मेथिलिन ब्लुलाई एसिड-फास्ट काउन्टरस्टेनका रूपमा किन प्रयोग गरिन्छ

एक प्राविधिकले रञ्जनको सम्पूर्ण क्रम पूरा भएपछि खकारको स्मियर जाँच्छन्। नीलो क्षेत्रमा राता दण्डाकार जीवाणु स्पष्ट देखिन्छन्, र प्रतिवेदनमा एसिड-फास्ट दण्डाणु देखिएको उल्लेख गरिन्छ। भोलिपल्ट अर्को स्लाइडमा कुनै राता दण्डाकार जीवाणु नभएको एकनासको नीलो क्षेत्र देखिन्छ, र त्यसलाई क्षयरोगका लागि नेगेटिभ भनेर प्रतिवेदन गरिन्छ। यीमध्ये एउटा प्रतिवेदनले स्लाइडले समर्थन गर्नेभन्दा बढी दाबी गर्छ, र त्यो पहिलो प्रतिवेदन होइन।

यो भ्रम अवधारणासँग सम्बन्धित छ। प्राविधिकले नीलो रञ्जकलाई जीवाणु पत्ता लगाउने रासायनिक प्रक्रियाकै अंश ठाने, मानौँ मेथिलिन ब्लुले माइकोब्याक्टेरिया खोज्न मद्दत गर्छ। यसले त्यसो गर्दैन। मेथिलिन ब्लुले स्लाइडलाई छोउँदासम्म परीक्षण सकिइसकेको हुन्छ। रञ्जकले नतिजा पढ्न सकिने बनाउन पृष्ठभूमिलाई मात्र रङ्ग्याउँछ। यस लेखले एसिड-फास्ट रञ्जनमा मेथिलिन ब्लुको उद्देश्य, अरू रङको सट्टा नीलो नै किन प्रयोग गरिन्छ, र नीलो पृष्ठभूमिमा रातो देखिँदा के निष्कर्ष निकाल्न मिल्छ भन्ने व्याख्या गर्छ।

छोटो उत्तर

एसिड-फास्ट रञ्जन तीन अवधारणामा आधारित विभेदी परीक्षण हो। प्राथमिक रञ्जक कार्बोल फुक्सिनलाई मोमयुक्त माइकोब्याक्टेरियासहित हरेक कोषभित्र प्रवेश गराइन्छ। रङ हटाउने अभिकर्मक एसिड-अल्कोहलले सामान्य कोषबाट रातो रञ्जक हटाउँछ, तर एसिड-फास्ट कोषबाट निकाल्न सक्दैन। त्यसपछि काउन्टरस्टेन मेथिलिन ब्लुले रङ हटाइएको सबै सामग्रीलाई रङ्ग्याउँछ। यसैले गैर-एसिड-फास्ट कोष, आतिथेय कोष र अवशेष नीलो देखिन्छन्, जबकि एसिड-फास्ट दण्डाणु राता रहन्छन्। काउन्टरस्टेनले रङ्गभिन्नता दिन्छ। कोषलाई एसिड-फास्ट बनाउने रासायनिक प्रक्रियामा यसको कुनै भूमिका हुँदैन।

प्रत्येक चरणले के गर्छ

तलको चित्रले कामको विभाजन देखाउँछ। यसलाई कार्यविधिका रूपमा बायाँबाट दायाँ पढ्नुहोस्, र तलको पट्टीलाई प्रत्येक रञ्जन समूहले फरक प्रश्न सोध्छ भन्ने सम्झनाका रूपमा पढ्नुहोस्।

पहिले रञ्जकको प्रवेश हुन्छ। माइकोब्याक्टेरियाको आवरण असाधारण रूपमा जलविकर्षी भएकाले तिनले सामान्य जलीय रञ्जकको प्रतिरोध गर्छन्, त्यसैले कार्यविधिले रञ्जकलाई भित्र प्रवेश गराउँछ। Ziehl-Neelsen विधिमा बाफ आउने गरी तताउँदा फिनोलयुक्त कार्बोल फुक्सिन मोमयुक्त भित्ताबाट भित्र पस्छ। Kinyoun शीत विधिमा तापको सट्टा निकै बढी सान्द्र प्राथमिक रञ्जकको मिश्रण प्रयोग गरिन्छ, र केही परिमार्जित तापरहित विधिमा पृष्ठसक्रिय पदार्थ थपिन्छन्। अमेरिकन सोसाइटी फर माइक्रोबायोलोजीका एसिड-फास्ट रञ्जन कार्यविधिहरू मा दुवै मिश्रण सँगसँगै उल्लेख छन्, र तिनको सान्द्रतामा ठूलो अन्तर छ: ताप प्रयोग गर्ने विधिमा प्रति 100 mL करिब 0.3 g बेसिक फुक्सिन, जबकि शीत विधिमा करिब 4 g।

दोस्रो चरण विभेदन हो। एसिड-अल्कोहल, सामान्यतया 95 प्रतिशत इथानोलको 97 mL मा 3 mL सान्द्र हाइड्रोक्लोरिक एसिड मिसाइएको घोल, विशेष प्रतिरोध नदेखाउने भित्ता भएका हरेक कोषबाट रातो रञ्जक धुन्छ। अक्षुण्ण माइकोब्याक्टेरियल लिपिड आवरण भएका कोषले रञ्जकलाई समातिराख्छन्। सम्पूर्ण विधिको निर्णायक चरण यही हो, र तल चर्चा गरिएझैँ कार्यकौशलबाट सबैभन्दा बढी प्रभावित हुने चरण पनि यही हो।

अन्तिम चरण रङ्गभिन्नता हो। अब स्लाइडमा रङ हटाइएका कोषको लगभग रङहीन पृष्ठभूमिमा राता एसिड-फास्ट कोष रहन्छन्। 0.3 प्रतिशत w/v मेथिलिन ब्लुले रातोभन्दा अत्यन्त फरक रङ दिएर त्यो पृष्ठभूमिलाई फेरि देखिने बनाउँछ। काउन्टरस्टेन छोटो समयका लागि गरिन्छ, सामान्यतया ताप प्रयोग गर्ने विधिमा 20 देखि 30 सेकेन्ड र केही शीत-विधिका प्रकारमा केही मिनेटसम्म। यसको समय रञ्जकको आफ्नै गुणले होइन, कार्यविधिले निर्धारण गर्छ।

यही रञ्जक किन, र नीलो किन

मेथिलिन ब्लु धनायनिक बेसिक रञ्जक हो। यसको अर्थ यसको रङयुक्त आयनमा धनात्मक आवेश हुन्छ र यो रङ हटाइएका ब्याक्टेरिया, आतिथेय कोष र अवशेषका ऋणात्मक आवेशयुक्त सतहमा बाँधिन्छ। ओपनस्ट्याक्स सूक्ष्मजीवविज्ञान ले आवेशको यही तर्कलाई बेसिक रञ्जकहरूको सामान्य सिद्धान्तका रूपमा वर्णन गर्छ। तर यहाँ मेथिलिन ब्लु रासायनिक रूपमा अद्वितीय होइन। क्रिस्टल भायोलेट र स्याफ्रानिन पनि बेसिक रञ्जक हुन्। यो छनोट प्रकाशीय हो, रासायनिक होइन।

राता दण्डाकार जीवाणुलाई तिनभन्दा फरक रङको पृष्ठभूमि चाहिन्छ, र उज्यालो-क्षेत्र सूक्ष्मदर्शनमा नीलोले रातोसँग सबैभन्दा उपयोगी विरोधाभास दिन्छ। स्याफ्रानिन कमजोर काउन्टरस्टेन हुने थियो, किनकि यसको अन्तिम गुलाबी-रातो रङ कोषमा बाँकी रहेको कार्बोल फुक्सिनको रङसँग धेरै मिल्छ र प्रक्रियाले सिर्जना गरेको भिन्नता नै हराउँछ। क्रिस्टल भायोलेटले गाढा बैजनी पृष्ठभूमि दिन्थ्यो, जसले पातला राता दण्डाणुसँग ध्यान तान्न प्रतिस्पर्धा गर्थ्यो। यसको काम रासायनिक प्रक्रिया होइन, रङ्गभिन्नता दिनु हो भन्ने सबैभन्दा बलियो प्रमाण यसको प्रतिस्थापन हो: केही पशुचिकित्सकीय र परिमार्जित कार्यविधिमा म्यालाकाइट ग्रीन र ब्रिलियन्ट ग्रीनजस्ता हरिया काउन्टरस्टेन प्रयोग गरिन्छन् र परीक्षणले अझै काम गर्छ, किनकि स्पष्ट रूपमा फरक जुनसुकै रङले उही काम गर्छ।

यसबाट दुई व्यावहारिक निष्कर्ष निस्कन्छन्। पहिलो, मानक मिश्रणमा pH समायोजन तोकिएको हुँदैन; यो साधारण जलीय 0.3 प्रतिशत घोललाई लोफ्लरको मेथिलिन ब्लु जस्ता क्षारीय मिश्रणसँग नझुक्याउनुहोस्, किनकि ती फरक रञ्जन अवधारणाका हुन्। दोस्रो, अत्यधिक प्रयोगले हानि गर्छ। ऊतकविज्ञानसम्बन्धी साहित्यले विशेष रूपमा चेतावनी दिन्छ कि अत्यधिक गाढा नीलो पृष्ठभूमिले थोरै सङ्ख्यामा रहेका दण्डाणु छोप्न सक्छ। त्यसैले कार्यविधिले अनुमति दिएकोभन्दा बढी समय स्लाइडलाई रञ्जकमा भिजाएर राख्दा कुनै लाभबिना पढ्न सकिने स्पष्टता घट्छ।

परीक्षण सम्भव बनाउने कोषभित्ताको रसायन

एसिड-अल्कोहलले भेद छुट्याउन सक्नुको कारण माइकोब्याक्टेरियाको आवरणमा छ। यसको संरचनात्मक केन्द्र माइकोलिल-अरबिनोग्यालाक्टान-पेप्टिडोग्लाइकान जटिल संरचना हो: पेप्टिडोग्लाइकान अरबिनोग्यालाक्टानसँग जोडिएको हुन्छ, जसका बाहिरी छेउमा अत्यन्त लामो शृङ्खलाका माइकोलिक एसिड हुन्छन्। यसले असाधारण रूपमा कम पारगम्यता भएको, लिपिडयुक्त बाहिरी माइकोमेम्ब्रेन बनाउँछ। माइकोब्याक्टेरियाको बाहिरी झिल्लीसम्बन्धी समीक्षा ले यस संरचनाको विस्तृत वर्णन गर्छ। यो अवरोधले दुवै दिशामा काम गर्छ। यसले रञ्जकको प्रवेश रोक्छ, त्यसैले प्रवेशका लागि ताप वा बढी सान्द्र प्राथमिक रञ्जक आवश्यक हुन्छ। यसले रञ्जक निकाल्ने प्रक्रियाको पनि प्रतिरोध गर्छ, त्यसैले भित्र पुगिसकेको कार्बोल फुक्सिनलाई एसिड-अल्कोहलले हटाउन सक्दैन। सामान्य ब्याक्टेरियामा यो आवरण हुँदैन र तिनले रञ्जक गुमाउँछन्। त्यसैले एसिड-फास्ट गुणलाई फुक्सिन माइकोलिक एसिडसँग रासायनिक रूपमा बाँधिने प्रक्रिया भन्दा पनि लिपिड अवरोधको घटना भनेर बुझ्नु उपयुक्त हुन्छ।

यो रसायनले एउटा सामान्य अन्योल पनि स्पष्ट गर्छ: ग्राम विधिबाट माइकोब्याक्टेरिया कमजोर र अनिश्चित रूपमा रङ्गिन्छन्, कहिलेकाहीँ फिक्का मोतीको मालाजस्ता रूप वा रङ नलागेका अस्पष्ट आकृतिका रूपमा देखिन्छन्। तिनको जलविकर्षी भित्ताले क्रिस्टल भायोलेटको प्रवेश सीमित गर्छ। एसिड-फास्ट रञ्जन परिमार्जित ग्राम रञ्जन होइन। यो भित्ताको फरक गुणमा आधारित अलग विभेदी सिद्धान्त हो, जसरी अन्य दुई विधिका लागि सरल रञ्जन र ग्राम रञ्जनको तुलना ले देखाउँछ।

तीन विधि, तीन प्रश्न

एउटै रञ्जक प्रयोग गर्ने ब्याक्टेरियासम्बन्धी विधिहरूको विस्तृत समूहका लागि सूक्ष्मदर्शीय रञ्जन एटलस हेर्नुहोस्।

नीलो पृष्ठभूमिमा रातो देखिँदा के प्रमाणित हुँदैन

राता दण्डाकार जीवाणु देखिनुको अर्थ ती जीवले एसिड-अल्कोहलको प्रभावपछि पनि कार्बोल फुक्सिन कायम राखे भन्ने हो। यो निष्कर्ष Mycobacterium tuberculosis सँग मेल खान्छ, तर CDC को क्षयरोग निदान मार्गदर्शन ले अन्य माइकोब्याक्टेरिया पनि एसिड-फास्ट हुन्छन् भनेर स्पष्ट उल्लेख गर्छ। त्यसैले प्रजाति पहिचानका लागि रङ होइन, कल्चर र न्यूक्लिक एसिड परीक्षण आवश्यक हुन्छ।

प्राविधिक त्रुटिहरू मुख्यतः दुई धुने चरण वरिपरि हुन्छन्। अपर्याप्त रङ हटाइले पृष्ठभूमिका सामग्री राता छाड्छ र गलत पोजिटिभ व्याख्याको सम्भावना बढाउँछ। अत्यधिक रङ हटाइले कमजोर रूपमा कायम रहेको प्राथमिक रञ्जक पनि निकाल्छ र गलत नेगेटिभ नतिजामा योगदान गर्छ। अत्यधिक काउन्टरस्टेनले थोरै सङ्ख्यामा रहेका दण्डाणुलाई नीलो रङभित्र छोप्छ। बाक्ला स्मियर, अवक्षेप बनेका अभिकर्मक र दूषित पखाल्ने पानीले पनि आफ्नै कृत्रिम आकृतिहरू थप्छन्।

प्रविधि जतिसुकै सफा भए पनि संवेदनशीलता जीवाणुको सङ्ख्याले सीमित गर्छ। परम्परागत स्मियर सूक्ष्मदर्शनलाई प्रति मिलिलिटर खकारमा करिब 5,000 देखि 10,000 दण्डाणु आवश्यक पर्छ, र CDC का पुराना प्रमाण समीक्षाहरूले कल्चरबाट पुष्टि भएका फोक्सोको क्षयरोगका बिरामीमा स्मियरको संवेदनशीलता करिब 45 देखि 80 प्रतिशत देखाएका थिए। त्यसैले नेगेटिभ स्मियरले क्षयरोग नभएको कहिल्यै सुनिश्चित गर्दैन। हालको CDC मार्गदर्शनले हरेक स्मियरसँगै कल्चर पनि गर्न भन्छ र फोक्सोको क्षयरोगको सम्भावना विचार गरिएको तथा नतिजाले व्यवस्थापन बदल्ने अवस्थामा कम्तीमा एउटा श्वासप्रश्वाससम्बन्धी नमुनामा न्यूक्लिक एसिड एम्प्लिफिकेसन परीक्षण सिफारिस गर्छ।

व्यावहारिक काम आधिकारिक कार्यविधिअनुसार हुनुपर्छ

यस लेखसहितका शिक्षण विवरणहरूले चिकित्सकीय काम गर्ने अनुमति दिँदैनन्। प्रयोगशालामा काम गर्दा हालका CDC, APHL वा CLSI दस्तावेजसँग मिल्ने, प्रयोगशालाले प्रमाणीकरण गरेको मानक सञ्चालन कार्यविधि पालना गर्नुहोस्; CDC को Stacks अभिलेखमा राखिएको एसिड-फास्ट रञ्जन सन्दर्भ ले यस्ता कार्यविधिले अभिकर्मक र नतिजा पढ्ने तरिका कसरी तोक्छन् भन्ने देखाउँछ। क्षयरोगका नमुनामा काम गर्दा जैविक सुरक्षा नियन्त्रण आवश्यक हुन्छ: स्मियर तयार गर्दा एरोसोल र छिटा उत्पन्न हुने भएकाले जैविक सुरक्षा क्याबिनेटभित्र तयारी गरिन्छ। CDC को प्रयोगशाला सुरक्षा मार्गदर्शनले तापद्वारा स्थिर गरिएका स्मियरमा समेत जीवित क्षयरोगका दण्डाणु हुन सक्ने र तिनलाई अझै दूषित सामग्रीकै रूपमा सम्हाल्नुपर्ने उल्लेख गर्छ। M. leprae जाँचका लागि कार्बोल फुक्सिन र मेथिलिन ब्लुले रङ्ग्याइएको स्मियरसम्बन्धी CDC जनस्वास्थ्य चित्र पुस्तकालयको प्रविष्टि ले यो विधिको दायरा क्षयरोगभन्दा बाहिर पनि रहेको सम्झाउँछ: एसिड-फास्ट जीव खोजिने जहाँसुकै नीलो पृष्ठभूमिमा रातोको यही रङ्गभिन्नता उपयोगी हुन्छ, र सावधानीपूर्वक पढिएको नेगेटिभ नतिजा पनि अभिलेख गर्न योग्य नतिजा हो।

तयार स्लाइड पढ्ने तरिका

प्रारम्भिक जाँचमा काउन्टरस्टेनको उपयोगिता देखिन्छ। कम आवर्धनमा स्लाइड हेर्ने सूक्ष्मदर्शकले पहिले नीलो पृष्ठभूमिबाट स्मियरको गुणस्तर मूल्याङ्कन गर्छन्: कोषको समान वितरण, फोकस मिलाउन अक्षुण्ण आतिथेय कोष र धेरै अवक्षेप नभएको अवस्था। त्यसपछि सम्भावित राता जीवाणुले ध्यान तान्छन्, किनकि स्लाइडमा अरू कुनै सामग्री रातो हुँदैन। पुष्टि तेल इमर्सनमा गरिन्छ, जहाँ वास्तविक दण्डाणु एकनासका रञ्जक अवशेषको सट्टा अपेक्षित पातला, कहिलेकाहीँ अलिकति बाङ्गा वा मोतीको मालाजस्ता दण्डाकार रूपमा देखिन्छन्।

पृष्ठभूमिको रञ्जनले प्रतिवेदनको शब्दावली पनि निर्धारण गर्छ। राता दण्डाणु भएको स्लाइडलाई एसिड-फास्ट दण्डाणु देखिएको भनेर प्रतिवेदन गरिन्छ, प्रायः प्रयोगशालाको मापनक्रमअनुसार अर्धपरिमाणात्मक श्रेणीसहित। कुनै रातो जीव नदेखिएको स्लाइडलाई एसिड-फास्ट दण्डाणु नदेखिएको भनेर प्रतिवेदन गरिन्छ, क्षयरोगका लागि नेगेटिभ भनेर कहिल्यै होइन। यो भिन्नता महत्त्वपूर्ण छ, किनकि नीलो क्षेत्रले रञ्जनले काम गरेको, कोषले काउन्टरस्टेन ग्रहण गरेको र प्रकाशीय व्यवस्था पर्याप्त भएको प्रमाणित गर्छ, तर पत्ता लगाउन सकिने सीमाभन्दा तल रहेका जीवबारे केही बताउँदैन। राता जीव नदेखिएको नीलो क्षेत्र स्लाइडबारेको वैध नतिजा हो, बिरामीबारेको अन्तिम निर्णय होइन।

कामको विभाजन सम्झनुहोस्, अनि प्रतिवेदन लेख्न सजिलो हुन्छ। कार्बोल फुक्सिनले सम्भावित जीवाणु देखाउँछ। एसिड-अल्कोहलले परीक्षण गर्छ। मेथिलिन ब्लुले उत्तर पढ्न सकिने मात्र बनाउँछ: रातोले एसिडको प्रभावपछि पनि रञ्जक कायम राख्यो, नीलोले त्यसलाई गुमायो। बाँकी सबै कुरा—प्रजाति, जीवाणुको सङ्ख्या र चिकित्सकीय अर्थ—स्लाइडबाहिर गरिने कामबाट आउँछन्।