मेथिलिन ब्लू र नाइट्रिक अक्साइड: NOS, cGMP र रक्तनलीको संकेत सञ्चार

प्रश्न सरल सुनिन्छ: के मेथिलिन ब्लूले नाइट्रिक अक्साइडलाई अवरोध गर्छ? प्रयोगशालामा यसको उत्तर चार छुट्टाछुट्टै प्रश्नमा विभाजित हुन्छ, र प्रत्येकलाई जाँच्ने प्रयोग पनि फरक हुन्छ। यी प्रश्नलाई एकै ठान्नु नै मेथिलिन ब्लू र नाइट्रिक अक्साइडबारे लेखिएका कुरा आत्मविश्वासपूर्ण तर अस्पष्ट देखिनुको मुख्य कारण हो।

नाइट्रिक अक्साइडको संकेतलाई चार कडी भएको शृङ्खलाका रूपमा सोच्नुहोस्। नाइट्रिक अक्साइड सिन्थेज बनाउन एउटा जीनको ट्रान्सक्रिप्सन हुन्छ। इन्जाइमले आर्जिनिनलाई नाइट्रिक अक्साइडमा रूपान्तरण गर्छ। यो ग्यास अरू कुनै पदार्थसँग प्रतिक्रिया गर्नुअघि विसरण हुँदै आफ्नो लक्ष्यमा पुग्छ। घुलनशील गुआनिलेट साइक्लेजले यसलाई पहिचान गरेर चक्रीय GMP बनाउँछ। यी हरेक कडीमा मेथिलिन ब्लूका प्रभावबारे प्रकाशित विवरण छन्, तर प्रमाण फरक प्रायोगिक तयारी, फरक सान्द्रता र फरक आइसोफर्मबाट आएका हुन्। एउटा कडीमा देखिएको नतिजाले अर्को कडीमा हुने क्रियालाई प्रमाणित गर्दैन।

स्थापित शृङ्खलालाई सरल रूपमा बुझ्दा

रक्तनलीको भित्तामा सामान्य प्रक्रिया यसरी चल्छ। कुनै उद्दीपनले एन्डोथेलियल कोषमा प्रभाव पार्छ। eNOS वा NOS3 भनिने एन्डोथेलियल नाइट्रिक अक्साइड सिन्थेजले नाइट्रिक अक्साइडको सानो, क्षणिक मात्रा बनाउँछ। यो ग्यास विसरण हुँदै छेउको चिल्लो मांसपेशी कोषमा पुग्छ, घुलनशील गुआनिलेट साइक्लेजको अपचयित फलामयुक्त हेमसँग बाँधिन्छ र GTP लाई चक्रीय GMP मा रूपान्तरण गर्ने प्रक्रिया तीव्र बनाउँछ। चक्रीय GMP ले प्रोटिन काइनेज G सक्रिय गर्छ, क्याल्सियमको व्यवस्थापन बदलिन्छ र मांसपेशी शिथिल हुन्छ।

अर्को शृङ्खलालाई यसबाट अलग राखेर बुझ्नु उपयोगी हुन्छ। सङ्क्रमण वा साइटोकाइनको सम्पर्कमा पर्दा कोषहरूले फरक इन्जाइमको ट्रान्सक्रिप्सन गर्छन्। यो प्रेरणीय नाइट्रिक अक्साइड सिन्थेज वा iNOS हो, जसलाई NOS2 पनि भनिन्छ। यसले eNOS को तुलनामा बढी र लामो समयसम्म जारी रहने नाइट्रिक अक्साइड प्रवाह उत्पन्न गर्छ। तेस्रो आइसोफर्म, न्युरोनल NOS वा nNOS, फेरि अर्को सन्दर्भसँग सम्बन्धित छ। कुनै शोधपत्रले आइसोफर्म नखुलाइकन नाइट्रिक अक्साइड सिन्थेज उल्लेख गर्छ भने, रोकिएर कुन आइसोफर्म मापन गरिएको थियो भन्ने जाँच्नुहोस्। मेथिलिन ब्लूले इलेक्ट्रोन कसरी सार्छ भन्ने समग्र विवरणले सामान्य रूपमा रेडक्स लक्ष्यहरूबारे पनि यही कुरा स्पष्ट गर्छ: इलेक्ट्रोन सार्ने मध्यस्थले एक्लै केही गर्दैन, र दुवै छेउमा रहेको साझेदारले परिणाम तय गर्छ।

मापन गरिएको चक्रीय GMP पनि समग्र प्रक्रियाको सूचक हो, इन्जाइमको प्रत्यक्ष परीक्षण होइन। यसको स्तर साइक्लेजले गर्ने संश्लेषणबाट फस्फोडाइएस्टरेजहरूले गर्ने विघटन घटाउँदा बाँकी रहने परिमाणमा निर्भर हुन्छ; रक्तनलीको चिल्लो मांसपेशीमा विशेष गरी PDE5 महत्त्वपूर्ण हुन्छ। त्यसैले चक्रीय GMP घट्नुको अर्थ कम संकेत पहिचान गर्ने अणुसम्म पुग्यो भन्ने हो। यसले मात्र कुन कडीमा समस्या आयो भनेर बताउँदैन।

कडी 1: कम iNOS इन्जाइम बन्छ

ब्याक्टेरियाको लिपोपोलिस्याकराइड, इन्टरफेरोन गामा वा दुवैबाट उद्दीप्त मुसाका म्याक्रोफेजहरूमा मेथिलिन ब्लूले iNOS प्रोटिनमा अपेक्षित वृद्धि हुन दिएन र iNOS मेसेन्जर RNA लाई धेरै घटायो। यो नतिजा म्याक्रोफेज ट्रान्सक्रिप्सन प्रयोगहरूमा देखिएको थियो। यहाँ जानकारीमूलक पक्ष भनेको के परिवर्तन भएन भन्ने हो। अवरोधक I काप्पा B अल्फाको विघटन, NF काप्पा B र STAT1 को फस्फोराइलेसन तथा यी कारकहरूको केन्द्रकतर्फको स्थानान्तरण धेरै हदसम्म यथावत् रहे। घटेको कुरा भने DNA सँग तिनको बन्धन थियो। क्रोमाटिन इम्युनोप्रेसिपिटेसनले iNOS प्रमोटरमा तिनको उपस्थिति घटेको देखाएर यसको पुष्टि गर्‍यो।

यो इन्जाइमको मात्रा निर्धारण हुनुअघिको जीन नियमनसम्बन्धी प्रभाव हो, पहिल्यै रहेको इन्जाइममा हुने तत्काल अवरोध होइन। यो सूजनसम्बन्धी संकेत सञ्चारको विषय हो, जहाँ प्रोटिन देखा पर्नुअघि ट्रान्सक्रिप्सन कारकहरू प्रमोटरसँग बाँधिनुपर्छ। यसले विश्राम अवस्थामा रहेको रक्तनलीको निरन्तर उपस्थित eNOS बारे प्रत्यक्ष रूपमा केही बताउँदैन, र यसको वर्णन पनि यही सीमाभित्र गर्नुपर्छ।

कडी 2: पहिल्यै रहेको NOS इन्जाइम सुस्त चल्छ

मुसामा गरिएको एउटा अध्ययनले फरक तहको परीक्षण गर्‍यो। होसमा रहेका भाले मुसालाई नसाबाट लिपोपोलिस्याकराइड दिइयो। त्यसको तीन घण्टापछि नसाबाट या त सलाइन वा 3 mg per kg मेथिलिन ब्लू दिइयो। त्यसपछि मध्यवर्ती आधारभूत हाइपोथालामसमा नाइट्रिक अक्साइड सिन्थेजको सक्रियता मापन गरियो। हाइपोथालामसको NOS सक्रियतासम्बन्धी अध्ययनमा चिन्हित आर्जिनिन सिट्रुलिनमा रूपान्तरण भएको मापन गरेर यो जाँच गरिएको थियो। तनावसँगै सलाइन मात्र दिँदा केही क्याल्सियम-स्वतन्त्र सक्रियता उत्पन्न भयो, र लिपोपोलिस्याकराइडले त्यसलाई नियन्त्रण समूहको स्तरभन्दा करिब दस गुणा बढायो। मेथिलिन ब्लूले यी दुवै प्रेरित अंश हटायो। उक्त तन्तुमा, उक्त मात्रा र समयबिन्दुमा क्याल्सियम-निर्भर, निरन्तर उपस्थित सक्रियता भने परिवर्तन भएन।

यो नतिजालाई ठ्याक्कै उल्लेख गरिएकै अर्थमा बुझ्नुहोस्: ती परिस्थितिमा मापन गरिएको iNOS प्रकारको सक्रियता दबिएको थियो। यो जीन अभिव्यक्तिको मापन होइन, र eNOS वा nNOS को तुलनामा iNOS प्रति सधैँ छनोटपूर्ण हुने प्रमाण पनि होइन। शुद्धीकृत इन्जाइममा गरिएको कामले अझ सावधानी अपनाउनुपर्ने देखाउँछ। शुद्धीकृत नाइट्रिक अक्साइड सिन्थेजको प्रत्यक्ष परीक्षणमा मेथिलिन ब्लूले 30 micromolar मा सिट्रुलिन बन्ने प्रक्रिया पूर्ण रूपमा रोकेको थियो। आधा अवरोध गर्ने सान्द्रता सुपरअक्साइड डिस्म्युटेज नहुँदा करिब 5.3 micromolar र हुँदा 9.2 micromolar थियो, जसको विवरण शुद्धीकृत NOS र गुआनिलेट साइक्लेजको तुलनामा दिइएको छ। शुद्धीकृत nNOS मा गरिएको अर्को अध्ययनले इन्जाइमसँग बाँधिएको हेमको अक्सिडेसनलाई यसमा संलग्न देखायो। व्यावहारिक निष्कर्ष के हो भने अलग गरिएको प्रणालीमा NOS को प्रत्यक्ष अवरोध वास्तवमै हुन्छ, तर हाइपोथालामसको नतिजालाई तन्काएर मेथिलिन ब्लूले सबै ठाउँमा सबै निरन्तर उपस्थित NOS लाई असर गर्दैन भन्ने सामान्य दाबी गर्न मिल्दैन।

कडी 3: नाइट्रिक अक्साइड लक्ष्यमा पुग्नुअघि नै नष्ट हुन्छ

चक्रीय GMP घट्नुको कारण इन्जाइम अवरोधबाहेक अरू पनि हुन सक्छ भन्ने सबैभन्दा स्पष्ट प्रदर्शन संवर्धित खरायोका फोक्सोका धमनीको चिल्लो मांसपेशी कोषबाट आएको हो। यस प्रयोगको डिजाइनले नाइट्रिक अक्साइड दिने पदार्थहरू सीधै थपेर शरीरभित्रको NOS लाई पूर्ण रूपमा छल्यो। त्यसपछि रक्तनलीको चिल्लो मांसपेशीमा सुपरअक्साइडसम्बन्धी अध्ययनमा मेथिलिन ब्लूले चक्रीय GMP प्रतिक्रिया अझै पनि घटाउँछ कि घटाउँदैन भनेर जाँचियो।

1 देखि 100 micromolar सम्म तीन दाता परीक्षण गरिए: S नाइट्रोसो L सिस्टिन, सोडियम नाइट्रोप्रुसाइड र MPANO भनिने स्थिर, डिअमिनेटेड समरूप यौगिक। सबैले चक्रीय GMP लाई लगभग 1.5 गुणादेखि 12 गुणासम्म बढाए। 10 micromolar मेथिलिन ब्लूले पहिलो दुईको प्रतिक्रिया 51 देखि 100 percent सम्म रोक्यो र MPANO को प्रतिक्रिया भने अपरिवर्तित रह्यो। यदि मेथिलिन ब्लूले साइक्लेजको उत्प्रेरक स्थललाई मात्र रोकिरहेको भए, दाताअनुसार देखिएको यो छनोटपूर्ण प्रभाव बुझाउन कठिन हुन्थ्यो, किनकि तीनवटैको संकेत अन्ततः एउटै इन्जाइममा पुग्छ।

त्यसपछि तीन नियन्त्रण परीक्षणले कार्यविधिलाई सुपरअक्साइडसँग जोडेर स्पष्ट गरे। पहिलो, जान्थिन र जान्थिन अक्सिडेजबाट कोषबाहिर सुपरअक्साइड उत्पन्न गर्दा उही ढाँचा देखियो: CYSNO र नाइट्रोप्रुसाइडको प्रतिक्रिया रोकियो, MPANO को प्रतिक्रिया भने प्रभावित भएन। दोस्रो, मेथिलिन ब्लूले चिल्लो मांसपेशी कोषबाट मात्रा र समयअनुसार बदलिने सुपरअक्साइड उत्पादन गरायो, जसलाई साइटोक्रोम c को अपचयनबाट मापन गरिएको थियो। तेस्रो, सुपरअक्साइड डिस्म्युटेजले अवरोधलाई पूर्ण रूपमा रोक्यो, तर क्याटालेजले रोकेन। यसले उक्त प्रायोगिक तयारीमा तत्काल प्रभाव पार्ने रासायनिक प्रजाति हाइड्रोजन पेरअक्साइडभन्दा सुपरअक्साइड भएको सङ्केत गर्छ।

यस प्रयोगको सह-संवर्धन संस्करण उल्लेख गर्नु उपयोगी छ, किनकि यसले प्रभाव कहाँ परेको थियो भन्ने देखाउँछ। कभरस्लिपमा रहेका एन्डोथेलियल कोषलाई चिल्लो मांसपेशी कोषसँग केही समय सह-संवर्धन गरियो। त्यसैले आधारभूत अवस्थामा मुक्त भएको एन्डोथेलियल कारकले चिल्लो मांसपेशीको चक्रीय GMP लाई तीनदेखि आठ गुणा बढायो। कुनै पनि कोषसमूहमा पहिले मेथिलिन ब्लू प्रयोग गर्दा उक्त संकेत घट्यो, र सुपरअक्साइड डिस्म्युटेजले एन्डोथेलियल कोषमा गरिएको पूर्व-प्रयोगको प्रभावलाई आंशिक रूपमा उल्ट्यायो। अर्को शब्दमा, मेथिलिन ब्लूले चिल्लो मांसपेशीको संकेत पहिचान गर्ने कोषभित्रै काम गर्नुपर्ने छैन। यसले बाटोमै सन्देशवाहकलाई हटाएर संकेत घटाउन सक्छ। मेथिलिन ब्लू अनुसन्धान पढ्ने मार्गदर्शिकाले यसलाई सामान्य नियमका रूपमा लिन्छ: आणविक लक्ष्यको नाम लिनुअघि हस्तक्षेप कुन भागमा गरिएको थियो भनेर खुलाउनुहोस्।

यसलाई NOS अवरोध भन्नु गलत हुन्छ। दाताहरूले काम गर्न कुनै सिन्थेज चरण आवश्यक थिएन, तैपनि संकेत घट्यो।

कडी 4: संकेत पहिचान गर्ने अणु आफैँले कम प्रतिक्रिया दिन्छ

घुलनशील गुआनिलेट साइक्लेजमा प्रत्यक्ष प्रभाव पर्छ, तर सान्द्रता महत्त्वपूर्ण हुन्छ। माथि उद्धृत शुद्धीकृत इन्जाइमको तुलनामा, नाइट्रिक अक्साइडबाट उद्दीप्त साइक्लेजलाई आधा अवरोध गर्न करिब 60 micromolar मेथिलिन ब्लू चाहिएको थियो, जबकि NOS को आधा अवरोध करिब 5 देखि 9 micromolar मा भएको थियो। 1 millimolar ले समेत पूर्ण अवरोध नगरी आंशिक अवरोध मात्र गर्‍यो। यो लगभग छदेखि एघार गुणाको अन्तर हो। त्यसैले कम micromolar सान्द्रतामा गरिएको कोषको प्रयोगले चक्रीय GMP घटायो भन्दैमा चक्रीय GMP को मापनकै आधारमा त्यसलाई छनोटपूर्ण साइक्लेज अवरोध भन्न मिल्दैन।

पछिको एउटा रेडक्स अध्ययनले अर्को सावधानी थप्यो: मेथिलिन ब्लूले नाइट्रिक अक्साइडबाट सक्रिय भएको साइक्लेजलाई निष्क्रिय बनाउने कार्यविधि हावाले हेमको फलामलाई गर्ने साधारण अक्सिडेसनभन्दा फरक थियो। त्यसैले संकेत पहिचान गर्ने अणुमा समस्या पर्न सक्छ, तर यसको रसायन पूर्ण रूपमा स्पष्ट भएको छैन। सान्द्रताको अन्तरका कारण कम micromolar सम्पर्कमा पहिले सुपरअक्साइड र NOS का प्रभावलाई जाँचेर अलग गर्नुपर्छ। फस्फोडाइएस्टरेजको नियन्त्रण परीक्षण पनि यहीँ आवश्यक हुन्छ। विघटन मापन गरिएको वा रोकिएको छैन भने, चक्रीय GMP को कम सञ्चय कम संश्लेषण, छिटो विघटन वा दुवैसँग मिल्दोजुल्दो हुन्छ।

यसलाई रक्तचापबारे एउटै दाबीमा किन सीमित गर्न मिल्दैन

हरेक कडी फरक प्रणालीमा स्थापित गरिएको थियो। म्याक्रोफेजको ट्रान्सक्रिप्सन हाइपोथालामसको इन्जाइम सक्रियता होइन। लिपोपोलिस्याकराइडपछि देखिएको हाइपोथालामसको सक्रियता विश्राम अवस्थाको एन्डोथेलियल टोन होइन। सह-संवर्धनमा आधारभूत रूपमा मुक्त भएको एन्डोथेलियल कारक एगोनिस्टबाट उद्दीप्त रक्तनली विस्तार होइन। 10 micromolar मेथिलिन ब्लूको सम्पर्कमा रहेका संवर्धित फोक्सोका धमनीका कोष मानव रक्तसञ्चार होइनन्। यी सबैलाई मिसाएर मेथिलिन ब्लूले नाइट्रिक अक्साइड रोकेर रक्तचाप बढाउँछ भन्नेजस्तो वक्तव्य बनाउनु भनेको नियन्त्रण परीक्षणहरूले जोगाउन खोजेका भिन्नतालाई नै हटाउनु हो।

तीन जाँचले व्याख्यालाई तथ्यमा टिकाइराख्छन्। पहिलो, आइसोफर्मको नाम खुलाउनुहोस्: विश्राम अवस्थाको रक्तनली टोनका लागि eNOS, प्रेरित सूजनसम्बन्धी प्रवाहका लागि iNOS, र स्नायुकोष तथा केही शुद्धीकृत इन्जाइमका सन्दर्भका लागि nNOS। दोस्रो, नाइट्रिक अक्साइड संकेत कसरी उपलब्ध गराइएको थियो भन्ने खुलाउनुहोस्: शरीरभित्रको संश्लेषण, आधारभूत एन्डोथेलियल मुक्ति वा CYSNO, नाइट्रोप्रुसाइड अथवा MPANO जस्ता निश्चित दाता। यो महत्त्वपूर्ण छ, किनकि स्थिर दाताले मेथिलिन ब्लूको प्रभावको प्रतिरोध गर्‍यो, जबकि अस्थिर दाताले गरेनन्। तेस्रो, सान्द्रता र प्रभाव उल्ट्याउने नियन्त्रण खुलाउनुहोस्: सुपरअक्साइड डिस्म्युटेजले प्रभाव उल्ट्याउनु सुपरअक्साइडको संलग्नताको सङ्केत हो; क्याटालेज असफल हुनुले उक्त प्रायोगिक तयारीमा हाइड्रोजन पेरअक्साइडको भूमिका विरुद्ध प्रमाण दिन्छ; जान्थिन अक्सिडेजले उस्तै प्रभाव देखाउनुले त्यो प्रभाव उत्पन्न गर्न पर्याप्त भएको देखाउँछ; र शुद्धीकृत इन्जाइमका परीक्षणले उत्प्रेरणमा पर्ने प्रत्यक्ष प्रभावलाई संकेत बाटोमै हराउने प्रभावबाट छुट्याउँछन्।

संक्षिप्त निष्कर्ष यस्तो छ। मेथिलिन ब्लूलाई छनोटपूर्ण साइक्लेज अवरोधकभन्दा नाइट्रिक अक्साइडदेखि चक्रीय GMP सम्मको संकेत सञ्चारमा धेरै स्थलमा परिवर्तन ल्याउने पदार्थका रूपमा बुझ्नु उचित हुन्छ। प्रायोगिक तयारी र सान्द्रताअनुसार यसले iNOS ट्रान्सक्रिप्सन कारकको बन्धन घटाउन, NOS इन्जाइमलाई प्रत्यक्ष अवरोध गर्न, सुपरअक्साइड उत्पादनमार्फत नाइट्रिक अक्साइडको उपलब्धता घटाउन र नाइट्रिक अक्साइडबाट सक्रिय भएको साइक्लेजको कार्यक्षमता कम गर्न सक्छ। रक्तनलीसम्बन्धी अध्ययनमा चक्रीय GMP संकेत सञ्चारको भूमिका र कोष परीक्षणमा प्रयोग गरिने नाइट्रिक अक्साइड दाताहरूको तुलना ले यीमध्ये एक-एक शाखालाई थप विस्तारमा समेट्छन्। रेडक्स प्रभावलाई इन्जाइमका प्रभावबाट छुट्याउन प्रयोग गरिने विधिहरू ले यस साहित्यमा सुपरअक्साइड डिस्म्युटेज, क्याटालेज र स्थिर दाताको नियन्त्रण किन यति धेरैपटक सँगै देखिन्छन् भन्ने व्याख्या गर्छ।

मेथिलिन ब्लूपछि चक्रीय GMP को कम मानले शृङ्खलामा अवरोध भएको देखाउँछ। कुन कडीमा अवरोध भयो भन्ने नियन्त्रण परीक्षणहरूले मात्र बताउँछन्।