Metiliin buluu DNA fi RNA halluu gochuuf: hojii jeelii fi membraanii

Barataan tokko jeelii agarose elektiroofooresisiin addaan baasa, metiliin buluun halluu godha, garuu bakka sarara ifa ta'e eegaa turetti homaa hin argu. Bakka hojii itti aanu keessatti, qorataan digrii doktorummaatiin booda hojjetu tokko membraanii Northern qaruuraa halluu buluu isuma sanaan halluu godhee daqiiqaa sadii keessatti sararoota riboosoomii ifatti adda ba'an argata. Barataan jeelichi hin milkoofne jedhee murteessa. Jeelichi hin kufne. Hojiileen lamaan adda turan; halluun tokko sunis miira qabummaa adda addaa, halluu duubbee adda addaa, fi seerota hojii itti aanuuf adda addaa ta'aniin deebii kenna.

Halluun DNA metiliin buluu fi RNA metiliin buluun halluu gochuun keemistirii tokko qabu, garuu kaayyoo tokko hin qaban. Jeelii keessatti, halluun hamma asiidii niwuukiliikii caasaa qaawwa qabu keessa jiru agarsiisa. Membraanii irratti, dabarsuun milkaa'uu isaa fi sararoonni saamudaa hamma walqixa ta'een fe'amuu isaanii agarsiisa. Garaagarummaan kun erga ifa ta'ee booda, pirootokoolonni, daangaaleen adda baasanii arguu, fi daangaaleen wal-simannaa ni hubatamu.

Deebii gabaabaa

Metiliin buluun halluu kaatiyoonii caasaa diriiraa qabuudha. Asiիդota niwuukiliikii wajjin hidhoo koovaalentii malee, karaa duubatti deebi'uu danda'uun walitti hidhama. Kunis harkisa elektiroostaatikii fosfeetii irratti, cimdii beezii gidduu seenuu, fi bo'oo xiqqaa DNA wajjin walitti qabamuu walitti makuun ta'a. Duubatti deebi'uu danda'uun kun qabxii ijoodha. Sararoonni halluu godhamanii ifa mul'atuun ilaalamuu, galmeeffamuu, sana booda kloonii uumuu, haayibridaayizeeshinii, ykn piroobii irra deebi'anii fayyadamuuf halluun irraa haqamuu ykn qulqulleeffamuu danda'u.

DNA dachaa jeelii agarose keessatti metiliin buluun halluu gochuuf, qophiin ariifachiisaan istaandaardii metiliin buluu bishaan keessatti 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL), halluu gochuu daqiiqaa 15 fi halluu bishaaniin haquu daqiiqaa 15 dabalataa, achiis saanduqa ifa adii irratti ilaaluudha. Membraaniif, qophiin Northern blot beekamaan halluu 0.02 hanga 0.04 percent soodiyem aseeteetii pH 5.2 naannoo jiru keessatti fayyadama; dabarsuu fi iddoo irratti dhaabuu booda daqiiqaawwan muraasa halluu godhama, sana booda bishaaniin dhiqamee haayibridaayizeeshinii dura halluun guutumaan guutuutti haqama. Miira qabummaan isaa daangeffamaadha: haalota gaarii keessatti sarara jeelii tokkoof nanograms kudhanoota hanga dhibbootaa; qajeelfamoonni of-eeggannoo qaban immoo 0.5 hanga 1 microgram tarreessu. Kun hamma halluuwwan ethidium bromide fi SYBR barbaadan caalaa sadarkaalee hedduun guddaadha. Membraanii irratti daangaan tiraanskiriiptii tokko adda baasanii arguu kan faayidaa qabu hin jiru; sababiin isaas halluun irra caalaa RNA riboosoomii baay'inaan jiru fi waliigala meeshaa fe'ame agarsiisa. Qophii lamaan keessaa tokko keessattiyyuu furmaata dabalata nyaataa daldalaan gurguramu bakka hin buusinaa. Maloonni mirkanaa'an halluu sadarkaa xiinxalaa qabu, baafaroota sirriitti ibsaman, fi bakka RNA itti hirmaatutti qabannaa RNase irraa bilisa ta'e irratti hundaa'u.

Akka walitti hidhamuun hojjetuu fi bakka dogoggorsu

Moodeelli faayidaa qabu kutaalee sadii qaba. Tokkoffaa, sirni qubeelaa chaarjii poozatiivii qabu lafee dugdaa fosfeetii chaarjii negaatiivii qabutti harkifama. Qorannoon ispeektrooskoopii soogiddi xiqqaa ta'etti harkisni elektiroostaatikii kun akka ol'aantummaa qabu argisiisa; moodeelii fi daayinaamiksii molakiyuulii immoo DNA dachaa keessatti beezii gidduu seenuu fi bo'oo xiqqaa irratti hidhamuu akka haalota tasgabbaa'oo ta'anitti agarsiisu. Kun qorannoo ispeektrooskoopii walitti hidhamuu metiliin buluu fi DNA keessatti gabaabfameera. Lammaffaa, filannoon GC irratti muraasni ni jira: moodeelii keessatti tarkaanfiiwwan CpG fi GpC filatamu, yaaliiwwan immoo qorannoo filannoowwan metiliin buluu beezii gidduu seenuu keessatti DNA dachaa GC baay'ee qabu wajjin walitti hidhamuun akka filatamu gabaasu. Garuu DNA dachaa AT qabus ni hidhata. Halluu gochuun idilee tartiiba beezii murtaa'eef addaa miti. Sadaffaa, DNA dachaa tokkoo fi RNA irra caalaa harkisa elektiroostaatikii fi beezii dhaqqabamoo fi naannoowwan dachaa irratti walirra tuulamuun hidhatu. Kanaaf, ciminni halluu dheerina, tartiiba beezii, fi caasaa sadarkaa lammaffaa wajjin ni jijjiirama.

Bu'aawwan lama kana irraa maddu. Hidhamuun koovaalentii waan hin taaneef halluun dhiqamee ba'a. Sararoonni polyacrylamide ta'e jedhamee yoo hin dhaabamne dafanii halluu dhabuu jalqabu. Malli addaa dhaabbataadhaan dhaabuu kan jiruufis halluu gochuun idilee yeroo muraasaaf waan turuufidha; kun Soto fi Draper jeelii PAGE irratti ibsameera. Halluun wanta ifaan kaka'u waan ta'eef, DNA halluu godhame oksijiinii keessatti yeroo dheeraa ifa cimaaf saaxiluun guanine oksideessuu fi dhuma irratti dameewwan DNA muruu danda'a. Adeemsi kun qorannoo oksidaashinii guanine metiliin buluun kaka'u keessatti bal'inaan ibsameera. Ifa adiin yeroo gabaabaa ilaaluun miidhaa UV adeemsa ethidium bromide idilee keessatti beekamu irraa fagaata; faayidaan kunis DNA deebisanii argachuuf dhugumaan jira. Ifni mul'atu miidhaa xiqqaa qaba, garuu miidhaa hin qabne miti. DNA kloonii uumuuf yoo oolu, yeroo ifaan saaxilamu gabaabaa taasisaa. Keemistirii ifaa bal'aa of-eeggannoo kana duuba jiruuf, karaalee lama keemistirii ifaa metiliin buluu keessatti ilaalaa. Cimdii reedoksii fi haalota chaarjii bifa oksideeffame maaliif akka hidhatu, bifa riidyuusii ta'e immoo maaliif akka hin hidhamne ibsaniif, keemistirii caasaa fi amaloota metiliin buluu ilaalaa.

Hojii tokkoffaa: jeelii keessatti halluu gochuu

Jeelii halluu gochuun gaaffii tokkoof deebii kenna: sarara kana keessatti asiidiin niwuukiliikii ijaan mul'achuuf gahaan jiraa? DNA dachaa agarose keessa jiru isa sirriitti qorameedha. Malli jalqabaa metiliin buluun jeelii halluu gochuu Flores fi hiriyoota isaanii pirootokoolii ariifachiisaa 0.02 percent jeelii agarose 1 percent irratti mirkaneessee, sana booda DNA milkaa'inaan deebisanii argachuu fi kloonii uumuu agarsiiseera. Pirootokooliin dhiyeessaa isuma sun fuula oomisha metiliin buluu IBI Scientific irrattis jira; qophii membraanii 0.04 percent fi mala jeelii ariifachiisaa wal bira tarreessa.

Adeemsa hojii qabatamaa:

1. Jeelicha akka idileetti elektiroofooresisiin addaan baasaa. Mala fooyya'eef dabarsuun ykn dandeettiin addaan baasuu yoo hin mirkanoofne, halluu kan gootan elektiroofooresisii booda malee yeroo isaa keessatti miti.
2. Metiliin buluu 0.02 percent w/v bishaan distilii keessatti qophaa'e keessa cuuphaa; suuta sochoosuun daqiiqaa 15 turisaa.
3. Bishaan yeroo hedduu jijjiiruun, waliigalaan daqiiqaa 15, hanga halluun duubbee caasaa jeelichaa hir'atee sararoonni ifatti mul'atanitti halluu irraa haqaa.
4. Meeshaa ifa adii kennu irratti battalumatti suuraa kaasaa.

Agarose fi polyacrylamide amala adda addaa qabu. Agarose caasaa isaa keessatti halluu qabata; kanaaf halluu irraa haquun tarkaanfii suuta adeemuudha. Jeelii polyacrylamide haphii dafanii halluu fudhatu, garuu dafanii halluus dhabu. Kun sarara muranii baasuun saamudaa qopheessuuf gargaara, garuu galmee yeroo dheeraa miidha. Oligoniwuukili'oota nam-tolchee polyacrylamide keessa jiran, mala PAGE akkaataa Current Protocols mirkanaa'e hordofuun, qophii 0.02 percent isuma sanaan daqiiqaa 20 hanga 30 keessatti bishaaniin irra deddeebi'anii dhiqachuun argamuu danda'u. Maloonni baay'ee diluuti ta'an, TBE diluuti keessatti 0.0002 percent naannoo jiran, oligoowwan qopheessuuf sa'aatii hedduuf itti fayyadamuun gabaafameera; garuu ragaan isaanii laafaadha.

Garaagarummaan DNA fi RNA gidduu jiru barbaachisaadha. DNA dachaa walitti hidhamuu caaseffamaa isa cimaa kenna. RNA fi DNA dachaa tokkoos halluu fudhatu, garuu laafaa fi tilmaamuuf rakkisaa ta'een. Jeelii RNA formaldehyde agarose irratti, laaboraatooriiwwan baay'een jeelii keessatti halluu buluu gochuu dhiisanii RNA dura gara membraaniitti dabarsu, achiis achitti halluu godhu. Tarkaanfiin kun mallattoo jeelii laafaa ta'e mallattoo membraanii ifatti adda ba'uu fi galmee fe'iinsaatiin bakka buusa.

Hojii lammaffaa: membraanii irratti halluu gochuu

Membraanii halluu gochuun gaaffii biraaf deebii kenna: dabarsuun milkaa'eeraa, sararoonnis walbira qabamuuf mijatuu? Fayyadamni beekamaan halluu Northern blot duubatti deebi'uu danda'u kan Herrin fi Schmidt ti. Jalqabarratti halluu 0.04 percent soodiyem aseeteetii 50 mM pH 5.0 keessatti daqiiqaa 2 hanga 3 fayyadamuun, bishaaniin dhiqachuun, haayibridaayizeeshinii dura immoo SDS diluuti SSPE keessatti qophaa'een halluu haquun ture.

Malli ammayyaa bal'inaan itti fayyadaman akka armaan gadiitti adeema:

1. RNA ykn DNA caasaan dachaa isaa hiikame gara nylon ykn nitrocellulose dabarsaa; achiis saamudaan yeroo halluu gochuutti akka hin badne hidhoo qaxxaamuraa UV ykn ho'isaan iddoo irratti dhaabaa.
2. Dirqama miti, garuu baay'inaan ni raawwatama: membraanicha asiidii aseetikii 5 percent keessatti daqiiqaa 15 jiisaa.
3. Metiliin buluu 0.02 hanga 0.04 percent soodiyem aseeteetii 0.3 hanga 0.5 M pH 5.2 naannoo jiru keessatti daqiiqaa 5 hanga 10 halluu godhaa.
4. Bishaaniin dhiqaa, daqiiqaa 5 hanga 15 halluu irraa haqaa, galmeessaa, achiis haayibridaayizeeshinii dura halluu hafe balleessaa.

Nylon chaarjii poozatiivii qabu hojii Northern keessatti baay'inaan fayyadama. Nitrocellulose illee adeemsa asiidii aseetikii fi aseeteetii isuma sanaan ni hojjeta. Suuraan dabarsuu mirkaneessuuf, sararoota 28S fi 18S (ykn RNA baakteeriyaaf 23S fi 16S) walbira qabuuf, ladders fi istaandaardota irratti mallattoo gochuuf, fi galmee tilmaamaa waliigala RNA sadarkaa walqixxaatetti sirreessuu eeguuf fayyada. Maloonni Northern maxxanfaman hamma sararoota riboosoomii halluu godhamanii madaaluun fe'iinsa sakatta'u; kunis hojii saayinsii aannanii keessatti sararooota riboosoomii metiliin buluun halluu godhaman sadarkaa walqixxaatetti sirreessuuf fayyadame dabalata. Membraanii Southern haala wal fakkaatuun mul'isuun ni danda'ama, garuu halluun kun fe'iinsa fi dabarsuu Northern sakatta'uuf baay'ee caalaa beekamaadha. DNA Southern dabarsuu dura caasaan dachaa isaa waan hiikamuuf lakkoofsi miira qabummaa jeelii isa irratti hin hojjetu.

Daangaalee adda baasanii arguu fi halluu duubbee: bakka halluun buluun dadhabu

Walbira qabuun armaan gadii ta'e jedhamee tilmaamaan dhiyaate. Hojii halluu irratti dhibbeentaan jeelii, bal'inni sararaa, meeshaan optiksii, fi sirriitti halluu haquun dhiibbaa qabu. Lakkoofsa tokkoon tokkoon akka sadarkaa hammaatti fudhadhaa malee akka ibsa teeknikaa murtaa'aatti miti.

To'annoon halluu duubbee mallattoon hamma daangeffamaa qabu fayyadamuuf mijachuu isaa murteessa. Halluun bilisa ta'e halluu cimaa qaba; kanaaf garaagarummaan mul'ataa halluu hidhame osoo hin balleessin kan hin hidhamne balleessuun argama. Halluun cunqina guddaa qabu miira qabummaa dabaluun isaa muraasa. Irra caalaa yeroo halluu haquu dheeressa. Jeelii, membraanii, fi kaameraa sana irratti tartiiba diluushinii gaggeessaa; daangaa itti ciminni mallattoo walitti ida'ame hamma galfame wajjin walmadaalu qofa fayyadamaa. Metiliin buluun fe'iinsa hammaan tilmaamaan sadarkaa walqixxaatetti sirreessuuf ni gargaara. Garuu dandeettiin membraanii, gahumsi dabarsuu, guutamuu, fi halluu haquun sarara irraa gara sararaatti waan jijjiiramaniif, madaallii hammaa daangaa bal'aa qabu miti.

Daangaalee wal-simannaa: halluu gochuu booda maaltu itti fufa

Halluu buluu gochuu booda kloonii uumuun agarsiifameera. Flores fi hiriyoonni isaanii sararoota agarose halluu godhaman muranii baasan, DNA deebisanii argatan, achiis walitti hidhuun seelii keessa galchan. Ethidium bromide fi UV fayyadamuun booda kan argame caalaa kloonii uumuun fooyya'aa akka ta'e gabaasan. Sababni malu miidhaa ifaa xiqqaa ta'uu isaati malee faayidaa halluun mataan isaa kennu miti. Ifa adiif saaxilamuu gabaabaa taasisaa; DNA deebisanii argatanis qulqulleessuu idilee jeelii keessaa DNA baasuu keessa dabarsaa.

PCR fi sekuwensii gochuuf ragaan jiru xiqqaadha. Halluun hafe asiidota niwuukiliikii wajjin waan hidhatuuf, tarkaanfiiwwan inzaayimii dura halluu haqaa fi qulqulleessaa. DNA jeelii buluu irraa sirriitti qulqulleeffame akka hojjetu eegama; garuu polimereesonnii fi keemistiriiwwan sekuwensii adda addaa hamma halluu hafee waliin ce'u dandamachuu isaanii sirriitti hin madaalamne. Akka dandamatanitti hin fudhatinaa.

Haayibridaayizeeshiniin blot tartiibni kun ciminaan yoo eegame wal-sima: dabarsuu, iddoo irratti dhaabuu, halluu gochuu, galmeessuu, halluu haquu, haayibridaayizeeshinii. Tartiibni kun qindaa'ina Herrin fi Schmidt ti. Dabarsuu dura halluu gochuun, ykn halluu haquu dhiisuun, mala biraati; mirkaneessa mataa isaa barbaada. Halluu balleessuu booda, piroobii haquu fi piroobii irra deebi'anii fayyadamuu istaandaardii akka idileetti itti fufu. Maatii halluu isuma sanaan sadarkaa seelii irratti halluu gochuu fi mala filimii dhaabame irratti hojjetu maaliif mala seelii lubbuun jiru irratti akka hin hojjenneef, aatlaasii halluu gochuu maaykirooskoopii ilaalaa.

Mala dhaabbataadhaan dhaabuu irraa yoo fagaatame, sarara muranii baasuun agarose saamudaa deebisanii argachuuf qophaa'ee fi oligoowwan PAGE halluu buluun iddoo isaanii beekamaniif ni hojjeta. Halluu haquu booda elektirooelushiniin baasuun walitti hidhaa duubatti deebi'uu danda'uuf keemistiriidhaan ni mala; garuu daataan bu'aa to'atamee metiliin buluuf adda ta'e muraasa. Elushinii booda soogidda irraa baasaa ykn gadi qubsiisaa.

Rakkoolee irra deddeebi'an

Sararoonni jeelii halluu laafaa qaban yeroo baay'ee halluu karaa halluu mul'atuun adda baasuuf hammi saamudaa gahaa akka hin taane agarsiisu, keessumaa saamudaa gabaabaa dachaa tokkoo ykn RNA irratti. Hamma dabalataa fe'aa, halluu haaraa fayyadamaa, cunqina guddisuu dura yeroo halluu gochuu dheeressaa, halluu haquus dursitanii dhaabaa. Jeeliin guutumaan buluu ta'ee garaagarummaa hin agarsiisne yeroo baay'ee garmalee halluu gochuu ykn bishaan yeroo gahaa jijjiiruu dhabuu agarsiisa. Sararoonni PAGE halluu dhabuun keemistirii eegamuudha malee halluu gochuun kufuu miti. Dafaa suuraa kaasaa. Halluun duubbee membraanii walqixa hin taane dacha'uu, bubbee qilleensaa, asxaa qubaa, sochoosuu walqixa hin taane, ykn dabarsuu bakka bakkaatti hanqate agarsiisa. To'annoo haayibridaayizeeshinii malee kana akka fe'iinsa walqixa hin taaneetti hin hiikinaa. Bifni sararoota riboosoomii laafaa fi faca'aa ta'e manca'uu agarsiisuu danda'a; garuu dabarsuu hin xumuramne, waliigala RNA xiqqaa ta'e (sararooota idilee keessatti micrograms muraasaa hanga kudhanootaa fe'ama), ykn garmalee halluu haquu irraa ta'uus danda'a. Halluun RNA riboosoomii baay'inaan jiru agarsiisa. Tiraanskiriiptii murtaa'e hin agarsiisu. Hojiin sun kan piroobiiti.

Nageenya fi qabannaa himannaa daangaa darbe malee

Metiliin buluu qabachuun ethidium bromide caalaa salphaadha, garuu miidhaa hin qabne miti. Waraqaan daataa nageenyaa yeroo ammaa MilliporeSigma halluu kana akka summii cimaa karaa afaanii Ramaddii 4, yoo liqimfame miidhaa geessisuutti ramada. Akka SDS metiliin buluu Sigma-Aldrich jedhutti, karaa balfa balleessuu hayyamameen gatamuu qaba. Ethidium bromide akeekkachiisa miidhaa jenetikii cimaa qaba; kunis SDS ethidium bromide Sigma-Aldrich keessatti dhiibbaa seelota wal-hormaataa irratti shakkamu dabalata. Jeelii fi furmaatonni isaas, akka qajeelfama halluu asiidii niwuukiliikii Thermo Fisher keessatti ibsametti, yeroo baay'ee akka balfa keemikaalaa balaa qabuutti addaan qabamu. Lamaaniifuu SDS fi seerota dhaabbataa hordofaa. Halluu gogaa cimsitanii cufuun gogaa eegaa, halluu hojii irra jiru akka pirootokooliin hayyamu qofa irra deebi'aa fayyadamaa, membraanii halluu godhaman waraqaa filtaraa gidduutti gogaan kuusaa, sararoonni faca'anii baduu dura jeelii suuraa kaasaa.

Hima gabatee hojii kana yaadadhaa. Jeeliiwwan fe'iinsa guddaa keessatti ifa adiin mul'achuu qoratu. Membraaniin piroobiin hojii miira qabummaa guddaa barbaadu hojjechuu dura dabarsuu fi fe'iinsa qorata. Halluun tokko miira qabummaa daangeffamaa, walitti hidhamuu duubatti deebi'uu danda'u, fi tartiiba hojii cimaa ta'een lamaaniifuu tajaajila.