न्यु मिथिलिन ब्लु र रेटिकुलोसाइट रङ्गाइ: छुट्टै रङ्ग र जीवित कोषमा प्रयोग गरिने विधि

एक विद्यार्थीले रेटिकुलोसाइट गणनाको तयारी गर्छन्, मिथिलिन ब्लु मगाउँछन्, त्यसलाई रगतसँग मिसाउँछन् र लगभग केही पनि देख्दैनन्। उनका सहपाठीले न्यु मिथिलिन ब्लु लेखिएको बोतल प्रयोग गर्छन् र केही रातो रक्तकोषभित्र स्पष्ट निला तन्तुहरू देख्छन्। पहिलो विद्यार्थीले दोस्रो बोतलको रङ्ग अझ ताजा वा बढी सान्द्र भएको अनुमान गर्छन्। तर यी दुवै अनुमान सही होइनन्। त्यसमा फरक अणु हुन्छ।

यस क्षेत्रमा हुने अधिकांश अन्योलको मूलमा यही अवधारणागत त्रुटि छ। नामले न्यु मिथिलिन ब्लु भनेको मिथिलिन ब्लुकै सुधारिएको ब्याच हो भन्ने आभास दिन्छ। तर रसायनशास्त्रले अर्कै कुरा बताउँछ। न्यु मिथिलिन ब्लु N एउटा छुट्टै फेनोथायाजिन रङ्ग हो, जसको आफ्नै Colour Index नम्बर, आफ्नै प्रतिस्थापन ढाँचा र रक्तविज्ञानमा आफ्नै मानकीकृत भूमिका छ। यो भिन्नता स्पष्ट भएपछि विधिका बाँकी पक्षहरू—रङ्गाउँदा कोषहरू किन जीवित हुनुपर्छ, कुन कोषलाई रेटिकुलोसाइट मानिन्छ, हाइन्ज बडीको भूमिका के हो र ब्रिलियन्ट क्रेसिल ब्लु कहिले प्रयोग हुन्छ—सजिलै बुझ्न सकिन्छ।

छोटो उत्तर

रक्तविज्ञानमा प्रयोग गरिने अभिकर्मक न्यु मिथिलिन ब्लु N लाई सामान्यतः न्यु मिथिलिन ब्लुको PubChem अभिलेखमा Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, सूत्र C18H22ClN3S का रूपमा चिनाइन्छ। साधारण मिथिलिन ब्लुलाई यसको PubChem अभिलेखमा मिथिलथायोनिनियम क्लोराइड, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, सूत्र C16H18ClN3S का रूपमा चिनाइन्छ। संरचनात्मक रूपमा, न्यु मिथिलिन ब्लुमा वलयमा जोडिएका दुई मिथिल समूह र एथिलअमिनो पार्श्व शृङ्खलाहरू हुन्छन्, जबकि मिथिलिन ब्लुमा डाइमिथिलअमिनो समूहहरू हुन्छन्। यही भिन्नताले रङ्गाइको व्यवहार बदल्छ। रक्तविज्ञानका पाठ्यपुस्तकहरूले साधारण मिथिलिन ब्लुलाई रेटिकुलोसाइट रङ्गाउन तुलनात्मक रूपमा कमजोर रङ्ग र न्यु मिथिलिन ब्लुलाई गाढा तथा बढी समान रङ्गाइ दिने रङ्गका रूपमा वर्णन गर्छन्। यो तुलना न्यु मिथिलिन ब्लुबारे ScienceDirect को विषयगत पृष्ठमा सारांशमा प्रस्तुत गरिएको छ।

हो, न्यु मिथिलिन ब्लु सुप्रावाइटल रङ्ग हो। सुप्रावाइटल रङ्गाइ भनेको शरीरबाट निकालिसकेपछि र स्थिरीकरण गर्नुअघि जीवित कोषहरू रङ्गाउनु हो, जसको परिभाषा सुप्रावाइटल रङ्गाइका सिद्धान्तबारे NCBI को समीक्षामा दिइएको छ। न्यु मिथिलिन ब्लु र ब्रिलियन्ट क्रेसिल ब्लु दुवै यस श्रेणीमा पर्छन्, र CLSI को रेटिकुलोसाइट मानकले न्यु मिथिलिन ब्लुलाई स्पष्ट रूपमा सुप्रावाइटल रङ्गका रूपमा समेट्छ। विद्यार्थीहरूले कहिलेकाहीँ यसलाई स्थिरीकृत पातला तहहरूको रोमानोव्स्की रङ्गाइसँग एउटै श्रेणीमा राख्छन्। तर त्यो बुझाइ यहाँ लागू हुँदैन। पहिले स्थिरीकरण गरेमा यो विधिले काम गर्न छोड्छ।

मिल्दाजुल्दा रङ्गका नामहरू बुझ्न खोज्ने पाठकहरूका लागि, मिथिल ब्लु र मिथिलिन ब्लुको तुलना ले ऋणायनिक ट्राइएरिलमिथेन रङ्ग र धनायनिक फेनोथायाजिन परिवारबीचको अर्को, अझ ठूलो अन्योल समेट्छ। प्रयोगशालामा रङ्गाइको सिंहावलोकन ले स्थिरीकृत पातला तहका विधिहरूको सन्दर्भमा सुप्रावाइटल कामको स्थान देखाउँछ, र रक्तकोषको आकारिकीसम्बन्धी मार्गदर्शिकाले व्यापक विभेदक गणनामा रेटिकुलोसाइट मूल्याङ्कन कहाँ पर्छ भन्ने देखाउँछ।

सूचीपत्रबारे एउटा सावधानी: न्यु मिथिलिन ब्लुको छुट्टै जिङ्क क्लोराइड द्विलवण स्वरूप CAS 6586-05-6 अन्तर्गत पाइन्छ। त्यसैले विधि खण्डमा प्रचलित नाम मात्र नभई लवणको स्वरूप र आपूर्तिकर्ताको नाम पनि उल्लेख गर्नुपर्छ।

सुप्रावाइटल रङ्गाइले वास्तवमा के गर्छ

रेटिकुलोसाइट एउटा युवा रातो रक्तकोष हो, जसले आफ्नो केन्द्रक गुमाइसकेको हुन्छ तर अवशिष्ट राइबोसोमल RNA राखेको हुन्छ। रङ्ग नगरिएको भिजेको नमुनामा त्यो RNA देखिँदैन। सुप्रावाइटल रङ्ग जीवित कोषभित्र प्रवेश गर्छ र त्यस RNA लाई निला कण तथा तन्तुका रूपमा अवक्षेपित वा एकत्रित गर्छ। यही तेल-इमर्सनमा देखिने जालो-जस्तो तन्तुमय पदार्थ हो। त्यसैले यो जालो रङ्गाइबाट बनेको संरचना हो, रङ्गको पर्खाइमा रहेको पहिल्यै बनेको ढाँचा होइन। यही कारणले कार्यविधिका चरहरू—रङ्गको सान्द्रता, बफर, रगत र रङ्गको अनुपात, तापक्रम र समय—रङ्गको नामजत्तिकै महत्त्वपूर्ण हुन्छन्।

व्यावहारिक रूपमा यसको अर्थ कामको क्रम कडाइका साथ पालना गर्नु हो: पहिले जम्न नदिइएको रगतलाई रङ्गसँग मिसाउने, इन्क्युबेट गर्ने, त्यसपछि पातला तह बनाउने र स्थिरीकरण तथा प्रतिरङ्गाइ नगरी जाँच्ने। रङ्गाउनुअघि स्थिरीकरण गरेमा, वा फिक्का तन्तुहरू छोप्ने प्रतिरङ्ग प्रयोग गरेमा, गणना निर्भर रहने जानकारी नष्ट हुन्छ।

न्यु मिथिलिन ब्लुसँग प्रयोग गर्न सकिने रेटिकुलोसाइट कार्यविधि

एउटै सर्वमान्य मिश्रण छैन, त्यसैले प्रयोग गरिएको मिश्रण उल्लेख गर्नुहोस्। अभिलेखित तीन फरक विधिले यसको विविधता देखाउँछन्।

परम्परागत ब्रेचर प्रकारको प्रक्रियामा पोटासियम अक्सालेटसँग लगभग 0.5 percent न्यु मिथिलिन ब्लु प्रयोग गरिन्छ। यसलाई राम्ररी मिसाइएको EDTA रगतसँग बराबर आयतनमा मिसाएर कोठाको तापक्रममा करिब 10 देखि 15 minutes इन्क्युबेट गरिन्छ। बिस्तारै फेरि मिसाएपछि पातला पच्चराकार तह बनाइन्छ, हावामा सुकाइन्छ र स्थिरीकरण नगरी 100x तेल-इमर्सन अब्जेक्टिभले जाँचिन्छ। रेटिकुलोसाइट गणनाका लागि NCBI को प्रक्रियाले यो कार्यप्रवाह र यससँग प्रयोग हुने गणना क्षेत्रको वर्णन गर्छ।

डेसी र लुइस विधिमा साइट्रेट सलाइनमा 1.0 percent न्यु मिथिलिन ब्लु प्रयोग गरिन्छ। त्यसमा रङ्गको आयतनको 2 देखि 4 गुणा रगत मिसाएर पातलो तह बनाउनुअघि 37 C मा 15 देखि 20 minutes राखिन्छ। CLSI H44 प्रक्रियाको हालैको सामञ्जस्यीकरण कार्यान्वयनमा pH 7.4 को फस्फेट-बफरयुक्त सलाइनमा अझ कम सान्द्रताको 0.1 percent घोल प्रयोग गरिएको थियो। त्यसमा 20 C मा 10 minutes इन्क्युबेसन गरियो र स्थिरीकरण गरिएन, जसको विवरण 2026 को NMB सामञ्जस्यीकरण अध्ययनमा दिइएको छ।

गणनाका नियमहरू सबै विधिमा समान छन्। कुनै कोषभित्र निलो रङ्ग लागेका कम्तीमा दुई छुट्टाछुट्टै कण वा तन्तुका खण्ड भएमा त्यसलाई रेटिकुलोसाइट मान्नुहोस्। यसले एक्लो रङ्गको निक्षेपलाई गणनाबाट हटाउँछ। नियमित काममा कम्तीमा 1,000 रातो रक्तकोष गन्नुहोस् र रेटिकुलोसाइटलाई प्रतिशतका रूपमा रिपोर्ट गर्नुहोस्। प्रतिशत कम हुँदा सांख्यिकीय रूपमा अझ धेरै कोष गन्नुपर्छ। CLSI H44 विधिको समीक्षाले रेटिकुलोसाइट करिब 1 percent हुँदा गणनाको परिवर्तनशीलतालाई 5 percent मा ल्याउन लगभग 4,400 कोष आवश्यक पर्ने उल्लेख गर्छ; यो De Gruyter मा रहेको CLSI H44 समीक्षामा प्रस्तुत गरिएको छ। मिलर अक्युलर डिस्कले धेरै कोषको गणनालाई व्यावहारिक बनाउँछ। रङ्ग छान्नुहोस् वा ताजा तयार गर्नुहोस्, किनकि अवक्षेप दानेदार अन्तर्वस्तुजस्तै देखिन्छ।

उही नमुनामा हाइन्ज बडी

उही सुप्रावाइटल पातलो तहले हाइन्ज बडी पनि देखाउन सक्छ। यी अवशिष्ट RNA नभई अक्सिकृत र विकृत हेमोग्लोबिनका समूह हुन्। न्यु मिथिलिन ब्लुका नमुनामा ती गोलाकार पिण्डका रूपमा देखिन्छन्, प्रायः एउटै र झिल्लीको नजिक हुन्छन्, र जालो-जस्तो तन्तुमय पदार्थभन्दा हल्का निलो रङ्गिन्छन्। स्थिरीकरण र प्रतिरङ्गाइपछि तिनको दृश्यता राम्रोसँग कायम रहँदैन, त्यसैले स्थिरीकरण नगरिएको पातलो तह जाँच्नुहोस्। हालैको एउटा कार्यविधिमा 20 microliters EDTA रगतसँग 20 microliters 1 percent न्यु मिथिलिन ब्लु मिसाएर 15 minutes इन्क्युबेसन गरिएको थियो र 250 रातो रक्तकोषमध्ये हाइन्ज बडी भएका कोषको संख्या निर्धारण गरिएको थियो। यो उक्त प्रक्रिया रिपोर्ट गर्ने PMC अध्ययनमा वर्णित छ।

दुई भिन्नता बुझ्दा गलत व्याख्या रोक्न सकिन्छ। पहिलो, मिथिल भायोलेट र क्रिस्टल भायोलेटले न्यु मिथिलिन ब्लुभन्दा हाइन्ज बडीलाई बढी गाढा रङ्गाउँछन्, जसको उल्लेख हाइन्ज बडीबारे ScienceDirect को विषयगत पृष्ठमा छ। रेटिकुलोसाइट र हाइन्ज बडीको एकसाथ मूल्याङ्कन गर्दा न्यु मिथिलिन ब्लु सुविधाजनक विकल्प हो, तर हाइन्ज बडीकै लागि सबैभन्दा गाढा रङ्गाइ दिने विशेष रङ्ग होइन। दोस्रो, अल्फा थालासेमिया ट्रेटमा HbH अन्तर्वस्तुहरूले सुप्रावाइटल रङ्गाइपछि कोषभरि धेरै साना थोप्ला बनाउँछन्, जबकि परम्परागत हाइन्ज बडीहरू कम संख्यामा, ठूला र प्रायः झिल्लीसँग सम्बन्धित हुन्छन्। रङ्गको निक्षेप तेस्रो मिल्दोजुल्दो दृश्य हो: यो कोषहरूको फोकल समतलभन्दा बाहिर हुन्छ र अवलोकन क्षेत्रअनुसार फरक हुन्छ।

ब्रिलियन्ट क्रेसिल ब्लु र न्यु मिथिलिन ब्लुको तुलना

दुवै रङ्ग रेटिकुलोसाइटका लागि सुप्रावाइटल रङ्ग हुन्, तर मानकीकरणमा एउटालाई प्राथमिकता दिइन्छ। इन्टरनेसनल काउन्सिल फर स्ट्यान्डर्डाइजेसन इन हेमाटोलोजीसँग संयुक्त रूपमा विकास गरिएको र CLSI H44 मानक पृष्ठमा सूचीबद्ध CLSI H44-A2 रेटिकुलोसाइट विधिले EDTA रगतलाई न्यु मिथिलिन ब्लुले रङ्गाउने प्रक्रियालाई हस्तचालित तुलनात्मक विधिका रूपमा तोकेको छ। परम्परागत रक्तविज्ञान शिक्षामा पनि दृश्य परिणामबारे सहमति छ: न्यु मिथिलिन ब्लुले तन्तुहरूलाई अझ गाढा र बढी समान रूपमा रङ्गाउँछ, जबकि ब्रिलियन्ट क्रेसिल ब्लुको रङ्गाइमा ब्याच र नमुनाबीच बढी भिन्नता हुन्छ।

तर यस मान्यतासँग एउटा सीमा पनि बुझ्नुपर्छ। ICSH विश्लेषक मूल्याङ्कन निर्देशिकाले हस्तचालित न्यु मिथिलिन ब्लु सूक्ष्मदर्शनलाई सन्दर्भ तुलनात्मक पद्धतिका रूपमा स्वीकार गर्छ, तर यसलाई व्यक्तिपरक र तुलनात्मक रूपमा कम परिशुद्ध भन्छ। उपलब्ध भएमा फ्लो साइटोमेट्रीमा आधारित सन्दर्भ प्रक्रियालाई प्राथमिकता दिइन्छ। 2022 मा 100 नमुनाको तुलना गर्दा, अध्ययनमा प्रयोग गरिएको विश्लेषकको तुलनामा न्यु मिथिलिन ब्लुभन्दा ब्रिलियन्ट क्रेसिल ब्लुमा कम व्यवस्थित विचलन पाइयो। यो रङ्गाइ विधिहरूको PMC तुलनामा रिपोर्ट गरिएको छ। विद्यार्थीहरूका लागि प्रमाणसम्मत सार यस्तो छ: न्यु मिथिलिन ब्लुलाई मानकीकृत हस्तचालित तुलनात्मक विधिका रूपमा प्रयोग गर्नुहोस्, कुनै पनि स्थानीय ब्रिलियन्ट क्रेसिल ब्लु विधिलाई त्यससँग वा स्वचालित विधिसँग तुलना गरेर प्रमाणित गर्नुहोस्, र जुनसुकै रङ्ग प्रयोग गरे पनि हस्तचालित सूक्ष्मदर्शनबाट परिणाममा बढी फैलावट आउने अपेक्षा राख्नुहोस्। पुरानो मानकीकरण साहित्यले व्यावसायिक रङ्गका ब्याचहरू फरक हुने भएकाले शुद्धीकृत Azure B लाई रासायनिक रूपमा अझ शुद्ध विकल्पका रूपमा पनि समर्थन गरेको थियो। यसको विवरण Azure B सम्बन्धी मार्शलको अध्ययनमा छ, जसले विधिसम्बन्धी छलफलमा अभिकर्मकको शुद्धता स्तर अझै किन उल्लेख हुन्छ भन्ने स्पष्ट गर्छ।

सामान्य त्रुटिहरूबाट बच्ने

नमुना तयारी असफल हुने अधिकांश घटनाका पछाडि चार गल्ती हुन्छन्। न्यु मिथिलिन ब्लु N को सट्टा साधारण मिथिलिन ब्लु मगाउँदा कमजोर रङ्गाइ हुन्छ; यसको कारण प्रविधि होइन, रासायनिक भिन्नता हो। अवलोकन गर्नुअघि स्थिरीकरण वा प्रतिरङ्गाइ गर्दा सुप्रावाइटल संकेत हट्छ। रङ्गको अवक्षेपलाई कण मानेर गन्दा परिणाम अनावश्यक रूपमा बढ्छ, जसलाई दुई कणको नियम र छानिएको रङ्गले रोक्छ। रेटिकुलोसाइटको प्रतिशत कम हुँदा धेरै थोरै कोष गन्दा परिशुद्ध देखिने तर फराकिला विश्वास सीमाहरू भएको संख्या प्राप्त हुन्छ। हरेक त्रुटिको साझा लक्षण एउटै हुन्छ: अभिकर्मक प्रयोगको चरणमै तय भएको परिणामका लागि सूक्ष्मदर्शक प्रयोगकर्ताले सूक्ष्मदर्शकलाई दोष दिन्छन्।