه ښکاري.

لنډ ځواب

د G6PD په ازموینه کې مېتیلین بلو د اکسایش او احیا شاخص دی. د G6PD انزایم NADPH تولیدوي، او پر NADPH متکي سیستمونه آبي مېتیلین بلو د هغه بې‌رنګې لیوکو بڼې ته احیا کوي، یا یې د الکترونونو د لېږد لپاره کاروي. د انزایم عادي فعالیت اغېزمنه احیا رامنځته کوي. کم فعالیت ورو یا نیمګړې احیا رامنځته کوي. د ازموینې ټوله نښه همدا ده.

دوه تاریخي میتودونه همدا رنګ کاروي، خو د پای نښې یې توپیر لري. که یې له یو بله جلا وساتئ، ډېری ګډوډي له منځه ځي.

دوه ازموینې، یو رنګ، بېلابېلې د پای نښې

لومړۍ د مېتیلین بلو د مستقیمې احیا ازموینه ده، چې ساس او همکارانو یې تشریح کړې او وروسته ګیبس ارزولې ده. دلته د پای نښه پخپله رنګ دی: اکسید شوی آبي مېتیلین بلو د بې‌رنګ لیوکومېتیلین بلو پر لور احیا کېږي، او د دې بدلون چټکتیا د NADPH د تولید وړتیا منعکسوي. د سکریننګ اصلي مقاله په PubMed کې د ساس او همکارانو (1966) تر نوم لاندې ثبت شوې ده.

دویمه د بروور د مېتهیموګلوبین د احیا ازموینه ده. سوډیم نایټرایټ لومړی هیموګلوبین اکسیدوي او په نسواري مېتهیموګلوبین یې بدلوي. مېتیلین بلو بیا د الکترونونو د لېږد د منځګړي په توګه عمل کوي: احیا شوی مېتیلین بلو مېتهیموګلوبین ته احیا کوونکي معادلونه لېږدوي او بېرته یې په سور هیموګلوبین بدلوي. نو د لیدلو وړ د پای نښه نسواري د سور په مقابل کې ده، نه آبي د بې‌رنګ په مقابل کې. اصلي میتود د روغتیا نړیوال سازمان په بولټن کې خپور شوی و (بروور او همکاران، 1960).

د بروور ازموینې ته د رنګ د بې‌رنګېدو ازموینه ویل د کیمیا له پلوه دقیق نه دي. رنګ په دوراني ډول اکسید او احیا کېږي؛ هیموګلوبین رنګ بدلوي. لاندې انځور دواړه لارې ښيي.

بنسټیز تعامل

G6PD د پېنټوز فاسفېټ لارې لومړی اکسیداتي ګام کتلېز کوي:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

د وینې پخې سرې حجرې د NADPH لپاره پر دې لارې ډېرې متکي دي، لکه څنګه چې لوزاټو او همکارانو په Blood کې (2020) بیاکتنه کړې ده. NADPH ګلوټاتیون په احیا شوي حالت کې ساتي او حجره له اکسیداتي زیان څخه ژغوري. مېتیلین بلو په دې سیستم کې د الکترون منونکي په توګه برخه اخلي. کافي G6PD کافي NADPH برابروي، چې اغېزمنه احیا رامنځته کوي. ټیټ G6PD دا لړۍ په لومړۍ کړۍ کې ماتوي.

رنګ د سون‌توکو د کچې د ښودونکي په څېر وګڼئ، نه د انجن په څېر. دا د NADPH د موجودیت په اړه خبر ورکوي. هر بل څه چې دا موجودیت یا د پایلې لوستل بدل کړي، کولای شي د جین له بدلون پرته هم شاخص وخوځوي.

د بروور ډوله کړنلاره څنګه ترسره کېږي

د ریجنټونو ترکیبونه د لسیزو په اوږدو کې بدل شوي دي، نو یوه ښوونیزه تشریح باید کلینیکي پروتوکول ونه ګڼل شي. هر لابراتوار خپله تایید شوې معیاري کاري کړنلاره تعقیبوي. له دې احتیاط سره، د ټیوبونو کلاسیک ترتیب په لاندې ډول کار کوي؛ هغه بڼه چې درې ټیوبونه او 3 ساعته انکیوبېشن لري، په دې خپره شوې عملي بېلګه کې مستنده شوې ده:

1. د ناروغ ټیوب: بشپړه وینه له ګلوکوز، سوډیم نایټرایټ او مېتیلین بلو سره. نایټرایټ مېتهیموګلوبین جوړوي، ګلوکوز د سرو حجرو مېتابولیزم ته مواد برابروي، او رنګ پر NADPH متکي لېږدوونکی برابروي.
2. اکسید شوی کنټرول: وینه له نایټرایټ او ګلوکوز سره، خو له مېتیلین بلو پرته. دا د نسواري مېتهیموګلوبین د پای نښه ښيي، یعنې د کمښت بڼه.
3. د هیموګلوبین کنټرول: وینه له اوبو سره. دا د سور هیموګلوبین د پای نښه ښيي، یعنې عادي بڼه.
4. انکیوبېشن وکړئ: ټول ټیوبونه د 37 C په شاوخوا کې، معمولاً د 3 ساعتونو لپاره وساتئ او په نرمۍ یې ګډ کړئ.
5. رقیق کړئ: د هر ټیوب یوه کوچنۍ برخه په مقطرو اوبو کې رقیقه کړئ، څو حجرې ماتې شي او د رنګ پرتله روښانه شي.
6. پرتله کړئ: د ناروغ ټیوب له دواړو کنټرولونو سره پرتله کړئ. د سور رنګ پر لور بېرته تګ د پام وړ احیا کوونکې وړتیا ښيي. د نسواري رنګ پاتې کېدل د څرګند کمښت نښه ده.

په یوه تاریخي ترکیب کې شاوخوا 1 mL وینه له داسې ریجنټونو سره کارول کېده چې غلظتونه یې نږدې 180 mM سوډیم نایټرایټ، 280 mM ډېکستروز او 0.4 mM مېتیلین بلو وو. دا شمېرې د علمي سرچینو د یوې بېلګې په توګه وګڼئ، نه د یوه نړیوال معیار په توګه.

د پایلې لوستل

کیفي سکریننګ د عادي فعالیت د 30 تر 40 سلنې په شاوخوا کې تر ټولو ښه توپیر کوي، لکه څنګه چې د G6PD د موندنې د تشو په اړه د Malaria Journal په دې بیاکتنه کې بحث شوی دی. له همدې امله د سکریننګ عادي پایله دا مانا لري چې ازموینې شدید کمښت نه دی موندلی. دا د بشپړ عادي فعالیت تصدیق نه کوي.

ولې سکریننګ تېروتنه رامنځته کوي

له هیمولیز وروسته رېټیکولوسایتوز د کاذب عادي پایلې کلاسیک لامل دی. ځوانې سرې حجرې او رېټیکولوسایتونه د زړو حجرو په پرتله ډېر G6PD لري. د هیمولیز د یوې حادې پېښې پر مهال ښايي تر ټولو زړې او تر ټولو ډېرې کمښت لرونکې حجرې لا مخکې له منځه تللې وي، او داسې ځوانې حجرې پاتې وي چې فعالیت یې په ازموینه کې عادي ښکاري. همدا بیولوژیک حالت کمیتي ازموینې هم غولوي، نه یوازې د رنګ سکریننګ ازموینې.

د وینې وروستۍ انتقال کمښت پټوي، ځکه د وینې ورکوونکي سرې حجرې نمونې ته خپل انزایم ورزیاتوي. د Mayo Clinic لابراتوارونه د وینې انتقال د رېټیکولوسایتوز او د سپینو حجرو د مداخلې ترڅنګ د انزایم د نه‌باوري پایلو له لاملونو څخه ګڼي.

هېټروزیګوټ ښځې تر ټولو ستونزمنه ډله ده. د X کروموزوم تصادفي غیرفعالېدل د عادي او کمښت لرونکو سرو حجرو یو ګډ ترکیب رامنځته کوي، او ټولیز فعالیت یې له شدید کمښت څخه تر ظاهراً عادي کچې پورې هر ځای واقع کېدای شي. کیفي سکریننګونه په معمول ډول منځني فینوټایپونه نه مومي. د G6PD د ازموینې په اړه د WHO اسناد دا محدودیت په تفصیل څېړي.

د نمونې عمر، د ساتنې تودوخه، د لیدل کېدونکې پای نښې په ارزونه کې شخصي قضاوت، هیماتوکرېټ او د ریجنټونو کیفیت د دې بیولوژیکو اغېزو ترڅنګ تحلیلي ګډوډي هم زیاتوي.

سکریننګ تشخیص نه دی

د سکریننګ هغه پایله چې کمښت، منځنی فعالیت یا له کلینیکي حالت سره ناسموالی ښيي، د G6PD انزایم کمیتي ازموینې ته اړتیا لري. WHO د کنټرول شوې تودوخې کمیتي سپېکټروفوټومیټري د مرجع میتود په توګه ګڼي. په دې ازموینه کې د سرو حجرو هیمولایزېټ ته ګلوکوز-6-فاسفېټ او NADP+ ورکول کېږي، او تولید شوی NADPH په 340 nm کې د رڼا د جذب د زیاتېدو له لارې څارل کېږي. د بدلون چټکتیا د انزایم له فعالیت سره متناسبه ده، او معمولاً د هیموګلوبین پر بنسټ په هر ګرام کې د واحدونو په توګه معیاري کېږي. اوسنۍ کلینیکي لابراتواري کړنې د G6PD د فعالیت لپاره د Mayo د ازموینو د کتلاګ په مدخل کې لنډې شوې دي.

د پایلې تفسیر د لابراتوار تایید شوی مرجع حد کاروي، چې ډېر ځله د وګړو د عادي فعالیت په نسبت بیانېږي؛ کمښت عموماً د 30 سلنې حد ته نږدې او منځنی فعالیت تر هغه پورته بحث کېږي. د G6PD ازموینو لپاره د WHO د موخه‌منو محصولاتو ځانګړنیز پروفایلونه (2022) دا تشخیصي چوکاټ بیانوي. که وروستی هیمولیز یا د وینې انتقال د فینوټایپ ټاکل نه‌باوري کړي، د سرو حجرو د نفوس له بېرته متوازن کېدو وروسته ازموینه تکرار کړئ؛ مالیکولي ازموینه هم اضافي معلومات ورکولای شي، خو د انزایم د اندازه کولو ځای نه نیسي.

یو توپیر چې باید وساتل شي

په دې ازموینو کې مېتیلین بلو له بدن څخه بهر لابراتواري ریجنټ دی. دا حقیقت ناروغ ته د مېتیلین بلو د ورکولو د خوندیتوب له بحث څخه جلا دی، چې د مېتیلین بلو د استعمال د منع مواردو په لارښود کې پوښل شوی دی. بیوکیمیا یې سره نښلوي، ځکه درمل هم پر NADPH متکي احیا پورې تړلي دي، خو په ټیوب کې رنګ د وینې په جریان کې دوز نه دی. د دې لپاره چې پوه شئ دا رنګ په بل چاپېریال کې د رنګولو د مادې په توګه څنګه چلند کوي، د مېتیلین بلو د رنګولو اصول وګورئ؛ او د هغه کیمیاوي کورنۍ لپاره چې دا ورپورې تړاو لري، په لابراتوار کې د اکسایش او احیا رنګونو بحث وګورئ.

سکریننګ پوښتي چې ایا احیا کوونکې وړتیا بشپړه ښکاري. تایید پوښتي چې په حقیقت کې څومره انزایم شته. رنګ لومړۍ پوښتنې ته ښه ځواب ورکوي، په دې شرط چې هېڅوک ترې د دویمې پوښتنې ځواب ونه غواړي.