लोएफ्लरका क्षारीय र पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु अभिरञ्जकहरूको व्याख्या

अभिरञ्जन गर्ने कार्यमेजमा तीनवटा बोतल सँगसँगै राखिएका हुन सक्छन्, प्रत्येकमा मेथिलिन ब्लुको कुनै न कुनै प्रकारको लेबल हुन्छ। एउटामा जलीय मेथिलिन ब्लु 1% लेखिएको हुन्छ। अर्कोमा लोएफ्लरको क्षारीय मेथिलिन ब्लु लेखिएको हुन्छ। तेस्रोमा पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु लेखिएको हुन्छ। व्यस्त कर्मचारीले सबैभन्दा नजिकको बोतल उठाउँछन्। त्यसपछि स्मियरमा रङ अत्यन्त फिक्का देखिन्छ, वा सबैतिर उस्तै नीलो हुन्छ, वा अप्रत्याशित बैजनी छायाहरू देखिन्छन्, र नतिजाको दोष नमुनालाई दिइन्छ।

यो सूत्रीकरणको समस्या हो, नमुनाको होइन। यी तीन घोलमा आपसमा सम्बन्धित रङद्रव्य हुन्छन्, तर तिनले फरक अभिरञ्जन अवधारणा अपनाउँछन्। एउटा लगभग तटस्थ pH मा रहेको साधारण धनायनिक रङद्रव्य हो। अर्कोमा त्यही रङद्रव्यलाई क्षारद्वारा अझ प्रबल बनाइएको हुन्छ। तेस्रो भने एउटै रङद्रव्य मात्र नभएर जानाजानी अक्सिडेसन गरिएको मिश्रण हो। गलत घोल प्रयोग गर्दा तपाईंले अपनाइरहेको अभिरञ्जनको सिद्धान्त नै बदलिन्छ।

छोटो उत्तर

साधारण जलीय मेथिलिन ब्लु आधारभूत विकल्प हो: पानीमा करिब 1% रङद्रव्य, जुन ब्याक्टेरियाको आकारिकी र सामान्य सूक्ष्मदर्शी परीक्षणका लागि प्रयोग हुने सरल धनायनिक अभिरञ्जक हो। लोएफ्लरको क्षारीय मेथिलिन ब्लुमा पानीले पातलो बनाइएको अल्कोहलयुक्त मूल घोलमा पातलो क्षारको थोरै, मापन गरिएको मात्रा थपिन्छ। यसले pH बढाउँछ र धनायनिक रङद्रव्यलाई ब्याक्टेरियाका अम्लीय संरचनाहरूमा अझ बलियोसँग बाँधिन प्रेरित गर्छ। पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु भने क्षारीय वातावरणमा अक्सिडेसन गरेर जानाजानी परिपक्व बनाइएको मेथिलिन ब्लु हो। त्यसैले बोतलमा बाँकी मेथिलिन ब्लुसँगै मिथाइल समूह हटाइएका समजातीय यौगिकहरू (azure A, azure B, azure C), थायोनिन र मेथिलिन भायोलेटको मिश्रण हुन्छ, र यस मिश्रणले फरक संरचनाहरूलाई फरक रङछटामा रङ्गाउँछ।

एउटा मात्र वाक्य सम्झनुहुन्छ भने: क्षारीकरणले अभिरञ्जनको तीव्रता बदल्छ, जबकि पोलिक्रोम बनाउने प्रक्रियाले अभिरञ्जनका रङहरू बदल्छ।

साधारण जलीय मेथिलिन ब्लु: तुलना गर्ने आधार

सबैभन्दा सरल सूत्रीकरण भनेको पानीमा घोलिएको मेथिलिन ब्लु हो, सामान्यतया 1% w/v मा, क्षार नथपिएको र अक्सिडेसन नगरिएको। यसको रङ दिने रासायनिक रूप क्लोराइड प्रतिआयनसहितको मिथाइलथायोनिनियम धनायन हो। यो सानो, समतल फेनोथायजिन रङद्रव्यलाई PubChem को मेथिलिन ब्लुसम्बन्धी अभिलेख मा मिथाइलथायोनिनियम क्लोराइड भनेर वर्णन गरिएको छ। धनायन भएकाले यो न्यूक्लिक अम्लका फस्फेट शृङ्खला र ब्याक्टेरियाका कोशिका भित्तामा रहेका अम्लीय समूहहरूसँग बाँधिन्छ, जसले हल्का पृष्ठभूमिमा कोशिकाहरूलाई नीलो बनाउँछ।

यसको विशेषता भनेको पूर्वानुमान गर्न सकिने नतिजा हो। केन्द्रक र ब्याक्टेरिया नीलो देखिन्छन्। दृश्य भिन्नता मध्यम हुन्छ। कम स्पष्ट देखिने सूक्ष्मजीवमा रङ कमजोर पर्न सक्छ, र लोएफ्लरले समाधान गर्न खोजेको सीमा यही थियो। यो घोल पर्ने सरल ब्याक्टेरियाली अभिरञ्जकहरूको व्यापक समूहबारे बुझ्न ब्याक्टेरियाको सरल अभिरञ्जनको समग्र परिचय हेर्नुहोस्। यहाँ पनि सही पहिचानमा ध्यान दिनु महत्त्वपूर्ण छ: मिथाइल ब्लु पूर्ण रूपमा फरक अणु हो, जसबारे मिथाइल ब्लु र मेथिलिन ब्लुको तुलना मा व्याख्या गरिएको छ। त्यसैले रङको नामका आधारमा मात्र सूचीमा खोज्दा गलत वर्गको रङद्रव्य प्राप्त हुन सक्छ।

लोएफ्लरको क्षारीय मेथिलिन ब्लु: उही रङद्रव्य, अझ प्रबल प्रभाव

लोएफ्लरको परम्परागत सूत्रमा अल्कोहलयुक्त मेथिलिन ब्लुको मूल घोललाई पानीमा रहेको पातलो क्षारसँग मिसाइन्छ। पाठ्यपुस्तकका सूत्रअनुसार 95% इथानोलको 30 mL मा 0.3 g रङद्रव्य घोलेर त्यसमा 0.01% जलीय पोटासियम हाइड्रोक्साइडको 100 mL थपिन्छ। अथवा समान विकल्पका रूपमा संतृप्त अल्कोहलयुक्त मेथिलिन ब्लुको 30 mL, आसुत पानीको 100 mL र 1% KOH को 1 mL प्रयोग गरिन्छ। यसबाट स्पष्ट रूपमा क्षारीय pH भएको, करिब 0.3% रङद्रव्ययुक्त प्रयोगयोग्य घोल प्राप्त हुन्छ। व्यावसायिक संस्करणहरूले पनि यही सिद्धान्त अपनाउँछन्। Thermo Fisher को सूक्ष्मजीवविज्ञान अभिरञ्जक सूची मा लोएफ्लरको क्षारीय मेथिलिन ब्लु, पोलिक्रोम र जलीय प्रकारहरूलाई फरक निर्धारित प्रयोग भएका छुट्टाछुट्टै उत्पादनका रूपमा राखिएको छ।

यसको मुख्य आधार क्षार हो। pH बढाउँदा नमुनाका कार्बोक्सिल र फस्फेट समूहबाट प्रोटोन हट्छन् र ऋणात्मक स्थानहरूको घनत्व बढ्छ। साथै, अल्कोहलयुक्त मूल घोलले रङद्रव्यलाई पूर्ण रूपमा घुलित राख्छ, जसले गर्दा यो ती स्थानमा एकल-अणु रूपमा पुग्छ। नतिजास्वरूप तटस्थ जलीय रङद्रव्यको तुलनामा ब्याक्टेरिया छिटो र गाढा रङ्गिन्छन्, र नियमित ब्याक्टेरियाली स्मियरमा देखिने परिचित गाढा नीलो दण्डाकार तथा गोलाकार ब्याक्टेरिया देखिन्छन्। अभिरञ्जन समय सामान्यतया एकदेखि तीन मिनेट हुन्छ, त्यसपछि पानीले पखालिन्छ।

यसको परम्परागत प्रयोग लोएफ्लर सिरम माध्यममा हुर्काइएको कोरिनेब्याक्टेरियम डिफ्थेरियामा हुन्छ: पातला, प्रायः एक छेउमा फुकेका दण्डाकार ब्याक्टेरिया, जसमा सञ्चित पोलिफस्फेटका मेटाक्रोमेटिक बाबेस–अर्न्स्ट कणहरू गाढा रङ्गिन्छन्। माध्यम र अभिरञ्जकको यो संयोजन ऐतिहासिक हो; दुवैको श्रेय एउटै ब्याक्टेरियाविज्ञलाई दिइन्छ, र कणहरू स्पष्ट छुट्टिनु यसको निदानात्मक लाभ हो। डिफ्थेरियासम्बन्धी कामबाहेक यो अभिरञ्जक संवर्धनबाट तयार गरिएका स्मियरहरूको सामान्य ब्याक्टेरियाली अभिरञ्जनमा, क्लिनिकल स्मियरमा नाइसेरियाको आकारिकी हेर्न, र ग्राम अभिरञ्जन आवश्यक नभए पनि साधारण जलीय नीलो रङ अत्यन्त फिक्का हुने अवस्थामा प्रयोग गरिन्छ। यो एकरङ्गी अभिरञ्जक हो। सबै अम्लीय संरचना नीलोको कुनै न कुनै छायामा रङ्गिन्छन्। कुनै कार्यविधिले रङका आधारमा भेद छुट्याउनुपर्ने माग गरेमा क्षारले मात्र त्यो पूरा गर्न सक्दैन।

एउटा व्यावहारिक सावधानी: क्षारीय रङद्रव्य घोलहरू भण्डारण र कार्बन डाइअक्साइड सोस्ने क्रममा बिग्रन्छन् र अवक्षेप बनाउँछन्। त्यसैले प्रयोगशालाहरूले सीमित मात्रामा घोल तयार गर्छन्, वा सूचीमा उपलब्ध घोल किनेर त्यसको भण्डारण आयु पालना गर्छन्। हरेक स्लाइडमा तलछट खसाल्न थालेको पुरानो बोतललाई जसोतसो चलाइराख्नु उचित हुँदैन।

पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु: एउटै नाम, धेरै रङद्रव्य

पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु पनि उही रङद्रव्यबाट सुरु हुन्छ, तर यसलाई क्षारमा नियन्त्रित अक्सिडेसन गरिन्छ। ऐतिहासिक रूपमा यसलाई परिपक्व बनाउने वा पोलिक्रोम बनाउने प्रक्रिया भनिन्थ्यो। क्षारीय घोललाई समय दिएर राख्ने, कार्बोनेटसँग तताउने वा डाइक्रोमेटजस्ता पदार्थले अक्सिडेसन गर्ने प्रक्रियाले डाइमिथाइलअमिनो प्रतिस्थापी समूहहरूबाट चरणबद्ध रूपमा मिथाइल समूह हटाउँछन्। उत्पादन एउटा मिश्रण हुन्छ: बाँकी मेथिलिन ब्लुसँगै azure B (एउटा मिथाइल हटेको), azure A र azure C (थप मिथाइल समूह हटेका), थायोनिन (सबै मिथाइल समूह हटेका) र मेथिलिन भायोलेट समूहका अक्सिडेसनजन्य सहउत्पादनहरू। प्रत्येक घटकको आफ्नै रङछटा र ऊतकप्रतिको आकर्षण हुन्छ। त्यसैले मिश्रणले मेटाक्रोमेटिक अभिरञ्जन गर्छ: केन्द्रक, कण, म्युसिन र उपास्थि प्रत्येकले नीलोदेखि रातो-बैजनीसम्मका फरक छायाहरू ग्रहण गर्छन्।

यो रसायनप्रक्रिया प्रसिद्ध रक्त अभिरञ्जकहरूको आधार पनि हो। प्रारम्भिक अनुसन्धानकर्ताहरूले क्षारीकरण गरिएको मेथिलिन ब्लुले मलेरियाका परजीवीका केन्द्रकलाई बैजनी छायामा रङ्गाउने पत्ता लगाए। तर उनीहरूका जलीय परिपक्व घोलहरू अस्थिर थिए र केही दिनमै अवक्षेप बन्थ्यो। बैजनी रक्त अभिरञ्जक कसरी आविष्कार भयो भन्ने समीक्षाले मालाखोव्स्की र रोमानोव्स्कीले 1891 मा स्वतन्त्र रूपमा यो प्रभाव कसरी उपयोग गरे, रङद्रव्यको अवक्षेपलाई स्थिर बनाउन र ताप नदिई स्मियर तह स्थिरीकरण गर्न मेथानोल कसरी प्रयोगमा ल्याइयो, र पछि गिम्साले मापन गरिएको azure B र इओसिनको मिश्रणलाई ग्लिसेरोलद्वारा स्थिर बनाएर कसरी मानकीकरण गरे भन्ने वर्णन गर्छ। आधुनिक गिम्सा-प्रकारका अभिरञ्जकहरू पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु र इओसिनको संयोजनबाट सीधै विकसित भएका हुन्। यही संयोजनले रोमानोव्स्की प्रभाव उत्पन्न गर्छ। इओसिनसँगको संयोजन र azure B घटकबारे विस्तारमा जान्न रोमानोव्स्की-प्रकारका अभिरञ्जक र azure B–इओसिनको अन्तरक्रिया हेर्नुहोस्।

मिश्रण भएकाले यी तीनमध्ये पोलिक्रोम मेथिलिन ब्लु स्वभावतः सबैभन्दा कम मानकीकृत हुन्छ। यसको रङछटाको वास्तविक सन्तुलन अक्सिडेसनको विधि र हदमा निर्भर हुन्छ। त्यसैले ऊतकविज्ञान सामग्रीका आपूर्तिकर्ताले यसलाई पुरानो लोएफ्लर घोलका रूपमा नभई आफ्नै कार्यसम्पादन परीक्षण भएको छुट्टै उत्पादनका रूपमा बेच्छन्। सामान्य प्रयोगहरूमा मास्ट कोशिकाका कण, म्युसिन र उपास्थिको मेटाक्रोमेटिक प्रदर्शन, प्लाज्मा कोशिकाका सूक्ष्म विवरण, र गुडपास्चर-प्रकारका पोलिक्रोम विधिद्वारा ऊतक खण्डमा हेलिकोब्याक्टर पाइलोरी देखाउनु पर्छन्। रङका आधारमा भेद छुट्याउनु उद्देश्य भए यो सही विकल्प हो। तर कार्यविधिले ब्याक्टेरियाको स्पष्ट एकरङ्गी आकृति अपेक्षा गर्छ भने यो गलत विकल्प हो।

सूत्रीकरण र उद्देश्यको तुलना

तालिकालाई निर्णय गर्ने प्रक्रियाका रूपमा पढ्नुहोस्। नमुनामा रङ अत्यन्त फिक्का लाग्छ भने pH सम्बन्धी अवधारणा बदल्नुहोस् र लोएफ्लरको घोल रोज्नुहोस्। सबै संरचना रङ्गिन्छन् तर कुनै पनि छुट्टै देखिँदैनन् भने रङद्रव्यसम्बन्धी अवधारणा बदल्नुहोस् र पोलिक्रोम रोज्नुहोस्। लोएफ्लर स्मियरमा कणहरू राम्ररी देखिए पनि पर्यवेक्षकले केन्द्रक र कोशिकाद्रव्य किन उस्तै नीलो छन् भनेर सोधेमा, उत्तर यो हो कि कुनै पनि क्षारीय एकरङ्गी अभिरञ्जकले तिनलाई फरक रङमा छुट्याउन सक्दैन। त्यो आवश्यकता पोलिक्रोम समूह र त्यसबाट विकसित रक्त अभिरञ्जकहरू सँग सम्बन्धित छ।

सामान्य भ्रमहरूबाट बच्ने उपाय

अधिकांश भ्रम दुईवटा गल्तीबाट उत्पन्न हुन्छन्। पहिलो, बोतलमा दुवै नीलो देखिने भएकाले लोएफ्लरको घोल र साधारण मेथिलिन ब्लुलाई एकअर्काको सट्टा प्रयोग गर्न मिल्छ भन्ने ठान्नु। तिनको pH र तीव्रता फरक हुन्छ। लोएफ्लर निर्दिष्ट गरिएको ठाउँमा तटस्थ रङद्रव्य प्रयोग गर्दा कार्यविधिको मुख्य उद्देश्य रहेको कणहरूको स्पष्ट भिन्नता नै हराउँछ। दोस्रो, जुनसुकै पुरानो वा अनायासै लामो समय राखिएको क्षारीय नीलो घोललाई पोलिक्रोम मान्नु। अनियन्त्रित रूपमा पुरानो हुँदै गएको घोलले अज्ञात सान्द्रताको अज्ञात मिश्रण बनाउँछ। वास्तविक पोलिक्रोम घोल भने निर्धारित अक्सिडेसन विधिबाट तयार गरिन्छन् र रक्त अभिरञ्जकहरूको विकासक्रममा मापन गरिएको इओसिनसँग मिसाइन्छन्। यहाँ इतिहास शिक्षाप्रद छ: 1890s का अस्थिर जलीय परिपक्व घोलहरूको स्थान मेथानोलयुक्त स्थिर सूत्रीकरणले लिनुको कारण अनियन्त्रित मिश्रणबाट उस्तै नतिजा पुनः प्राप्त गर्न नसकिनु नै थियो। कति पुरानो हो भन्ने निश्चित नभएको बोतलबाट निदानात्मक स्लाइड रङ्गाउनुअघि यो पाठ सम्झनु उपयोगी हुन्छ।

नाम र पहिचानमा सावधानी अपनाउँदा यो भ्रम टुङ्गिन्छ। रङ हेरेर अनुमान गर्नुको सट्टा लेबलमा सूचीबद्ध उत्पादनको प्रकार (जलीय, लोएफ्लर वा पोलिक्रोम), रङद्रव्यको मात्रा र निर्धारित प्रयोग पुष्टि गर्नुहोस्। यी तीन सूत्रीकरणको रङ दिने अणुसंरचनाको मूल एउटै हो। तिनको उद्देश्य भने एउटै होइन।