मेथिलिन ब्लूको सरल रङ्गाइ र ग्राम रङ्गाइ: प्रत्येक विधिले के प्रमाणित गर्न सक्छ

एक विद्यार्थीले E. coli भनेर लेबल गरिएको कल्चरबाट स्मियर तयार गर्छन्, त्यसलाई एक मिनेटसम्म मेथिलिन ब्लूले ढाक्छन्, पखाल्छन् र तेल इमर्सन लेन्सबाट हेर्छन्। दृश्य क्षेत्रमा नीला दण्डाकार कोशिकाहरू देखिन्छन्। प्रयोगशाला प्रतिवेदनमा लेखिन्छ: "ग्राम-ऋणात्मक दण्डाकार ब्याक्टेरियालाई E. coli भनेर पहिचान गरियो।" अवलोकन सही छ। तर त्यो स्लाइडले उक्त निष्कर्षलाई पुष्टि गर्दैन।

त्रुटि प्राविधिक होइन, अवधारणात्मक हो। विद्यार्थीले सरल रङ्गाइलाई विभेदक परीक्षणजस्तै ठाने। सरल रङ्गाइ र ग्राम रङ्गाइले फरक प्रश्नको उत्तर दिन्छन्, किनभने तिनमा रङ्गाइका फरक अवधारणाहरू समावेश छन्। एउटाले सोध्छ: कुन आकार उपस्थित छ। अर्कोले सोध्छ: परीक्षणको अवस्थामा कोशिका भित्ताले कस्तो व्यवहार गर्छ। यी दुईलाई एउटै ठान्दा सही तरिकाले रङ्गाइएको स्लाइडबाट पनि आधारहीन प्रतिवेदन तयार हुन्छ।

यो तुलनाले यी दुई विधिलाई छुट्टाछुट्टै राख्छ, प्रत्येक नतिजाका आधारमा के भन्न मिल्छ भन्ने देखाउँछ, र विद्यार्थीले सबैभन्दा धेरै सोध्ने दुई प्रश्नको उत्तर दिन्छ: ग्राम रङ्गाइमा मेथिलिन ब्लू प्रयोग गर्न सकिन्छ कि सकिँदैन, र E. coli को मेथिलिन ब्लू रङ्गाइले वास्तवमा के देखाउँछ।

छोटो उत्तर

मेथिलिन ब्लूको सरल रङ्गाइले रङ लाग्न सक्ने सबै कोशिकालाई एउटै नीलो रङ दिन्छ। त्यसैले यसले आकृति (दण्डाकार, गोलाकार, सर्पिलाकार) र विन्यास (एकल, जोडी, शृङ्खला) देखाउँछ, तर ग्राम वर्गबारे केही बताउँदैन। ग्राम रङ्गाइमा आयोडिन, रङ हटाउने चरण र प्रतिरङ्ग थपिन्छन्। त्यसैले कोशिकाको आवरणले रञ्जक कसरी कायम राख्छ भन्ने आधारमा ब्याक्टेरियालाई ग्राम-धनात्मक (बैजनी) र ग्राम-ऋणात्मक (गुलाबी वा रातो) मा छुट्याइन्छ। मेथिलिन ब्लूपछि देखिएका नीला दण्डाकार कोशिकाको अर्थ "दण्डाकार कोशिकाहरू उपस्थित छन्" हो। पूर्ण ग्राम प्रक्रियापछि देखिएका गुलाबी दण्डाकार कोशिकाको अर्थ "ग्राम-ऋणात्मक दण्डाकार कोशिकाहरू उपस्थित छन्" हो। दोस्रो कथनको आधार बलियो छ, किनभने प्रक्रियाले थप एउटा परीक्षण गरेको छ।

यो लेख सम्बन्धित रहेको एउटै रञ्जक प्रयोग गर्ने ब्याक्टेरियासम्बन्धी विधिहरूको विस्तृत समूहका लागि सूक्ष्मदर्शी रङ्गाइ एटलस हेर्नुहोस्।

सरल रङ्गाइ: एउटा रञ्जक, एउटा प्रश्न

मेथिलिन ब्लू एक क्षारीय (धनायनिक) रञ्जक हो। यसको रङयुक्त आयनमा धनात्मक आवेश हुन्छ र यसले न्यूक्लिक एसिड तथा सतहका अम्लीय समूहलगायत कोशिकाका ऋणात्मक आवेश भएका संरचनामा बाँधिन्छ। त्यसैले फिका पृष्ठभूमिमा कोशिकाहरू नीला देखिन्छन्। OpenStax ले आफ्नो रङ्गाइसम्बन्धी अध्यायमा यस धनात्मक रङ्गाइ सिद्धान्तको वर्णन गरेको छ। रञ्जकको धनायन आफैँ सानो, समतल फेनोथायाजिन आयन हो, जसको विवरण मेथिलिन ब्लूको रसायनसम्बन्धी सन्दर्भ मा दिइएको छ; क्लोराइड प्रतिआयनले रङ दिने काम गर्दैन।

प्रचलित शिक्षण कार्यविधि जानाजानी सरल राखिएको हुन्छ: पातलो स्मियर बनाउने, हावामा सुकाउने, तापद्वारा स्थिर गर्ने, लगभग एक मिनेटसम्म करिब 1% जलीय मेथिलिन ब्लूले ढाक्ने, पानीले बिस्तारै पखाल्ने, सोस्ने कागजले सुकाउने र तेल इमर्सनमा जाँच गर्ने। LibreTexts को शिक्षण कार्यविधिले ठ्याक्कै यही 1% र एक मिनेटको विधि दिएको छ, साथै केही प्रयोगशालाले समय बढाउने उल्लेख गरेको छ। न रङ स्थिर गराउने अभिकर्मक, न रङ हटाउने अभिकर्मक, न दोस्रो रञ्जक। तिनको अनुपस्थिति नै मुख्य कुरा हो। एउटै रञ्जक हुँदा र छनोटपूर्ण रूपमा रङ नहटाइँदा, रञ्जक बाँधिने हरेक कोशिका अन्ततः एउटै रङको हुन्छ।

E. coli मा अपेक्षित दृश्य क्षेत्र एकल, जोडी वा साना समूहमा रहेका नीला दण्डाकार कोशिका (ब्यासिली) हो। नीलो रङ रञ्जकबाट आउँछ। दण्डाकार रूप जीवबाट आउँछ। तर यी दुईको संयोजनले जीवको पहिचान गर्दैन, किनभने धेरै प्रजाति दण्डाकार हुन्छन् र सरल रङ्गाइमा धेरै दण्डाकार कोशिका नीला देखिन्छन्। ATCC ले आफ्नो सूक्ष्मजीवविज्ञान कल्चर मार्गदर्शिकामा आकृतिसम्म मात्र सीमित हुने यस कुरालाई स्पष्ट गरेको छ। सही प्रतिवेदनमा लेखिन्छ: "नीला ब्यासिली देखिए।" आकार र विन्यासभन्दा परको कुनै पनि निष्कर्षका लागि थप प्रमाण चाहिन्छ।

ग्राम रङ्गाइ: चार अभिकर्मक, एउटा व्यवहार परीक्षण

ग्राम रङ्गाइ एक विभेदक रङ्गाइ हो। यसले सबै कोशिकालाई एउटै क्रमबाट गुजार्छ र कुन कोशिकाले पहिलो रञ्जक कायम राख्छन् तथा कुनले गुमाउँछन् भन्ने हेर्छ। American Society for Microbiology का ग्राम रङ्गाइ कार्यविधिहरूले प्रचलित चार चरणको क्रम परिभाषित गर्छन्: क्रिस्टल भायोलेट (प्राथमिक रञ्जक), ग्राम आयोडिन (रङ स्थिर गराउने अभिकर्मक), अल्कोहल वा एसीटोन-अल्कोहल (रङ हटाउने अभिकर्मक), त्यसपछि सफ्रानिन (प्रतिरञ्जक)।

प्रचलित शिक्षण मोडेलले यस भिन्नतालाई कोशिका आवरणको संरचनाबाट व्याख्या गर्छ। ग्राम-धनात्मक कोशिकामा बाक्लो पेप्टिडोग्लाइक्यान भित्ता हुन्छ, जुन अल्कोहलले पखाल्दा निर्जलीकृत हुन्छ र क्रिस्टल भायोलेट–आयोडिन सङ्कुल कायम राख्छ। ग्राम-ऋणात्मक कोशिकामा पातलो पेप्टिडोग्लाइक्यान तहसँगै लिपिडयुक्त बाहिरी झिल्ली हुन्छ। रङ हटाउने अभिकर्मकले त्यो झिल्ली बिथोल्छ, जसले गर्दा सङ्कुल पखालिएर निस्कन्छ र त्यसपछि कोशिकाले सफ्रानिन ग्रहण गर्छन्। NCBI Bookshelf को ग्राम रङ्गाइ समीक्षाले कोशिका भित्ताको यो व्याख्या दिएको छ। विशेषज्ञहरूका अनुसार यसको पूर्ण भौतिक-रसायन केवल भित्ताको मोटाइभन्दा जटिल छ, तर प्रयोगशालामा नतिजा व्याख्या गर्न व्यवहारसम्बन्धी यो नियम लागू हुन्छ: बैजनीको अर्थ रङ कायम रह्यो, गुलाबीको अर्थ पहिलो रङ हट्यो र त्यसपछि प्रतिरङ लाग्यो।

उदाहरणात्मक चित्रहरू। विधि तुलनाका लागि शैलीबद्ध रेखाचित्र हुन्, क्यामेराले खिचेका सूक्ष्मदर्शी तस्बिर होइनन्। तर्क बुझाउन रङहरू सरल बनाइएका छन्: सरल रङ्गाइमा एउटा रङ, ग्राम प्रक्रियामा रङ हटाएपछि दुईवटा रङ।

ग्राम रङ्गाइमा मेथिलिन ब्लू प्रयोग गर्न सकिन्छ

यस प्रश्नका दुई अर्थ छन्, र तिनका उत्तर पनि फरक छन्।

पहिलो अर्थ: मेथिलिन ब्लूले एक पटक ढाक्नुले सम्पूर्ण ग्राम प्रक्रियाको ठाउँ लिन सक्छ कि सक्दैन। सक्दैन। आयोडिन, रङ हटाउने अभिकर्मक र प्रतिरञ्जकबिना कुनै विभेदक चरण हुँदैन, त्यसैले कुनै ग्राम वर्गको परीक्षण हुँदैन। मेथिलिन ब्लू मात्र प्रयोग गरेपछि देखिएको नीलो दृश्य क्षेत्र सरल रङ्गाइको नतिजा हो, चाहे त्यसको बोतल ग्राम अभिकर्मकहरूको छेउमै किन नराखिएको होस्। यसलाई ग्राम नतिजा भनेर अभिलेख नगर्नुहोस्।

दोस्रो अर्थ: चरण 4 मा प्रतिरञ्जकका रूपमा मेथिलिन ब्लूले सफ्रानिनको ठाउँ लिन सक्छ कि सक्दैन। कार्यात्मक रूपमा यसले रङ हटाइएका कोशिकालाई रङ दिन सक्छ, र पाठ्यपुस्तकको अभ्यासले यस्तो सट्टापछि ग्राम-धनात्मक कोशिका बैजनी र ग्राम-ऋणात्मक कोशिका नीला हुने अनुमान गर्छ। यो तर्क सही छ, किनभने सही तरिकाले रङ हटाइएका ग्राम-ऋणात्मक कोशिका लगभग रङहीन हुन्छन् र अर्को धनायनिक रञ्जक ग्रहण गर्छन्। तर यो प्रचलित कार्यविधि होइन। ASM का कार्यविधिहरूले सफ्रानिन निर्दिष्ट गर्छन्, र केही रूपान्तरमा बेसिक फुक्सिनजस्ता मान्य विकल्प छन्, मेथिलिन ब्लू होइन। यसको व्यावहारिक बेफाइदा पनि छ: बैजनीसँग गुलाबी छुट्याउनुभन्दा बैजनीसँग नीलो छुट्याउन गाह्रो हुन्छ, विशेष गरी शुरुआतीहरूका लागि र सूक्ष्मदर्शीका बत्तीहरू मधुरा हुँदा। पाठ्यकार्य र महत्त्वपूर्ण कुनै पनि नतिजाका लागि आफ्नो कार्यविधिले तोकेको प्रतिरञ्जक, सामान्यतया सफ्रानिन, प्रयोग गर्नुहोस्। मेथिलिन ब्लू प्रतिरञ्जकलाई समान स्तरको मानक विधि नभई प्रदर्शनका लागि प्रयोग गरिने रूपान्तर मान्नुहोस्।

मेथिलिन ब्लू अन्य एकल-रञ्जक विकल्पसँग कसरी तुलना हुन्छ भन्ने सम्बन्धित प्रश्न सरल ब्याक्टेरियल रङ्गाइहरूको तुलनामा समेटिएको छ।

E. coli को मेथिलिन ब्लू रङ्गाइले के प्रमाणित गर्छ, र के गर्दैन

E. coli ग्राम-ऋणात्मक दण्डाकार ब्याक्टेरिया हो, तर यो वाक्यले विभिन्न विधिबाट प्राप्त तथ्यहरू जोड्छ: आकृति सूक्ष्मदर्शी परीक्षणबाट, ग्राम प्रतिक्रिया ग्राम रङ्गाइबाट, र पहिचान कल्चरका साथै जैवरासायनिक वा आणविक परीक्षणबाट। मेथिलिन ब्लू स्मियरले पहिलो अंशमा मात्र योगदान दिन्छ। यसले रङ्गाइएको नमुनामा दण्डाकार कोशिकाहरू उपस्थित छन् र तिनको विन्यास कस्तो छ भन्ने स्थापित गर्छ। यसले ग्राम प्रतिक्रिया स्थापित गर्दैन, किनभने रङ हटाउने परीक्षण गरिएको थिएन। यसले प्रजाति पहिचान गर्दैन, किनभने यस स्तरको विभेदन क्षमतामा धेरै प्रजातिका दण्डाकार कोशिका उस्तै देखिन्छन्।

यही ठाउँमा प्रतिवेदनहरू अनुमान गर्न सकिने ढङ्गले गलत हुन्छन्। लेखकले पृष्ठभूमिको ज्ञान ("यो कल्चर E. coli हुनुपर्ने हो, र E. coli ग्राम-ऋणात्मक हुन्छ") अवलोकनको पङ्क्तिमा मिसाउँछन्। फलतः वास्तवमा अनुमान गरिएको कुरालाई स्लाइडले पुष्टि गरेको जस्तो देखिन्छ। अझ स्पष्ट प्रतिवेदनले यी तहहरू छुट्याउँछ: "मेथिलिन ब्लूको सरल रङ्गाइ: नीला ब्यासिली देखिए; आकृति मात्र, कुनै ग्राम वर्ग परीक्षण गरिएको छैन।" त्यसपछि, यदि नियन्त्रण नमुनासहित सही तरिकाले ग्राम रङ्गाइ गरिएको छ भने: "ग्राम रङ्गाइ: गुलाबी दण्डाकार कोशिका, ग्राम-ऋणात्मकसँग मेल खाने।" प्रजातिको पहिचान पछि पहिचानसम्बन्धी कार्यप्रवाहबाट आउँछ, रङबाट मात्र होइन।

व्याख्याका लागि व्यावहारिक मार्गदर्शिका

प्रयोगशालामा यो निर्णय नियम प्रयोग गर्नुहोस्। यदि सबै कोशिका एउटै रङका छन् र कार्यविधिमा रङ हटाउने अभिकर्मकबिना एउटै रञ्जक प्रयोग गरिएको छ भने, तपाईंले सरल रङ्गाइ गर्नुभएको हो। आकार, अनुमानित नाप र विन्यास लेख्नुहोस्। त्यहीँ रोकिनुहोस्। यदि कार्यविधिमा ज्ञात धनात्मक र ऋणात्मक नियन्त्रण नमुनासहित क्रिस्टल भायोलेट, आयोडिन, रङ हटाउने अभिकर्मक र प्रतिरञ्जक प्रयोग गरिएको छ भने, तपाईंले ग्राम रङ्गाइ गर्नुभएको हो। रङसँगै आकृति लेख्नुहोस्: शृङ्खलामा रहेका बैजनी कोक्काइ, गुलाबी दण्डाकार कोशिका आदि।

अधिकांश भ्रमका पछाडि तीनवटा गल्ती हुन्छन्। पहिलो, नीला दण्डाकार कोशिकालाई E. coli को पुष्टि मान्नु। दोस्रो, नोटबुकमा मेथिलिन ब्लू स्लाइडलाई "ग्राम रङ्गाइ" शीर्षकअन्तर्गत लेख्नु, जसलाई पछिका पाठकले गलत अर्थ लगाउनेछन्। तेस्रो, प्रतिरञ्जकहरू जथाभावी बदल्नु र त्यसपछि प्रयोगशालाहरूबीच रङ तुलना गर्दा सबैमा उही रङहरू प्रयोग भएजस्तो मान्नु। प्रत्येक गल्तीको समाधान एउटै छ: वास्तवमा गरिएको विधिको नाम लेख्नुहोस्, र त्यस विधिले परीक्षण गर्ने कुरा मात्र दाबी गर्नुहोस्।

सरल रङ्गाइको महत्त्व ठ्याक्कै यसैले छ कि यसले थोरै कुरा मात्र दाबी गर्छ। यो छिटो हुन्छ, साना प्रक्रियागत भिन्नताप्रति कम संवेदनशील हुन्छ, र प्रश्न आकृतिसम्बन्धी हुँदा पर्याप्त हुन्छ: त्यहाँ केही छ कि छैन, र त्यसको आकार कस्तो छ। प्रश्न वर्गीकरणको हो भने विभेदक परीक्षण गर्नुहोस्। नीलो स्लाइडले कोशिकाहरू कस्ता देखिन्छन् भन्ने बताउँछ। बैजनी वा गुलाबी स्लाइडले तिनका भित्ताले कस्तो व्यवहार गर्छन् भन्ने बताउँछ। कुनै पनि स्लाइडले एक्लै प्रजाति बताउँदैन।