د مېتیلین بلو د کالیبراسیون منحني جوړول: بلانکونه، محدوده او خطیت

دوه شنونکي د مېتیلین بلو د یوه ذخیره‌يي محلول له بوتل څخه کار اخلي او هر یو د کالیبراسیون منحني جوړوي. لومړی د مختصاتو له مبدا څخه تېرېدونکې مستقیمه کرښه ترلاسه کوي او نامعلومې نمونې په ډاډ اندازه کوي. دویم داسې کرښه ترلاسه کوي چې په لوړه برخه کې کږېږي، له محور سره یې د تقاطع ارزښت صفر ته نه نږدې کېږي او د نمونو پایلې یې له رقیقولو سره بدلېږي. رنګ یو دی، وسیله یوه ده او د څپې اوږدوالی یو دی. توپیر په مهارت کې نه دی. توپیر په طرحه کې دی: په بلانک کې څه شامل وو، کوم غلظتونه ټاکل شوي وو او ایا ازمویل شوې محدوده په هغې سیمې کې پاتې شوې وه چې یو ساده ماډل لا هم پکې معتبر وي.

د کالیبراسیون منحني د وسیلې د غبرګون او غلظت ترمنځ یو تړون دی چې یوازې په هغو شرایطو کې معتبر دی چې پکې جوړه شوې وي. د مېتیلین بلو لپاره دا تړون یوه پېژندل شوې کمزورې نقطه لري. دا رنګ په اوبو کې له خپلو مالیکولونو سره یوځای کېږي، نو د غلظت په بدلېدو سره د رڼا جذبونکې مالیکولي بڼه هم بدلېږي. د دې بدلون له دواړو خواوو څخه جوړه شوې منحني به مستقیمه نه وي او هېڅ اندازه احصایوي شننه یې نه شي سمولای. دا مقاله ښيي چې منحني څنګه داسې طرحه شي چې کرښه یې مانا ولري: سم بلانک غوره کړئ، محدوده د مونومر د واکمنۍ په سیمه کې وساتئ، په رښتینې توګه تکرارونه ترسره کړئ او کږوالی د شور پر ځای د معلوماتو په توګه تفسیر کړئ.

له بلانک څخه پیل وکړئ، نه له معیاري محلولونو

بلانک صفر ټاکي او د مېتیلین بلو لپاره باید له رنګ پرته نور هر څه ولري. د اوبو هماغه درجه، هماغه بفر او pH، هماغه مالګې، د ګډ محلل هماغه برخه او هماغه تودوخه. د کالیبراسیون محلولونه په همدې یو شان ماتریکس کې چمتو کړئ. دلیل یې کیمیاوي دی، نه اداري. مالګه او محلل د مونومر، ډایمر او لوړو تجمعاتو ترمنځ توازن بدلوي، چې د اندازه کولو د څپې په اوږدوالي کې طیف بدلوي. یوازې د اوبو بلانک د ماتریکس له امله د مالیکولي بڼو په وېش کې رامنځته شوی بدلون نه شي اصلاح کولای. په اوبو کې د مېتیلین بلو د طیفونو ټولیزې شننې، چې د خلاص لاسرسي د ثبت له لارې یې لوستلای شئ، د سوډیم کلوراید غلظت له 0 څخه تر 0.15 M پورې بدل کړ، په ځانګړي ډول ځکه چې ایوني ځواک تعادل بدلوي، او له مالګې سره تجمع هم زیات شو.

یوه عملي پایله: هېڅکله په بې‌ایونه اوبو کې کالیبراسیون مه کوئ او بیا په فاسفیټ بفر یا د فاضله اوبو په فلتر شوي محلول کې نمونې مه اندازه کوئ. کله چې له اندازه کېدونکې مادې پاک ماتریکس نه وي، په خپله نمونه کې د معیاري مادې د زیاتولو طریقه تر هغې بهرنۍ منحني غوره ده چې ماتریکس یې برابر نه وي. د اوبنیو ازموینو د اعتبار ساتلو اړوند لارښوونې د ماتریکس او مداخلې په بحث کې شته، او د رنګ د کمّي ازموینو عمومي اصول د ازموینې د طرحې په عمومي کتنه کې بیان شوي دي.

داسې محدوده وټاکئ چې یوه مالیکولي بڼه پکې غالبه وي

د 664 nm شاوخوا د اوږدې څپې په بانډ کې کمّي اندازه کول پر دې فرض ولاړ دي چې ډېری رنګ د مونومر په بڼه دی. په ساده اوبو کې دا فرض یوازې هغه وخت سم وي چې محلولونه رقیق پاتې شي، نږدې د ټیټ مایکرومولار غلظت په سیمه کې. خپاره شوي تجربوي میلانونه دا پوله روښانوي: هغه کالیبراسیونونه چې په 1 cm حجرو کې تر شاوخوا 7 مایکرومولار لاندې ساتل شوي، نږدې 82,000 M-1 cm-1 میلان ورکوي، خو هغه کالیبراسیون چې تر شاوخوا 37 مایکرومولار پورې غځول شوی وي، نږدې 67,100 ته راټیټېږي، ځکه چې د لوړ غلظت معیاري محلولونه لا له وړاندې د پام وړ ډایمر لري. دلته د هر یاد شوي ضریب شرایط د مېتیلین بلو په طیفي مرجع کې ښودل شوي دي، چې د شمېرو د پرتله کولو مناسب ځای دی؛ دا مقاله یې یوازې د محدودې د ټاکلو لپاره کاروي.

د طرحې اصول نېغ په نېغه له همدې څخه راوتلي دي:

1. تر ټولو لوړ معیاري محلول دومره رقیق وساتئ چې د طیف بڼه ثابته وي. د میتود د پراختیا پر مهال، د یوه څپې اوږدوالي د لوستلو پر ځای د هرې کچې لپاره ټوله لیدل کېدونکې محدوده، شاوخوا له 550 څخه تر 750 nm پورې، سکن کړئ. که نورمال شوي طیفونه له غلظت سره بڼه بدلوي، کیمیا بدلېږي او محدوده ډېره پراخه ده.
2. په ټولو کچو کې د 610 nm شاوخوا د جذب او د 665 nm شاوخوا د جذب نسبت تعقیب کړئ. هغه نسبت چې له غلظت سره لوړېږي، دا مانا لري چې د ډایمر د بانډ اوږه وده کوي او د مونومر ماډل نور سم کار نه کوي. دا تشخیصي نښه د تجمع او د غلظت د اغېزو په لارښود کې لا نوره تشریح شوې ده.
3. د ټیټو مایکرومولار غلظتونو د کار لپاره د 1 cm حجره وکاروئ. د نږدې 82,000 میلان په صورت کې، 5 مایکرومولار نږدې 0.41 جذب ورکوي او 10 مایکرومولار شاوخوا 0.82، چې دواړه د ډېرو وسایلو لپاره مناسب دي.
4. د غلیظو ذخیره‌يي محلولونو لپاره، د دې پر ځای چې له 1 څخه ډېر لوړ جذب ومنئ، نوري لاره لنډه کړئ؛ خو په یاد ولرئ چې لنډه لاره نوري اندازه کول سموي، نه کیمیا. تجمع په غلظت پورې تړلی دی، نه د نوري لارې په اوږدوالي، نو غلیظ ذخیره‌يي محلول لا هم د رقیق مونومر د منحني پر ځای داسې جلا چلند ته اړتیا لري چې مالیکولي بڼې یې په پام کې ونیسي.

د دې انځور د لویې برخې بنسټیز ټولیز برازش له 1.1 مایکرومولار څخه تر 3.4 میلیمولار پورې 224 طیفونه رانغاړل او وموندل چې د ټېټرامر سیګنال لا له 34 مایکرومولار لاندې هم د موندلو وړ و. دا موندنه د احتیاط اړتیا روښانوي: خطي محدوده تر هغه تنګه ده چې په لومړي اټکل ښکاري، نو د فرض کولو پر ځای یې تایید کړئ.

کچې، تکرارونه او ترتیب

په درې ټکو ولاړه منحني هېڅ نه ثابتوي. په ICH Q2(R2) کې د اعتبار تایید لارښوونې د خطیت د ارزونې لپاره لږ تر لږه پنځه غلظتونه غواړي، او له شپږو تر اتو غیرصفر کچو پورې یوه لا باوري کاري منحني برابروي، په ځانګړي ډول لوړې برخې ته نږدې چې تجمع پکې پیلېږي. کچې داسې ووېشئ چې د نمونو ټاکل شوې محدوده وپوښي او هلته زیاتې کچې ولري چې د کږوالي احتمال ډېر وي، نه په داسې هندسي لړۍ کې چې یوازې د اسانتیا لپاره ټاکل شوې وي.

هره کچه دوه یا درې ځله اندازه کړئ، خو محلولونه په خپلواکه توګه چمتو کړئ، نه دا چې له یوه فلاسک څخه درې ځله لوستل وکړئ. خپلواک تکرارونه د چمتو کولو تېروتنه څرګندوي؛ د یوه فلاسک تکراري لوستل یوازې د وسیلې شور څرګندوي. د 2020 ټولیزې څېړنې هر محلول درې ځله اندازه کړ، چې لا هم یو مناسب عادي انتخاب دی. د لوستلو ترتیب تصادفي کړئ، څو تدریجي بدلون، د ښیښې پر سطحه جذب یا د تودوخې بدلون ځان د کږوالي په بڼه ونه ښيي. د کوارټز کیوویټ یوې څېړنې وموندله چې په 10 دقیقو کې د 34 مایکرومولار محلول شاوخوا 3 سلنه رنګ پر سطحه جذب شوی و، نو د اندازه کولو په ټول پړاو کې د تماس وخت، کیوویټ، پاکول او ترتیب یو شان وساتئ.

د وضاحت لپاره حل شوې بېلګه (اندازه شوې شمېرې نه دي)

لاندې شمېرې د حساب د ښودلو لپاره جوړې شوې دي. دا لابراتواري اندازې نه دي او باید د مېتیلین بلو د معلوماتو په توګه ونه کارول شي. مهمه خبره د هغو پلټنو بڼه ده چې ورسره ترسره کېږي.

فرض کړئ شپږ معیاري محلولونه په برابر بفر کې، د 1 cm نوري لارې په کارولو، د برابر بلانک په مقابل کې په 665 nm کې لوستل کېږي:

د غلظت په مقابل کې د منځني جذب د مستقیمې کرښې برازش په هر مایکرومولار کې نږدې 0.0805 د جذب واحدونو میلان ورکوي او له محور سره یې د تقاطع ارزښت له صفر څخه یوازې د جذب څو زرمې برخې توپیر لري. د نوري لارې پر اوږدوالي د میلان وېشل هغه په ظاهري جذب ضریب بدلوي: په هر مایکرومولار کې 0.0805 له شاوخوا 80,500 M-1 cm-1 سره برابر دی، چې په اوبو کې د مونومر تر واک لاندې له یوې محدودې سره سمون لري. مهمې پلټنې د R مربع نه دي، ځکه هغه به په هر صورت ډېر ښه ښکاري. مهمې نښې صفر ته نږدې د تقاطع ارزښت، له S2 څخه تر S5 پورې ثابت A610/A665 نسبت او بې‌له کومې منظمې بڼې خپاره پاتې‌شوني دي. په S6 کې د نسبت لږ لوړوالی یوه رښتینې نښه ده چې یا دا کچه لرې کړئ، یا 7 مایکرومولار د دې ماتریکس او وسیلې د ترکیب د موقتي پورتني حد په توګه په نښه کړئ.

که یوه نامعلومه نمونه په عین شرایطو کې 0.245 ولوستل شي، مستقیم بدلېږي: 0.245 چې په هر مایکرومولار کې پر 0.0805 ووېشل شي، د نمونې د رقیقولو د هر ضریب له پلي کولو مخکې شاوخوا 3.0 مایکرومولار ورکوي. پایله له خپلو شرایطو سره راپور کړئ: د څپې اوږدوالی، نوري لاره، د بلانک ماتریکس، د کالیبراسیون محدوده او نېټه.

د کالیبراسیون د ډکولو وړ کاري پاڼه

د هر نوي ماتریکس لپاره دا قالب په لابراتواري ثبت کې کاپي کړئ. یو ماتریکس، یوه پاڼه، یوه منحني.

د ریجنټ د بڼې کتار بې‌دلیله نه دی. سوداګریز مېتیلین بلو ښايي بې‌اوبه مالګه یا یو هایدرېټ، لکه ټرای‌هایدرېټ، وي، او ناسمه مولر کتله د هر نومي غلظت ارزښت بې له څرګندې نښې کږوي. د پیل مادې د خالصوالي او مشخصاتو پلټنې د کیفیت او درجې په لارښود کې بیان شوي دي.

په خپلواک کنټرولي معیاري محلول یې تایید کړئ

د کالیبراسیون منحني باید هېڅکله خپل کار پخپله ونه ارزوي. له برازش وروسته، له جلا تلل شوي ذخیره‌يي محلول څخه یو کنټرولي معیاري محلول د منل شوې محدودې منځ ته نږدې په یوه غلظت کې چمتو کړئ او د نامعلومې نمونې په توګه یې ولولئ. د څو سلنو په دننه کې سمون د چمتو کولو لړۍ تاییدوي؛ نه‌سمون د وسیلې پر ځای ذخیره‌يي محلول یا رقیقولو ته اشاره کوي. کنټرولي معیاري محلول د نمونو له هرې ډلې سره بیا وازمویئ. که دا بدلېږي خو منحني نه بدلېږي، تر دې مخکې چې پر نمونو شک وکړئ، پر کاري محلولونو یا کیوویټ شک وکړئ. دا یو عادت ډېری پټې تېروتنې راڅرګندوي: د هایدرېټ مولر کتله چې د بې‌اوبه مادې لپاره کارول شوې وي، مایکروپیپېټ چې له کالیبراسیون څخه وتلی وي، یا بفر چې په ناسم ایوني ځواک چمتو شوی وي. په کاري پاڼه کې د میلان ترڅنګ د کنټرولي محلول د بېرته ترلاسه شوې اندازې سلنه ثبت کړئ، څو وروسته لوستونکی وویني چې کرښه یوازې رسم شوې نه، بلکې ازمویل شوې هم ده.

د غیرخطیت تفسیر د علت د پېژندلو په توګه

کله چې منحني کږېږي، د ستونزې بڼه یې علت ښيي. په لوړ جذب کې ښکته کږوالی، په داسې حال کې چې طیفي بڼه نه بدلېږي، وسیلې ته اشاره کوي؛ ډېر وخت سرګردانه رڼا د لوړ جذب اندازه تر حقیقي ارزښت ټیټه ښيي. هغه کږوالی چې د 610 nm د اوږې له لوړېدو سره مل وي، کیمیا ته اشاره کوي: ډایمر او لوړ تجمعات د مونومر په پرتله په بېل ډول جذب کوي. هغه بلانک چې صفر نه کېږي، یا هغه معیاري محلولونه چې لوستل یې د وخت په تېرېدو کمېږي، لوښي ته اشاره کوي: د ښیښې یا کیوویټونو پر سطحه جذب، په ځانګړي ډول که د اندازه کولو په لړ کې د تماس وختونه توپیر ولري. او یوه پاکه کرښه چې له ټکو تېرېږي خو بیا هم د نمونو ناسمې پایلې ورکوي، ماتریکس ته اشاره کوي: نمونې د کالیبراسیون له محلولونو سره توپیر لري، نو منحني د نمونې په ماتریکس کې له سره جوړه کړئ یا د معیاري مادې د زیاتولو طریقې ته واوړئ. په هر حالت کې پاتې‌شوني د غلظت په مقابل کې رسم کړئ. تصادفي خپرېدنه د مستقیمې کرښې ماډل ملاتړ کوي؛ د موسکا یا تندي د ګونځې په څېر بڼه یې د R مربع تر هر ټاکلي حد په باوري ډول ردوي، او د اعتبار تایید لارښوونې دا ټکی په څرګنده تاییدوي.

مېتیلین بلو د دې منظم چلند ښه پایله ورکوي. د مونومر بانډ یې پیاوړی دی، کیمیا یې ښه پېژندل شوې ده او د ناکامۍ بڼې یې د شمېرو تر خرابولو مخکې په طیف کې ځان څرګندوي. منحني په تنګه محدوده کې جوړه کړئ، په سمه توګه یې د بلانک پر بنسټ صفر کړئ، خپلواک تکرارونه ترسره کړئ او پرېږدئ چې د طیفونو بڼه د محدودې په ټاکلو کې پرېکړه وکړي. ترلاسه شوې کرښه لنډه ده، خو هر ټکی یې رښتینی دی.

په دې مقاله کې تشریحي محاسبې د میتود د ښودلو لپاره جوړې شوې شمېرې کاروي. اندازه شوي مرجع ضریبونه له بشپړو شرایطو سره په تړل شوې طیفي مرجع کې راغلي دي، او د تجمع بنسټیزه څېړنه په PMID 33251415 کې ثبت شوې ده.