मेथिलिन ब्लुको माइटोकन्ड्रियल प्रभाव मापन: अक्सिजन, ATP र झिल्ली विभव

मानौँ कुनै प्रयोगशालाले श्वसनमा बाधा भएका माइटोकन्ड्रियामा मेथिलिन ब्लु थप्छ र अक्सिजन खपत बढेको देख्छ। स्वाभाविक रूपमा लेखिने वाक्य हुन्छ: रङले माइटोकन्ड्रियाको कार्य पुनर्बहाल गर्‍यो। त्यो वाक्य गलत हुन सक्छ। अक्सिजन फ्लक्स, ATP संश्लेषण र झिल्ली विभव तीन फरक अवधारणा हुन्। तिनले एउटै कोशिकाङ्ग साझा गर्छन्, जसरी ब्याकअप, सिङ्क र साझेदारीले एउटै क्लाउड फोल्डर साझा गर्छन्: एकअर्कासँग सम्बन्धित, तर फरक नियमबाट सञ्चालित। एउटालाई अर्को ठानेमा व्याख्या गलत हुन्छ, हरेक मापन प्राविधिक रूपमा सही भए पनि।

मेथिलिन ब्लुले यो भ्रमको सम्भावना बढाउँछ, किनभने यसले मापन गरिरहेको प्रणालीमै भाग लिन्छ। यो अपस्ट्रिममा इलेक्ट्रोन स्वीकार्ने र डाउनस्ट्रिममा दिने रेडक्स चक्रकारक हो, ऊर्जायुक्त माइटोकन्ड्रियामा जम्मा हुने लिपोफिलिक धनायन हो, र सामान्य प्रोबले प्रयोग गर्ने उही तरङ्गदैर्ध्य पट्टीमा प्रकाश अवशोषण र उत्सर्जन गर्ने गाढा नीलो यौगिक हो। एउटै मापन नतिजाले यी सबै पक्ष समेट्न सक्दैन। बुडापेस्टका माइटोकन्ड्रियल अध्ययनहरूमा देखाइएको भरपर्दो ढाँचा भनेको अक्सिजन फ्लक्ससँगै ATP संश्लेषण दर, झिल्ली विभव र हाइड्रोजन पेरोक्साइडको निर्गमन मापन गर्नु हो, हरेक चरणमा रङ-विशिष्ट नियन्त्रण राखेर।

रेस्पिरोमेट्रीले अक्सिजन फ्लक्स मापन गर्छ, ऊर्जा उत्पादन होइन

Oroboros Oxygraph वा Seahorse बाह्यकोशिकीय फ्लक्स विश्लेषकबाट गरिने उच्च-विभेदन रेस्पिरोमेट्रीले एउटा कुरा देखाउँछ: अक्सिजन कति छिटो अपचय भइरहेको छ। यसले प्रति इलेक्ट्रोन कति प्रोटोन पम्प गरिए, कति प्रवणता कायम रह्यो वा ATP सिन्थेजले त्यसलाई प्रयोग गर्‍यो कि गरेन भन्ने देखाउँदैन।

शब्दावली महत्त्वपूर्ण छ। पृथक् माइटोकन्ड्रियामा ADP बिनाको सब्सट्रेटले चुहावट श्वसन दिन्छ, संतृप्ति स्तरको ADP सहितको सब्सट्रेटले अक्सिडेटिभ फस्फोराइलेसन क्षमता दिन्छ, र अनकप्लरको क्रमिक मात्रा परीक्षणले अधिकतम इलेक्ट्रोन स्थानान्तरण क्षमता दिन्छ। अक्षुण्ण कोशिकामा यसका Seahorse समकक्षहरू आधारभूत श्वसन, ओलिगोमाइसिन-संवेदनशील ATP-सँग सम्बन्धित श्वसन, प्रोटोन चुहावट, FCCP द्वारा निर्धारित अधिकतम श्वसन, र रोटेनोन तथा एन्टिमाइसिनप्रति प्रतिरोधी गैर-माइटोकन्ड्रियल अक्सिजन खपत हुन्। Seahorse का नतिजालाई अवस्था 3 र अवस्था 4 भन्नु भनेको त्यस प्रयोगात्मक तयारीले समर्थन नगर्ने सटीकता दाबी गर्नु हो, जसलाई Agilent को माइटो स्ट्रेस टेस्ट ढाँचा ले स्पष्ट पार्छ।

मेथिलिन ब्लुले बढी अक्सिजन र बढी ऊर्जाबीचको सहज रूपमा मानिने सम्बन्ध तोड्छ। पृथक् गिनी पिग मस्तिष्कका माइटोकन्ड्रियामा 100 nM देखि 1 uM रङले ग्लुटामेटसँग म्यालेट, सक्सिनेट र अल्फा-ग्लिसेरोफस्फेट सब्सट्रेट प्रयोग गर्दा विश्राम अवस्थाको अक्सिजन खपत बढायो। अल्फा-ग्लिसेरोफस्फेटमा वृद्धि करिब 64 प्रतिशत थियो, तर स्वस्थ माइटोकन्ड्रियामा ADP-उत्तेजित श्वसन मूलतः अपरिवर्तित रह्यो, पृथक् मस्तिष्क माइटोकन्ड्रियाको अध्ययन अनुसार। चुहावट बढ्दा ADP-उत्तेजित फ्लक्स स्थिर रहेकाले गणना गरिएको श्वसन नियन्त्रण अनुपात घट्छ। यो कमीले रङले माइटोकन्ड्रियालाई क्षति पुर्‍यायो भन्ने जनाउँदैन। यसको अर्थ रङले सामान्य श्वसनमाथि अक्सिजन खपत गर्ने रेडक्स चक्र थप्यो भन्ने हो। वृद्धि मात्र रिपोर्ट गर्ने मेथिलिन ब्लुको अक्सिजन खपत परीक्षणले वास्तविक रासायनिक प्रक्रिया मापन गरेको हुन्छ, तर ऊर्जा संरक्षणबारे केही बताएको हुँदैन।

पुनर्बहालीका प्रयोगले यही अन्तर ठूलो स्तरमा देखाउँछन्। कम्प्लेक्स I अवरुद्ध हुँदा अक्सिजन फ्लक्स करिब तीन गुणा पुनर्बहाल भयो, तर ATP संश्लेषण करिब 1.5 गुणा मात्र पुनर्बहाल भयो। बढी अक्सिजन इलेक्ट्रोडसम्म पुग्यो। त्यसको कम अंश ATP बनाउन उपयोग भयो। अक्सिडेटिभ फस्फोराइलेसनमा सुधार भएको कुनै पनि दाबीका लागि ATP पक्षको हिसाब पनि चाहिन्छ। आदर्श रूपमा यसलाई प्रति अक्सिजन ATP अनुपातका रूपमा व्यक्त गर्नुपर्छ र हरमा अक्सिजन कसरी गणना गरिएको हो भन्ने स्पष्ट गर्नुपर्छ।

ATP परीक्षणले संश्लेषण दर मापन गर्छ, जसको विकल्प कुल मात्रा हुन सक्दैन

ATP परीक्षणले फरक प्रश्नको उत्तर दिन्छ: प्रति एकाइ समयमा कति ATP उत्पन्न हुन्छ। केही मिनेटसम्म अनुगमन गरिएको जुनकिरी लुसिफेरेजको दीप्ति वा 340 nm मा मापन गरिएको हेक्सोकाइनेज र ग्लुकोज-6-फस्फेट डिहाइड्रोजेनेजको संयुक्त परीक्षणजस्तो गतिशील मापनले दर दिन्छ। अन्तिम बिन्दुमा गरिएको कुल ATP को एकल मापनले मात्रा दिन्छ, जसले संश्लेषणबाट खपत घटाउँदाको अवस्था देखाउँछ र एक्लैले अक्सिडेटिभ फस्फोराइलेसनबारे खासै बताउँदैन।

बुडापेस्ट समूहले एडेनिलेट काइनेजलाई दमन गरेर संयुक्त एन्जाइमिक विधि प्रयोग गर्‍यो र 1 देखि 2 uM मेथिलिन ब्लुले रोटेनोन-उपचारित तथा एन्टिमाइसिन-उपचारित माइटोकन्ड्रियामा ATP उत्पादन थोरै तर सांख्यिकीय रूपमा उल्लेखनीय ढङ्गले बढाएको पायो। त्यो वास्तविक पुनर्बहाली हो, र आंशिक हो। TEGDMA विषाक्तता अध्ययन ले फरक मोडेलमा यस्तै ढाँचाको उत्तर पायो: 5 mM दन्त मोनोमर TEGDMA ले कम्प्लेक्स I सँग सम्बन्धित श्वसनलाई करिब 286 बाट 28 फ्लक्स एकाइमा झार्‍यो, र 2 uM रङले त्यसलाई करिब 86 मा पुनर्बहाल गर्‍यो।

रङयुक्त रेडक्स यौगिकसँग दुई नियन्त्रण अनिवार्य हुन्छन्। पहिलो, मापन गरिएको ATP संश्लेषणको कति भाग ATP सिन्थेजमा निर्भर छ भनेर स्थापित गर्न ओलिगोमाइसिन प्रयोग गर्नुहोस्। दोस्रो, ज्ञात ATP, सम्पूर्ण अभिकर्मक र प्रयोगमा प्रयोग गरिएका ठ्याक्कै उही रङका सान्द्रता राखेर कोशिकारहित अवस्थामा थपिएको ATP को पुनर्प्राप्ति परीक्षण गर्नुहोस्। कम्तीमा 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM र 2 uM समावेश गर्नुहोस्। रङले उत्सर्जित प्रकाश अवशोषण गर्न, संकेत दिने एन्जाइमलाई अवरुद्ध गर्न वा अभिकर्मकको रेडक्स रसायन परिवर्तन गर्न सक्छ। सामान्य लुसिफेरेज परीक्षण मार्गदर्शन ले ठ्याक्कै यस प्रकारको हस्तक्षेपका लागि पूरक जैवरासायनिक परीक्षण सिफारिस गर्छ। प्रकाशीय संकेतको शमन प्रायः उच्च सान्द्रतामा बढी हुन्छ भन्दैमा 1 uM मा कृत्रिम मापन प्रभाव हुँदैन भन्ने नमान्नुहोस्।

झिल्ली-विभव प्रोबले रङको वितरण मापन गर्छन्, फ्लक्स होइन

साफ्रानिन O, TMRM र TMRE, रोडामिन 123 तथा JC-1 सबै झिल्ली पार गर्न सक्ने धनायन हुन्। विद्युत्-रासायनिक सन्तुलनअनुसार तिनीहरू ऋणावेशित म्याट्रिक्समा जम्मा हुन्छन्। त्यसैले समग्र प्रतिदीप्तिले प्रोब कहाँ छ भन्ने आधारमा विभव अप्रत्यक्ष रूपमा देखाउँछ। यीमध्ये कुनैले पनि ATP वा इलेक्ट्रोन फ्लक्स मापन गर्दैन।

हरेक प्रोबका लागि उपयुक्त प्रयोगात्मक तयारी फरक हुन्छ। साफ्रानिन O पृथक् माइटोकन्ड्रिया र पारगम्य बनाइएका कोशिकाका लागि उपयुक्त हुन्छ। सामान्यतः यसको सान्द्रता करिब 2 uM, उत्तेजन तरङ्गदैर्ध्य करिब 495 nm र उत्सर्जन तरङ्गदैर्ध्य करिब 585 nm हुन्छ। यसले शमन हुने अवस्थामा काम गर्छ, जहाँ प्रोबको प्रवेशले समग्र प्रतिदीप्ति परिवर्तन गर्छ। TMRM र TMRE अक्षुण्ण कोशिकामा कम न्यानोमोलर लोडिङ र शमन नहुने मोडमा उपयुक्त हुन्छन्। यस अवस्थामा विध्रुवीकरण हुँदा रङ बाहिर निस्कन्छ र माइटोकन्ड्रियाको प्रतिदीप्ति घट्छ; उच्च लोडिङमा स्व-शमनका कारण संकेतको दिशा उल्टिन सक्छ। JC-1 ले सुविधाजनक हरियो र रातो संकेतको अनुपात दिन्छ, तर यो लोडिङ र माइटोकन्ड्रियाको कुल परिमाणमा निर्भर हुन्छ। त्यसैले परिमाणात्मक कामका लागि यो सावधानीपूर्वक नियन्त्रित TMRM भन्दा कमजोर हुन्छ। यी लाभ र सीमाहरू व्यापक रूपमा प्रयोग हुने माइटोकन्ड्रियल झिल्ली-विभव प्रोबको समीक्षा मा सारांशित छन्।

मेथिलिन ब्लुले प्रयोगमा आउने सान्द्रतामै प्रकाशीय हस्तक्षेप गर्छ। 600 देखि 665 nm आसपासका यसको अवशोषण पट्टीहरू रातो प्रोबको उत्सर्जनसँग खप्टिन्छन्। त्यसैले आन्तरिक-फिल्टर प्रभाव, शमन र उत्तेजन प्रकाशको अवशोषण सबै सम्भाव्य छन्। यो रङ अर्को लिपोफिलिक धनायन पनि हो, जसको आफ्नै वितरण मापन भइरहेको विभवसँगै परिवर्तन हुन्छ। यसबाट जोगिने उपाय भनेको एकभन्दा बढी मापन र ब्ल्याङ्क नियन्त्रण प्रयोग गर्नु हो: प्रोब मात्र, रङ मात्र, प्रोबसँग रङको प्रत्येक सान्द्रता, शून्य सन्दर्भका रूपमा FCCP द्वारा पूर्ण विध्रुवीकरण, र सम्भव भए प्रकाशीय रूपमा फरक दोस्रो प्रोब। कम्प्लेक्स III बाइपास अध्ययन ले एन्टिमाइसिन र माइक्सोथायाजोल अवरोधपछि साफ्रानिन O र TMRM दुवै प्रयोग गरेर झिल्ली विभवको पुनर्बहाली दोहोर्‍याई उस्तै गुणात्मक पुनर्बहाली प्राप्त गरेर यो उदाहरण स्थापित गर्‍यो। एउटा प्रकाशीय रिपोर्टर सङ्केत हो। दुई स्वतन्त्र रिपोर्टर प्रमाण हुन्।

तीन प्रयोगात्मक तयारी, तीन फरक प्रश्न

पृथक् माइटोकन्ड्रिया, पारगम्य बनाइएका कोशिका र अक्षुण्ण कोशिका एउटै परीक्षणका साटासाट गर्न मिल्ने संवेदनशीलता सेटिङ होइनन्। तिनीहरू फरक सञ्चालन सिद्धान्त भएका फरक अवधारणा हुन्।

पृथक् माइटोकन्ड्रियाले इलेक्ट्रोन परिवहन शृङ्खला, भित्री झिल्ली र म्याट्रिक्सको कार्यप्रणाली जोगाउँछन्, तर प्लाज्मा झिल्ली, साइटोसोल र सञ्जाल संरचना हटाउँछन्। हटाउनु नै यसको उद्देश्य हो: सब्सट्रेट, ADP, अवरोधक र रङको सान्द्रता ठ्याक्कै निर्धारण गरिन्छन्, जसले गर्दा मार्ग पहिचान गर्न सकिन्छ। यसको बदलामा प्राकृतिक सब्सट्रेट आपूर्ति, संकेत सञ्चार र माग गुम्छन्।

पारगम्य बनाइएका कोशिकाले माइटोकन्ड्रियालाई तिनको धेरैजसो कोशिकीय संरचनाभित्रै राख्छन्, तर खोलिएको प्लाज्मा झिल्लीबाट बाह्य सब्सट्रेट र ADP भित्र जान दिन्छन्। कोशिकीय सन्दर्भभित्र सब्सट्रेट-मार्गको दोष पहिचान गर्न यी उपयुक्त साधन हुन्। अत्यधिक पारगम्यता बनाउँदा बाहिरी झिल्लीमा क्षति हुन्छ, र साइटोसोलको नियमन प्रणाली पखालिएर बाहिरिन्छ।

अक्षुण्ण कोशिकाले सबै कुरा जोगाउँछन्: प्लाज्मा झिल्लीको अवरोध, साइटोसोलका अपचायक, अन्तर्जात सब्सट्रेट परिवहन, माइटोकन्ड्रियल सञ्जाल र ATP को माग। यी शरीरक्रियात्मक अवस्थासँग सबैभन्दा नजिक र कार्यविधि छुट्याउने दृष्टिले सबैभन्दा टाढा हुन्छन्, किनभने रङको प्रवेश, अपचय र अलग क्षेत्रमा सञ्चय सबैले माइटोकन्ड्रियामा पुग्ने प्रभावकारी रङको मात्रा निर्धारण गर्छन्।

TEGDMA अध्ययनले जानाजान यी तीनै स्तर प्रयोग गर्‍यो: रङद्वारा अक्सिडेसन र विभवको पुनर्बहाली जाँच्न पृथक् मस्तिष्क माइटोकन्ड्रिया, दोष मुख्यतः कम्प्लेक्स I सँग सम्बन्धित सब्सट्रेट अक्सिडेसनमा छ भनेर पहिचान गर्न पारगम्य बनाइएका दन्त पल्प स्टेम कोशिका, र दबिएको अक्सिजन खपतमा 2 uM रङको समग्र शरीरक्रियात्मक प्रभाव जाँच्न अक्षुण्ण स्टेम कोशिका। फरक प्रयोगात्मक तयारीका माइटोकन्ड्रियल मापन नतिजा तुलना गर्ने पाठकका लागि, मेथिलिन ब्लुले श्वसन शृङ्खलामा इलेक्ट्रोन कसरी सार्छ भन्ने सहायक व्याख्याले मार्गको पृष्ठभूमि दिन्छ। मेथिलिन ब्लुका श्वसन अध्ययन बुझ्ने मार्गदर्शिकाले मात्रा र अवरोधक प्रयोगको तर्क समेट्छ।

रेडक्स-सक्रिय रङले माग्ने नियन्त्रणहरू

रेडक्स चक्रकारकका लागि सामान्य अवरोधकभन्दा लामो नियन्त्रण सूची चाहिन्छ, किनभने रङको मात्र रासायनिक प्रक्रियाले जैविक प्रभावजस्तै नतिजा देखाउन सक्छ।

रेस्पिरोमेट्रीका लागि मापनको क्रमिक विचलन जाँच्न बफर मात्र भएको चेम्बर, जैविक सामग्रीबिनाको बफर र रङ भएको चेम्बर, रङसँग परीक्षणमा उपस्थित कुनै पनि बाह्यकोशिकीय अपचायक, र अक्षुण्ण कोशिकामा गैर-माइटोकन्ड्रियल अक्सिजन खपत निर्धारण गर्न अन्त्यमा रोटेनोन र एन्टिमाइसिन प्रयोग गर्नुहोस्। ध्यान दिनुहोस्: अपचयित रङले अक्सिजनमा इलेक्ट्रोन सारेर हाइड्रोजन पेरोक्साइड बनाउँदै पुनः अक्सिडेसन हुन्छ। त्यसैले इलेक्ट्रोन दाताबिनाको रङ-मात्र ब्ल्याङ्कले NADH वा NADPH उपलब्ध भएपछि देखिने कोशिकारहित अक्सिजन खपतलाई वास्तविकभन्दा कम आँक्छ।

हाइड्रोजन पेरोक्साइडका लागि गैर-चयनात्मक DCFDA रङभन्दा क्यालिब्रेट गरिएको Amplex UltraRed र हर्सर्‍याडिस पेरोक्सिडेजलाई प्राथमिकता दिनुहोस्, क्याटालेजबाट पुष्टि गर्नुहोस् र प्रकाशमाथिको निर्भरता परीक्षण गर्नुहोस्, किनभने रङ प्रकाश-संवेदक हो। मस्तिष्क माइटोकन्ड्रियाको अध्ययनले केवल 100 nM रङमै पेरोक्साइडको भार चार गुणाभन्दा बढी बढेको र त्यसको निष्कासन सुस्ताएको पायो। पेरोक्साइड अपचयित रङबाट सिधै बन्यो, बीचमा सुपरअक्साइड नबनी। प्रोब छनोट र प्रकाश नियन्त्रणका विवरण रङसम्बन्धी प्रयोगमा प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजाति मापन गर्ने सहायक लेखमा छन्। पेरोक्साइडले कहिले संकेत र कहिले भारका रूपमा काम गर्छ भन्ने व्यापक प्रश्न कोशिकीय रेडक्स सन्तुलन र एन्टिअक्सिडेन्टसम्बन्धी दाबी सँगै समेटिएको छ।

मार्गसम्बन्धी दाबीका लागि कम्प्लेक्स III का दुवै अवरोधक स्थल परीक्षण गर्नुहोस्: Qi स्थलमा एन्टिमाइसिन A र Qo स्थलमा माइक्सोथायाजोल। साथै साइनाइडद्वारा कम्प्लेक्स IV को अन्त्य-बिन्दु परीक्षण गर्नुहोस्। पहिलेको मुसाको मस्तिष्क अध्ययनले रोटेनोनबाट अवरुद्ध श्वसनलाई रङले पुनर्बहाल गरेको, तर एन्टिमाइसिनबाट अवरुद्ध श्वसनलाई नगरेको रिपोर्ट गरेको थियो। पछिल्लो तीन-प्रजाति अध्ययनले भने दुवै अवरोधकसँग आंशिक पुनर्बहाली र साइटोक्रोम c को प्रत्यक्ष अपचयको प्रमाण पायो। बाइपासलाई स्थापित निष्कर्ष नभई नयाँ तथ्याङ्कसँग मिल्ने सम्भावनाका रूपमा लिनुहोस्, किनभने रङको सान्द्रता, अवरोधक स्थल, सब्सट्रेटको अवस्था र रङको वितरण सबैले देखिने मार्ग बदल्छन्।

परीक्षण-छनोट तालिका

प्रश्नका आधारमा मापन छान्न यो तालिका प्रयोग गर्नुहोस्, मापनका आधारमा प्रश्न छान्न होइन।

न्यूनतम विश्वसनीय दाबीका लागि रङका उही सान्द्रता, 100 nM, 300 nM, 1 uM र 2 uM, प्रयोग गरी चुहावट, ADP, ओलिगोमाइसिन र अनकप्लरका अवस्थामा अक्सिजन फ्लक्स; ATP संश्लेषण दर; सम्भव भएसम्म दुई प्रोबबाट झिल्ली विभव; र क्याटालेज तथा कोशिकारहित नियन्त्रणसहित क्यालिब्रेट गरिएको पेरोक्साइड निर्गमन मापन गर्नुपर्छ। परस्पर सम्बन्धित सम्पूर्ण समूह रिपोर्ट गर्नुहोस्: अक्सिजन फ्लक्स, ATP दर, प्रति अक्सिजन ATP, विभव र पेरोक्साइड। यीमध्ये कुनै एउटा सङ्ख्या एक्लै भनेको अर्थ खोजिरहेको मापन मात्र हो।