Dhiibbaa buluu meetiliinii maayitookondiriyaa irratti qabu safaruu: oksijiinii, ATP, fi pooteenshaalii membireenii

Laaboraatooriin tokko buluu meetiliinii maayitookondiriyaa hargansuun isaanii gufate keessatti dabalee fayyadamni oksijiinii akka dabalu arga haa jennu. Himni salphaatti barreeffamu halluun sun hojii maayitookondiriyaa deebisee sirreesse kan jedhuudha. Himni sun dogoggora ta'uu danda'a. Yaa'iinsi oksijiinii, oomishni ATP, fi pooteenshaaliin membireenii yaad-rimeewwan adda addaa sadiidha. Isaan orgaanelii tokko qooddatu; akkuma kuusaan duub-deebii, walsimsiisni, fi qooduun galmee duumessaa tokko qooddatan: walitti dhufeenya qabu, garuu seerota adda addaatiin bulu. Tokko isa kaaniin yoo wal makte, safartuun hundi gama teeknikaatiin sirrii ta'us hiikni dogoggora ta'a.

Buluun meetiliinii sirna inni safaru keessatti waan hirmaatuuf walmakaan kun akka uumamu taasisa. Inni wanta marsaa redooksii keessa deddeebi'ee, jalqaba karaa irratti elektiroonota fudhatee gara dhuma karaatti kennuudha; kaatiyoonii cooma jaallatu kan maayitookondiriyaa anniisaa qaban keessatti kuufamuudha; akkasumas kompaawundii halluu buluu cimaa qabu kan daangaawwan ifaa piroobonni beekamoon itti hojjetan keessatti ifa xuuxuu fi maddisiisuudha. Safartuun tokko qofti ba'aa kana hunda baachuu hin danda'u. Mala amanamaan, qorannoowwan maayitookondiriyaa Budapest keessatti mul'ate, yaa'iinsa oksijiinii dabalataan saffisa oomisha ATP, pooteenshaalii membireenii, fi gadi lakkifama haayidiroojiinii peerooksaayidii safaruudha; sadarkaa hunda irrattis to'annoowwan halluu sanaaf adda ta'an fayyadamuudha.

Safartuun hargansuu yaa'iinsa oksijiinii safara malee oomisha anniisaa miti

Safartuun hargansuu dandeettii adda baasuu olaanaa qabu, Oroboros Oxygraph yookaan xiinxalaa yaa'iinsa seelii alaa Seahorse fayyadamuun haa ta'u, waan tokko qofa gabaasa: oksijiiniin saffisa hammamiitiin elektiroonota fudhachaa akka jiru. Elektiroonii tokkoof pirootoononni meeqa akka dabarfaman, garaagarummaan hammam akka eegame, yookaan inzaayimiin ATP synthase akka isa fayyadame hin gabaasu.

Jechoonni itti fayyadamnu barbaachisoodha. Maayitookondiriyaa adda baafaman keessatti, sabistireetiin ADP malee hargansuu dhimmuu kenna; sabistireetiin ADP hamma quubsaa qabu waliin dandeettii foosforileeshinii oksideetivii kenna; taayitireeshiniin wanta walitti hidhamiinsa addaan kutuu immoo dandeettii dabarsa elektiroonii olaanaa kenna. Seelota guutuu keessatti wantoonni Seahorse kanaan walgitan hargansuu bu'uuraa, hargansuu ATP waliin hidhata qabu kan oligomycin irratti jijjiiramu, dhimmuu pirootoonii, hargansuu olaanaa FCCP'n murtaa'u, fi fayyadama oksijiinii maayitookondiriyaa hin taane kan rotenone fi antimycin dandamatuudha. Bu'aawwan Seahorse “State 3” fi “State 4” jechuun waamuun sirrummaa qophii sanaan hin deeggaramne liqeeffachuu dha; kunis bu'uura Mito Stress Test kan Agilent keessatti ifatti mul'ata.

Buluun meetiliinii walitti dhufeenya salphaatti tilmaamamu kan oksijiinii dabalataa fi anniisaa dabalataa gidduu jiru diiga. Maayitookondiriyaa sammuu guinea pig adda baafaman keessatti, halluun 100 nM hanga 1 uM fayyadama oksijiinii yeroo boqonnaa sabistireetota glutamate fi malate, succinate, fi alpha-glycerophosphate waliin dabale; alpha-glycerophosphate irratti daballiin kun gara dhibbeentaa 64 ture. Garuu, akka qorannoo maayitookondiriyaa sammuu adda baafamanii ibsutti, hargansuun ADP'n kakaafame maayitookondiriyaa fayyaa keessatti jechuun ni danda'ama hin jijjiiramne. Dhimmuun waan dabaleef, yaa'iinsi ADP'n kakaafame immoo akkuma jirutti waan hafeef, reeshiyoon to'annoo hargansuu herregamu ni hir'ata. Hir'inni sun halluun maayitookondiriyaa miidhe jechuu miti. Halluun hargansuu idilee irratti marsaa redooksii oksijiinii fayyadamu dabale jechuu dha. Qorannoon fayyadama oksijiinii buluu meetiliinii daballii qofa gabaasu keemistirii dhugaa safareera, garuu waa'ee eegumsa anniisaa homaa hin jenne.

Yaaliiwwan hojii deebisanii fooyyessuu garaagarummaa kana sadarkaa guddaattis agarsiisu. Complex I yeroo uggurame, yaa'iinsi oksijiinii gara dachaa sadiitti deebi'e, oomishni ATP garuu gara dachaa 1.5 qofatti deebi'e. Oksijiiniin baay'een elektiroodii gahe. Garuu keessaa hammi xiqqaan oomisha ATP'f gumaache. Himannaan foosforileeshiniin oksideetivii fooyya'e jedhu kamiyyuu ragaa ATP barbaada; filatamaadhaan reeshiyoo ATP oksijiinii tokkoof argamuun ibsamuu qaba, waliigalteen qoodduu reeshiyoo sanaaf fayyadames ibsamuu qaba.

Qorannoowwan ATP saffisa oomishaa safaru; hammi kuufame bakka isaa bu'uu hin danda'u

Qorannoon ATP gaaffii adda ta'e deebisa: yeroo yuunitii tokko keessatti ATP hammamtu oomishama? Safartuun jijjiirama yeroo hordofu, ibsa ifaa luciferase ilbiisa ibiddaatiin daqiiqaa hedduu hordofamu yookaan qorannoo walitti hidhame kan hexokinase fi glucose-6-phosphate dehydrogenase 340 nm irratti dubbifamu, saffisa kenna. Safartuun ATP waliigalaa yeroo xumuraa tokko irratti fudhatamu hamma kuufame kenna; kun oomisha irraa fayyadama hir'isuun argama, kophaa isaattis waa'ee foosforileeshinii oksideetivii odeeffannoo xiqqoo qofa kenna.

Gareen Budapest mala inzaayimii walitti hidhame, adenylate kinase ukkaamsuun, fayyadame; buluun meetiliinii 1 hanga 2 uM ta'e maayitookondiriyaa rotenone fi antimycin'n yaalaman keessatti oomisha ATP hamma xiqqaa garuu hiika istaatistikii qabuun akka dabalu argate. Sun hojii deebisanii fooyyessuu dhugaa dha, garuu gartokkee qofa. Qorannoon summummaa TEGDMA moodeela adda ta'e keessattis deebii bifa wal fakkaatu argate: moonomeriin yaala ilkaanii TEGDMA 5 mM ta'e hargansuu Complex I waliin hidhata qabu gara yuunitii yaa'iinsaa 286 irraa gara 28tti gadi buuse; halluun 2 uM immoo gara 86tti deebise.

Kompaawundii redooksii halluu qabu waliin to'annoowwan lama dhiisuun hin danda'amu. Tokkoffaa, oligomycin fayyadamuun oomisha ATP safarame keessaa hammamtu ATP synthase irratti akka hundaa'u mirkaneessi. Lammaffaa, seelota malee ATP hammi isaa beekamu, rijaantii guutuu, fi cunqina halluu yaalii keessatti fayyadame sana dabaluun, hammi dabalame hammam akka deebi'ee safaramu qoradhu; yoo xiqqaate 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, fi 2 uM fayyadami. Halluun ifa maddisiifame xuuxuu, inzaayimii mallattoo kennu ugguruu, yookaan keemistirii redooksii rijaantii jijjiiruu danda'a; qajeelfamni qorannoo luciferase waliigalaas gosa gufuu kanaaf qorannoowwan baayookeemikaalaa dabalataa gorsa. Dhaamsuun ifaa yeroo baay'ee cunqina olaanaa irratti waan hammaatuuf qofa, 1 uM dogoggora safartuu irraa bilisa dha jettee hin tilmaamin.

Piroobonni pooteenshaalii membireenii raabsama halluu safaru malee yaa'iinsa miti

Safranine O, TMRM fi TMRE, rhodamine 123, fi JC-1 hundi kaatiyoonota membireenii keessa darbuu danda'anidha. Isaan madaallii elektirookeemikaalaa hordofuun maatriksii chaarjii negaatiivii qabu keessatti kuufamu; kanaaf filooriseensiin waliigalaa pooteenshaalii karaa piroobiin eessa akka jiruutiin al-kallattiin gabaasa. Isaan keessaa tokko illee ATP yookaan yaa'iinsa elektiroonii hin safaru.

Piroobiin tokkoon tokkoon qophii isaaf caalaatti malu qaba. Safranine O maayitookondiriyaa adda baafamanii fi seelota membireeniin isaanii akka wantoonni keessa darban taasifameef mijata; yeroo baay'ee cunqinni isaa gara 2 uM, kaka'umsi gara 495 nm, fi maddisiisni ifaa gara 585 nm ta'a. Inni haala dhaamsuu ifaa keessatti hojjeta; seenuun isaa filooriseensii waliigalaa jijjiira. TMRM fi TMRE seelota guutuuf, baay'ina nanomolarii gadi aanaa keessatti, haala ifni hin dhaamne keessatti mijatu. Haala kana keessatti depoolaarizeeshiniin halluu gadi lakkisiisa, filooriseensiin maayitookondiriyaas ni hir'ata; baay'ina olaanaa irratti garuu dhaamsuu ifaa ofii isaatiin kallattiin mallattoo garagaluu danda'a. JC-1 reeshiyoo magariisaa gara diimaa mijataa ta'e kenna, garuu baay'ina itti dabalamee fi hamma maayitookondiriyaa irratti hundaa'a; kanaaf hojii hamma lakkoofsaan murteessuuf TMRM sirriitti to'atame caalaa dadhabaa dha. Filannoowwan bu'aa fi hanqina kana sakatta'a piroobota pooteenshaalii membireenii maayitookondiriyaa bal'inaan fayyadaman keessatti cuunfamaniiru.

Buluun meetiliinii cunqina hojii keessatti fayyadaman sanatti sirriitti karaa ifaatiin gufuu uuma. Daangaawwan xuuxinsa isaa gara 600 hanga 665 nm jiran maddisiisa ifaa piroobota diimaa waliin walirra bu'u; kanaaf dhiibbaawwan calaltuu keessaa, dhaamsuun ifaa, fi xuuxinsi ifa kaka'umsa kennu hundi uumamuu danda'u. Halluun sun kaatiyoonii cooma jaallatu lammaffaa dha; raabsamni isaa mataan isaayyuu pooteenshaalii safaramaa jiru waliin jijjiirama. Ittisni isaa safartuuwwan wal deeggaran fi to'annoowwan duwwaa dha: piroobii qofa, halluu qofa, piroobii cunqina halluu tokkoon tokkoon waliin, depoolaarizeeshinii guutuu FCCP'n taasifame akka wabii zeerootti, fi yoo danda'ame piroobii lammaffaa amala ifaa adda qabu. Qorannoon Complex III bira darbuu uggura antimycin fi myxothiazol booda deebifama pooteenshaalii membireenii safranine O fi TMRM lamaanuun irra deebi'ee safaree, fooyya'iinsa bifa wal fakkaatu argachuun fakkeenya kana kaa'e. Mallattoon ifaa tokko akeeka dha. Mallattoowwan walaba ta'an lama ragaa dha.

Qophiiwwan sadii, gaaffilee adda addaa sadii

Maayitookondiriyaan adda baafaman, seelonni membireeniin isaanii akka wantoonni keessa darban taasifame, fi seelonni guutuun qindaa'inoota miira-qabeessummaa qorannoo tokkoo bakka walii bu'uu danda'an miti. Isaan yaad-rimeewwan adda addaa, qajeeltoowwan hojii adda addaa qabanidha.

Maayitookondiriyaan adda baafaman sansalata dabarsa elektiroonii, membireenii keessaa, fi sirna hojii maatriksii eegu; membireenii pilaasmaa, saayitoosoolii, fi caasaa neetworkii garuu ni balleessu. Kaayyoonis balleessuu sana: sabistireetonni, ADP, uggurtoonni, fi cunqinni halluu sirriitti murtaa'u; kanaaf karaa hojii tokko adda baasuun ni danda'ama. Hanqinni isaa dhiyeessii sabistireetii uumamaa, dabarsa mallattoo, fi fedhii anniisaa dhabuudha.

Seelonni membireeniin isaanii akka wantoonni keessa darban taasifame maayitookondiriyaa caasaa seelii isaanii hedduu keessatti tursiisu; sabistireetota alaa fi ADP garuu membireenii pilaasmaa baname keessa akka darban hayyamu. Isaan hanqina karaa sabistireetii tokkoo haala seelii keessatti adda baasuuf meeshaa sirrii dha. Membireenii garmalee banachuun membireenii alaa miidha; to'annoon saayitoosoolii keessaas dhiqamee ni bada.

Seelonni guutuun waan hunda eegu: danqaa membireenii pilaasmaa, wantoota saayitoosoolii keessaa elektiroonota kennan, geejjiba sabistireetii keessaa, neetworkii maayitookondiriyaa, fi fedhii ATP. Isaan fiiziyooloojii wajjin baay'ee walitti dhihaatu, mala hojii gadi-fagoo irraa immoo fagaatu; sababiin isaas seenuun, elektiroonota fudhachuun, fi bakka tokko keessatti kuufamuun halluu hundi hamma halluu maayitookondiriyaa bira gahee hojjetu murteessu.

Qorannoon TEGDMA sadarkaalee sadan kaayyoodhaan fayyadame: maayitookondiriyaa sammuu adda baafaman oksideeshinii fi pooteenshaalii halluudhaan deebisanii fooyyessuuf; seelota bu'uuraa paalpii ilkaanii membireeniin isaanii akka wantoonni keessa darban taasifame, irra caalaa hanqinni sun oksideeshinii sabistireetii Complex I waliin hidhata qabu irratti akka jiru adda baasuuf; fi seelota bu'uuraa guutuu dhiibbaa fiiziyooloojii waliigalaa halluu 2 uM fayyadama oksijiinii ukkaamfame irratti qabu safaruuf. Dubbistoota safartuuwwan maayitookondiriyaa qophiiwwan adda addaa gidduutti wal bira qabaniif, ibsi dabalataa akka buluun meetiliinii elektiroonota sansalata hargansuu keessa sochoosu ibsu seenaa duubaa karaa sanaa kenna; qajeelfamni qorannoowwan hargansuu buluu meetiliinii dubbisuuf qophaa'e immoo yaada hamma fayyadamee fi uggurtoota ibsa.

To'annoowwan halluun redooksii keessatti socho'u barbaadu

Wanti marsaa redooksii keessa deddeebi'u ugguraa idilee caalaa tarree to'annoo dheeraa barbaada; sababni isaas keemistiriin halluu qofti gocha baayooloojii fakkeessuu danda'a.

Safartuu hargansuuf, jijjiirama suuta uumamu adda baasuuf kutaa baafarii qofa qabu, kutaa baafarii fi halluu qabu garuu meeshaa baayooloojii hin qabne, halluu wanta elektiroonota kennu kan seelii alaa qorannoo keessatti argamu kamiyyuu waliin, fi seelota guutuu keessatti fayyadama oksijiinii maayitookondiriyaa hin taane adda baasuuf rotenone fi antimycin xumura irratti fayyadami. Halluun elektiroonota fudhate, elektiroonota oksijiiniif dabarseen haayidiroojiinii peerooksaayidii uumuudhaan, irra deebi'ee akka oksideeffamu hubadhu. Kanaaf to'annoon duwwaan halluu qofa qabu garuu kennituu elektiroonii hin qabne, NADH yookaan NADPH argamuun booda fayyadama oksijiinii seelota malee uumamu gadi xiqqeessee safara.

Haayidiroojiinii peerooksaayidiif, halluuwwan DCFDA filannoo addaa hin qabne caalaa Amplex UltraRed safartuun isaa sirreeffame fi horseradish peroxidase filadhu; catalase'n mirkaneessi; halluun ifaan kakaafamu waan ta'eef, bu'aan ifa irratti akka hundaa'u qoradhu. Qorannoon maayitookondiriyaa sammuu halluu 100 nM qofa irratti ba'aan peerooksaayidii dachaa afur caalaa akka dabale, balleessuun isaa immoo akka suuta ta'e argate. Peerooksaayidiin halluu elektiroonota fudhate irraa kallattiin uumame, superoxide akka sadarkaa gidduutti osoo hin uumamin. Bal'inaan filannoo piroobii fi to'annoowwan ifaa ilaaluuf barreeffama dabalataa yaaliiwwan halluu keessatti gosoota oksijiinii walnyaatinsa qaban safaruu irratti argama; gaaffiin bal'aan peerooksaayidiin yoom akka mallattootti, yoom immoo akka ba'aatti hojjetu madaallii redooksii seelii fi himannoowwan farra oksideeshinii waliin ibsameera.

Himannoowwan karaa hojii ilaalaniif, iddoowwan ugguraa Complex III lamaanuu qoradhu: antimycin A iddoo Qi irratti fi myxothiazol iddoo Qo irratti; dabalataanis xumura Complex IV cyanide'n qoradhu. Qorannoon sammuu hantuutaa duraanii halluun hargansuu rotenone'n uggurame akka deebisee fooyyesse, kan antimycin'n uggurame garuu akka hin fooyyessine gabaase. Qorannoon gosa bineensotaa sadii irratti booda taasifame immoo uggurtoota lamaanuu waliin fooyya'iinsa gartokkee fi ragaa cytochrome c kallattiin elektiroonota fudhachuu argate. Karaa bira darbuu sana akka ragaa haaraa wajjin walsimutti ilaali malee akka waan murtaa'eetti hin fudhatin; cunqinni halluu, iddoon ugguraa, haalli sabistireetii, fi raabsamni halluu hundi karaa mul'atu jijjiiru.

Gabatee filannoo qorannoo

Gabatee kana fayyadamuun safartuu gaaffii irraa filadhu; gaaffii safartuu irraa hin filatin.

Himannaan amansiisaan yoo xiqqaate cunqina halluu walfakkaatan, 100 nM, 300 nM, 1 uM, fi 2 uM, safartuuwwan kana hunda keessatti fayyadama: yaa'iinsa oksijiinii haala dhimmuu, ADP, oligomycin, fi wanta walitti hidhamiinsa addaan kutu jalatti; saffisa oomisha ATP; pooteenshaalii membireenii, filatamaadhaan piroobota lama fayyadamuun; fi gadi lakkifama peerooksaayidii safartuun isaa sirreeffame, catalase fi to'annoowwan seelota hin qabne waliin. Tuuta walitti hidhame gabaasi: yaa'iinsa oksijiinii dabalataan saffisa ATP, ATP oksijiinii tokkoof argamu, pooteenshaalii, fi peerooksaayidii. Lakkoofsi kana keessaa kamiyyuu kophaa isaa safartuu hiika barbaadaa jiruudha.