मेथिलिन ब्लुका प्रयोगहरूमा प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरूको मापन

दुई प्रयोगशालाले आफूले मेथिलिन ब्लुको एन्टिअक्सिडेन्ट प्रयोग भनेको परीक्षण सञ्चालन गर्छन्। एउटाले यो रञ्जकले प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू घटाउँछ भन्ने नतिजा दिन्छ। अर्कोले यसले तिनलाई उत्पन्न गर्छ भन्ने नतिजा दिन्छ। दुवैले स्पष्ट मात्रा–प्रतिक्रिया वक्र देखाउँछन्। दुवै इमानदार छन्। यो भिन्नताको कारण छल वा अक्षमता होइन। कारण के हो भने यी दुई समूहले फरक प्रकाशमा, फरक प्रश्नको उत्तर दिने प्रोबहरू प्रयोग गरेर फरक कुराहरू मापन गरे, अनि दुवै उत्तरलाई एउटै शब्दले वर्णन गरे: ROS।

मेथिलिन ब्लुलाई ठ्याक्कै मापन गर्न गाह्रो हुन्छ, किनभने यसले अवलोकन गर्नुपर्ने रासायनिक प्रक्रियामा आफैँ भाग लिन्छ। अँध्यारोमा यसले दाता र स्वीकारकर्ताबीच इलेक्ट्रोन ओसारपसार गर्छ र फेरि चक्र चलाउन तयार भएर आफ्नो प्रारम्भिक रूपमा फर्कन्छ। प्रकाशमा यो प्रकाशसंवेदीकारक बन्छ र उत्तेजित ट्रिप्लेट अवस्थामा पुग्छ। त्यस अवस्थाबाट यसले अक्सिजनलाई ऊर्जा दिएर सिङ्गलेट अक्सिजन बनाउन वा इलेक्ट्रोन स्थानान्तरण गरेर रेडिकल र हाइड्रोजन पेरोक्साइड बनाउन सक्छ। त्यस प्रणालीमा राखिएको कुनै पनि प्रोबलाई रञ्जक आफैँले अक्सिडाइज, रिड्युस वा ब्लीच गर्न सक्छ, अथवा त्यसको प्रकाशीय संकेत छोप्न सक्छ। त्यसैले कुनै पनि ROS मापन नतिजाबारे पहिलो प्रश्न कहिल्यै सङ्ख्या कति हो भन्ने हुँदैन। प्रश्न हुन्छ: परीक्षणले वास्तवमा के पत्ता लगाउँछ, र रञ्जकले परीक्षणलाई के गर्छ?

Amplex Red: क्यालिब्रेट गरिएको हाइड्रोजन पेरोक्साइड परीक्षण

सही ढङ्गले तयार गर्दा, यस अनुसन्धान साहित्यमा मेथिलिन ब्लु र Amplex Red को संयोजन सबैभन्दा बलियो आधार भएको जोडी हो। यसको रासायनिक प्रक्रिया विशिष्ट छ: हर्सर्‍याडिस पेरोक्सिडेजले हाइड्रोजन पेरोक्साइड प्रयोग गरी Amplex सब्सट्रेटलाई प्रतिदीप्त उत्पादन रेसोरुफिनमा अक्सिडाइज गर्छ, लगभग एक-बराबर-एक स्टोइकियोमेट्रीमा। नमुनाको पेरोक्साइड डिटेक्टरमा प्रतिदीप्ति बन्छ। सामान्यतः ROS समूहमा राखिने अरू कुनै पदार्थले यो प्रतिक्रिया प्रत्यक्ष रूपमा चलाउँदैन।

यसको निर्णायक लाभ क्यालिब्रेसन हो। सावधानीपूर्वक काम गर्ने अनुसन्धानकर्ताले उही बफरमा, उही पेरोक्सिडेज र सब्सट्रेट सान्द्रता, उही इन्क्युबेसन समय र उही प्रकाशीय सेटिङ प्रयोग गरेर ज्ञात पेरोक्साइड मानकहरू परीक्षण गर्छन्, अनि नमुनाहरूलाई त्यस वक्रसँग तुलना गरेर मापन गर्छन्। यस विधिको आधार बनेको पृथक् मस्तिष्क माइटोकन्ड्रियाको अध्ययनमा लेखकहरूले ठ्याक्कै त्यसै गरे। उनीहरूले प्रत्येक परीक्षणको अन्त्यमा पेरोक्साइडको ज्ञात मात्रा थपे, र नतिजाहरू मनपरी प्रतिदीप्ति एकाइमा नभई प्रति मिलिग्राम प्रोटिन प्रति मिनेट पिकोमोलको दरमा रिपोर्ट गरे। चमकलाई मापनमा बदल्ने कुरा यही हो।

त्यस अध्ययनका तीन पक्ष अनुकरणयोग्य छन्। पहिलो, लेखकहरूले पेरोक्साइड नष्ट गर्ने क्याटालेज प्रयोग गरेर संकेतको पुष्टि गरे। क्याटालेज थप्दा मेथिलिन ब्लुले गराएको प्रतिदीप्तिको वृद्धि रोकियो, जसले संकेत पेरोक्साइडको थियो, प्रकाशीय विकृति थिएन भन्ने पुष्टि गर्‍यो। दोस्रो, उनीहरूले उत्तेजन किरणलाई सटरले छेकेर नमुनामा सामान्य प्रकाश मात्राको एक आठौँ भाग मात्र पर्ने गरी प्रकाशको प्रभाव प्रत्यक्ष परीक्षण गरे, र संकेत केवल नौ प्रतिशतले घट्यो। उनीहरूले रिपोर्ट गरेको पेरोक्साइडको नब्बे प्रतिशतभन्दा बढी अंश मापनमा प्रयोग गरिएको प्रकाशबाट स्वतन्त्र थियो। तेस्रो, उनीहरूले इलेक्ट्रोड प्रयोग गरेर पेरोक्साइड हट्ने प्रक्रिया छुट्टै मापन गरे र रञ्जकले उत्पादन बढाउनुका साथै हट्ने गति पनि घटाएको पाए। केवल खुद प्रतिदीप्ति रिपोर्ट गर्ने प्रोबले यी दुई प्रभावलाई एउटै प्रभावका रूपमा मिसाउने थियो।

यस परीक्षणमा अझै पनि त्रुटि आउन सक्ने अवस्थाहरू छन्, र मेथिलिन ब्लुले तीमध्ये धेरैलाई उजागर गर्छ। रेसोरुफिनले प्रकाश उत्सर्जन गर्ने उही रातो क्षेत्रमा रञ्जकले फराकिलो रूपमा प्रकाश अवशोषण गर्छ। त्यसैले रञ्जकको उच्च सान्द्रतामा नमुनाले आन्तरिक फिल्टर प्रभावका कारण आफ्नै संकेत छोप्न सक्छ। त्यसकारण मानकहरूमा पनि नमुनामा जत्तिकै रञ्जक सान्द्रता हुनुपर्छ। Amplex Red आफैँ पनि प्रकाश-अक्सिडाइज हुन सक्छ, र यसको उत्पादन रेसोरुफिन सुपरअक्साइड र पेरोक्साइड उत्पन्न गर्ने प्रकाश-रेडक्स चक्रमा प्रवेश गर्न सक्छ। प्रयोगमा प्रकाशसंवेदीकारकलाई पनि प्रकाश दिइँदा यो कुरा निकै महत्त्वपूर्ण हुन्छ। व्यावहारिक समाधान भनेको रञ्जक र प्रोबलाई सँगै प्रकाश दिनुको सट्टा पहिले मेथिलिन ब्लुका नमुनालाई प्रकाश दिनु र त्यसपछि तिनका निश्चित अंशहरूलाई अँध्यारोमा Amplex अभिकर्मकहरू प्रयोग गरेर परीक्षण गर्नु हो। अन्त्यमा, सुपरअक्साइड डिस्म्युटेजले Amplex संकेतलाई केवल घटाउने मात्र गर्दैन: सुपरअक्साइडलाई पेरोक्साइडमा बदल्दा संकेत बढ्न सक्छ। प्रतिदीप्ति बढाउने SOD नियन्त्रण असफल भएको होइन। त्यसले सुपरअक्साइडलाई प्रक्रियाको अघिल्लो चरणमा रहेको प्रजातिका रूपमा पहिचान गरेको हो।

DCFDA: अविशिष्ट अक्सिडेसन सूचक

मेथिलिन ब्लु र DCFDA को जोडी अधिकांश अन्योलको स्रोत हो। DCFH-DA कोशिकाभित्र प्रवेश गराइने पूर्ववर्ती पदार्थ हो। कोशिकाभित्रका एस्टरेजहरूले यसका एसिटेट समूह हटाएर अप्रतिदीप्त DCFH छाड्छन्, र DCFH को अक्सिडेसनले प्रतिदीप्त DCF उत्पन्न गर्छ। यसलाई अक्सिडाइज गर्ने पदार्थहरूको सूची लामो छ: हाइड्रोक्सिल रेडिकल, पेरोक्सिडेज र हिमका मध्यवर्ती पदार्थ, नाइट्रोजन डाइअक्साइड, हाइपोक्लोरस एसिड र पेरोक्सिनाइट्राइटबाट बनेका रेडिकल। हाइड्रोजन पेरोक्साइड एक्लैले यसलाई कुनै उपयोगी दरमा प्रत्यक्ष अक्सिडाइज गर्दैन; पेरोक्साइडमा निर्भर प्रतिदीप्तिका लागि सामान्यतः प्रक्रियामा फलाम, हिम प्रोटिन वा पेरोक्सिडेजको रासायनिक प्रक्रिया आवश्यक हुन्छ।

हरेक विधि खण्डले उद्धृत गर्नुपर्ने आलोचना कल्याणरमन र सहकर्मीहरूले DCFH लाई प्रोबका रूपमा गरेको विश्लेषणबाट आएको हो। यही कारणले DCFDA अस्वीकार गरेको मस्तिष्क माइटोकन्ड्रिया अध्ययन मा सारांश दिइएअनुसार, उनीहरूले यो रञ्जकले ढिलो प्रतिक्रिया गर्ने, यसको स्टोइकियोमेट्री पहिचान नगरिएको, वैध क्यालिब्रेसन नभएको र ROS बाहेकका यौगिकसँग पनि प्रतिक्रिया गर्ने देखाए। प्रोबले आफूले मापन गर्ने प्रक्रियालाई बढाउँछ पनि: DCFH को एक-इलेक्ट्रोन अक्सिडेसनले DCF रेडिकल बनाउँछ, जसले अक्सिजनसँग प्रतिक्रिया गरेर सुपरअक्साइड उत्पन्न गर्छ। त्यसको डिस्म्युटेसनबाट थप पेरोक्साइड बन्छ। मापन प्रक्रियाले रिपोर्ट गर्ने रासायनिक प्रक्रियाको केही अंश आफैँ सिर्जना गर्छ।

यी कुनै पनि कुराले DCFDA लाई अनुपयोगी बनाउँदैन। तर यसलाई पहिचान गर्ने विधि होइन, प्रारम्भिक जाँच बनाउँछ। DCF प्रतिदीप्ति बढ्नुको अर्थ अक्सिडेन्टमा निर्भर प्रोबको अक्सिडेसन बढ्यो भन्ने हो। यसको अर्थ पेरोक्साइड बढ्यो भन्ने होइन, र निश्चय नै कुल ROS बढ्यो भन्ने पनि होइन; कुल ROS कुनै एउटै प्रोबले मापन गर्ने परिमाण होइन। एक माइक्रोमोलरभन्दा माथि DCF अक्सिडेसनमा भर परेका मेथिलिन ब्लुसम्बन्धी पहिलेका अध्ययनहरूले अक्सिडेसन बढाउने प्रभाव रिपोर्ट गरे, जबकि उही समयका अन्य प्रणालीहरूले पेरोक्साइडका कारण हुने कोशिका मृत्युबाट सुरक्षा रिपोर्ट गरे। फरक रेडक्स परिस्थितिमा एउटै रञ्जकका यी दुवै अवलोकन सत्य हुन सक्छन्, र DCF नतिजा एक्लैले कुन अक्सिडेन्टले संकेत दिएको थियो भन्न सक्दैन। पहिलेको मस्तिष्क माइटोकन्ड्रिया अध्ययनको महत्त्व यहीँ छ: त्यसले यो प्रारम्भिक जाँचको सट्टा क्यालिब्रेट गरिएको पेरोक्साइड मापन प्रयोग गर्‍यो र पेरोक्साइडको बोझ प्रत्यक्ष पत्ता लगायो। एक सय न्यानोमोलर रञ्जकले समेत परीक्षण गरिएका हरेक सब्सट्रेट र श्वसन अवस्थामा पेरोक्साइडको निस्कासन कैयौँ गुणा बढायो।

DCFDA मा मेथिलिन ब्लुसँग सम्बन्धित अर्को जोखिम पनि छ। रञ्जकको रङ गाढा हुन्छ र यो रेडक्स-सक्रिय हुन्छ, त्यसैले यसले प्रतिदीप्ति ब्लीच गर्न, उत्सर्जन निभाउन वा कोशिकीय ROS बाट स्वतन्त्र रूपमा प्रोबको रासायनिक प्रक्रियालाई अक्सिडाइज गर्न सक्छ। रञ्जक र प्रोब भएको तर कोशिका नभएको कोशिका-रहित नियन्त्रण ऐच्छिक सजावट होइन। रञ्जकले प्रोबसँग अन्तर्क्रिया गर्छ कि गर्दैन भन्ने बताउने प्रयोग यही हो।

स्पिन ट्र्यापिङ र अक्सिजन खपत: पहिचान र प्रवाह

प्रतिदीप्त प्रोबहरूले अक्सिडाइज हुन सक्ने केही पदार्थ देखा परेको रिपोर्ट गर्छन्, तर स्पिन ट्र्यापसहितको इलेक्ट्रोन स्पिन रेजोनेन्सले त्यो पदार्थ के थियो भन्नेबारे अझ नजिकको जानकारी दिन्छ। मेथिलिन ब्लुको प्रकाशरसायनसम्बन्धी प्रसिद्ध अध्ययनले रञ्जक, एस्कोर्बेट र प्रकाशबाट बनेको एस्कोर्बेट रेडिकल पत्ता लगाउन ESR प्रयोग गर्‍यो। त्यसपछि अक्सिजन खपतका प्रयोगहरूमा पेरोक्साइड निर्माण र स्पिन ट्र्यापिङ परीक्षणहरूमा फलामद्वारा उत्प्रेरित हाइड्रोक्सिल रेडिकल निर्माण देखायो। प्रत्येक प्रविधिले अरू प्रविधिले दिन नसक्ने प्रश्नको उत्तर दियो: ESR ले रेडिकलको पहिचान दियो, अक्सिजन खपतले कुनै पनि प्रतिदीप्त प्रोबबाट स्वतन्त्र प्रतिक्रिया प्रवाह दियो, र तिनको संयोजनले उही प्रकाशित प्रणालीमा सिङ्गलेट अक्सिजन र रेडिकल दुवै मार्ग सक्रिय रहेको देखायो।

सन् 1984 को त्यो नतिजा अझै पनि चेतावनीजस्तै लाग्छ। प्रकाश र रिड्युसिङ एजेन्ट उपस्थित हुँदा रञ्जकले पेरोक्साइड उत्पन्न गर्‍यो, र फलाम उपस्थित हुँदा प्रणालीले त्यस समूहको सबैभन्दा प्रतिक्रियाशील प्रजाति, हाइड्रोक्सिल रेडिकल, उत्पन्न गर्‍यो। लेखकहरूले यसलाई आँखामा रहेको एस्कोर्बेटसँग जोडे र सोचविचार नगरी गरिने नेत्रसम्बन्धी प्रयोगमाथि प्रश्न उठाए। आजका पाठकहरूले ती अवस्थाहरू ध्यानमा राख्नुपर्छ: प्रकाशसँगै रिडक्टेन्ट र फलाम। यीमध्ये कुनै एउटा हटाउँदा मार्ग कमजोर हुन्छ वा हराउँछ।

अक्सिजन इलेक्ट्रोडको उपयोगिता फरक किसिमले स्थापित हुन्छ। क्लार्क प्रकारको इलेक्ट्रोडले खुद अक्सिजन खपत मापन गर्छ। यसले रञ्जकद्वारा सञ्चालित रेडक्स प्रक्रियाले आणविक अक्सिजन खपत गरिरहेको पुष्टि गर्छ र कुनै प्रतिदीप्ति विकृतिले नक्कली बनाउन नसक्ने प्रतिक्रिया गतिको जानकारी दिन्छ। यसले उत्पादनको पहिचान गर्दैन। पेरोक्साइड, सुपरअक्साइड र पानी बन्ने प्रक्रिया तथा सिङ्गलेट अक्सिजनको क्षय—सबैले अक्सिजन खपत गर्छन्। पहिचानविनाको प्रवाह, प्रवाहविनाको पहिचानजत्तिकै अपूर्ण हुन्छ। त्यसैले बलिया अनुसन्धान लेखहरूले इलेक्ट्रोडलाई क्यालिब्रेट गरिएको पेरोक्साइड परीक्षण वा ट्र्यापसँग जोड्छन्।

एन्टिअक्सिडेन्टका नतिजाहरू किन बाझिन्छन्

यी तीन मापन नतिजालाई सँगसँगै राख्दा मेथिलिन ब्लुसम्बन्धी अनुसन्धान साहित्यमा देखिने विरोधाभासहरू विधिगत भिन्नता र तीन जैविक तथ्यबाट स्पष्ट हुन्छन्।

पहिलो, यो रञ्जक इलेक्ट्रोन ओसारपसार गर्ने माध्यम र पेरोक्साइडको स्रोत दुवै हो। अक्सिजन अन्यथा सुपरअक्साइड बन्ने श्वसन स्थलहरूबाट इलेक्ट्रोन मोडेर यसले एउटा ROS घटाउन सक्छ। त्यसै बेला यसको रिड्युस्ड रूपले अक्सिजनलाई प्रत्यक्ष पेरोक्साइडमा रिड्युस गरेर अर्को ROS बढाउन सक्छ। त्यसैले माइटोकन्ड्रियाको रेडक्स प्रक्रिया र त्यसमा यसको बाइपास भूमिका अध्ययन गर्ने प्रयोगशालाले प्रोबअनुसार फरक उत्तर अपेक्षा गर्नुपर्छ: एउटै क्युभेटमा सुपरअक्साइड-संवेदनशील मापन नतिजा घट्छ भने पेरोक्साइडको मापन नतिजा बढ्छ।

दोस्रो, कम मात्रामा पेरोक्साइड केवल क्षति होइन, सङ्केत पनि हो। पहिलेको कामपछि गरिएको मुसाको मस्तिष्क माइटोकन्ड्रिया अध्ययनले उपचारात्मक स्तरमा माइटोकन्ड्रियल DNA मा क्षति नपारी पचास न्यानोमोलरजति कम रञ्जकबाट पनि पेरोक्साइड उत्पन्न भएको पायो। पहिले रञ्जक दिइएको अवस्थामा रोटेनोनका कारण हुने क्षतिबाट सुरक्षा पनि देखियो। उपचारात्मक दायराभन्दा धेरै माथिको एक सय माइक्रोमोलरमा मात्र रञ्जकले केही चयनित DNA खण्डलाई क्षति पुर्‍यायो। साथै, रातो प्रकाश र बीस माइक्रोमोलर रञ्जकले सिङ्गलेट अक्सिजन उत्पन्न गरे, जसले परीक्षण गरिएका सबै खण्डलाई क्षति पुर्‍यायो। प्रस्तावित संयन्त्र हर्मेसिसमा आधारित छ: हल्का पेरोक्साइड उत्पादनले Nrf2 सँग सम्बन्धित एन्टिअक्सिडेन्ट प्रतिरक्षा र माइटोकन्ड्रियाको जैविक निर्माण सक्रिय गर्छ। त्यसैले छोटो अवधिमा अक्सिडेसन बढेको देखाउने नतिजापछि लामो अवधिमा एन्टिअक्सिडेन्ट प्रभाव देखिन्छ। एक घण्टामा मापन गरिएको परीक्षण र एक दिनमा मापन गरिएको परीक्षण बाझिन सक्छन्, किनभने बीचको समयमा जैविक अवस्था बदलिएको हुन्छ।

तेस्रो, प्रकाशले कुन अणु उपस्थित छ भन्नेसमेत निर्धारण गर्छ। प्रकाशले रञ्जकको डिमेथिलेसन गराएर यसलाई Azure B र सम्बन्धित उत्पादनहरूतर्फ बदल्छ, र नमुना डिशमाथिको माइक्रोस्कोप बत्ती नै यसलाई प्रकाशसंवेदनशील बनाउन पर्याप्त हुन्छ। अँध्यारोमा र प्रकाशमा गरिएका प्रयोग फरक प्रयोग हुन्, र कुनै पनि प्रोटोकलको प्रकाश र रञ्जक व्यवस्थापनसम्बन्धी नियन्त्रण खण्डले तिनलाई त्यही रूपमा लिनुपर्छ।

न्यूनतम नियन्त्रणहरूको समूह, र कुनै पनि दाबी कसरी बुझ्ने

तलको तुलना यस लेखका लागि तयार गरिएको मौलिक सन्दर्भ सामग्री हो। मेथिलिन ब्लुसम्बन्धी कुनै पनि ROS नतिजा स्वीकार गर्नुअघि लेखकहरूले कुन पङ्क्तिका नियन्त्रण पूरा गरे र कुन छाडे भनेर जाँच्नुहोस्।

यसबाट नतिजा बुझ्ने एउटा व्यावहारिक नियम निस्कन्छ। पेरोक्सिडेजसहित, क्यालिब्रेट गरिएको र क्याटालेजले जाँचिएको Amplex ले पेरोक्साइडबारे प्रमाण दिन्छ। DCFDA ले अविशिष्ट प्रोब अक्सिडेसनबारे प्रमाण दिन्छ, त्यसभन्दा बढी केही होइन। स्क्याभेन्जर नियन्त्रणसहितको स्पिन ट्र्यापिङले रेडिकलको पहिचानबारे प्रमाण दिन्छ। अक्सिजन खपतले प्रवाहबारे प्रमाण दिन्छ। कुनै वाक्यले त्यसको परीक्षणले समर्थन गर्न सक्नेभन्दा बढी दाबी गर्छ भने, जतिसुकै आत्मविश्वासका साथ लेखिएको भए पनि, त्यो रञ्जकबारे होइन, प्रोबबारेको वाक्य हो। मात्रामा निर्भरता र हर्मेसिसको दायरा, माइटोकन्ड्रियाको इलेक्ट्रोन प्रवाह, रङ लगाइएका नमुनामा परीक्षणको हस्तक्षेप र माइक्रोस्कोपीमा प्रकाशले सिर्जना गर्ने विकृतिसम्बन्धी चर्चाहरूले यी प्रत्येक बुँदालाई थप विस्तार गर्छन्, र अस्थायी सन्दर्भको ठाउँमा वास्तविक सन्दर्भ राखिएपछि पनि प्रत्येक बुँदा मान्य रहन्छ।