Metylenblått og ATP: betyr høyere oksygenforbruk mer energi?

Et isolert mitokondrium ligger i et kammer med brensel, men uten ADP. Det forbruker oksygen langsomt. Tilsett ADP, og oksygenforbruket øker flere ganger. Vent til ADP er brukt opp, og oksygenforbruket faller tilbake. Brenselet endret seg aldri. Bare behovet for ATP gjorde det.

Denne korte sekvensen rommer hele skillet denne artikkelen handler om. Oksygenforbruk måler hvor raskt elektroner strømmer gjennom respirasjonskjeden til oksygen. ATP-produksjon måler hvor mye av denne strømmen som fanges opp som brukbar energi. De to har et felles mellomtrinn: protongradienten over den indre mitokondriemembranen. Alt som endrer hvor tett gradienten er koblet til ATP-syntesen, kan få de to endepunktene til å bevege seg i ulike retninger. Metylenblått er et nyttig læremiddel her, fordi begge deler er observert: økt oksygenforbruk sammen med økt ATP i noen preparater, og økt oksygenforbruk mens ATP forblir uendret eller faller i andre.

Lesere som først vil ha det større bildet av elektronoverføringen, kan begynne med hvordan metylenblått transporterer elektroner gjennom respirasjonskjeden. Lesere som vil lære begrepene fra de tidlige oksygenforsøkene, kan lese om hva de første respirasjonsmålingene faktisk viste.

Respirasjon, ATP og gradienten mellom dem

Elektroner fra NADH og FADH2 går inn i kjeden ved kompleks I og II, passerer gjennom kompleks III til cytokrom c og deretter gjennom kompleks IV til oksygen. Energien som frigjøres ved kompleks I, III og IV, pumper protoner ut av matriksen og inn i rommet mellom membranene. Denne forskjellen i ladning og surhetsgrad utgjør den protonmotoriske kraften. Den elektriske delen, membranpotensialet, er vanligvis den dominerende.

ATP-syntase lar protoner strømme tilbake inn i matriksen og bruker den frigjorte energien til å koble sammen ADP og fosfat til ATP. Kjeden er altså:

oksygenforbruk, deretter protonpumping, deretter gradient, deretter ATP-syntese.

Problemet er at protoner kan returnere via andre veier. Enhver retur som går utenom ATP-syntase, er protonlekkasje. Lekkasjen tvinger kjeden til å pumpe de samme protonene på nytt for å holde membranpotensialet stabilt. Det forbruker mer oksygen uten å produsere mer ATP. En tilstrekkelig kraftig lekkasje innebærer frakobling: oksygenforbruket øker mens ATP forblir uendret eller faller, og energien som går til spille, avgis som varme.

Tilstand 3, tilstand 4 og respirasjonskontrollforholdet

De klassiske begrepene for dette stammer fra isolerte mitokondrier. Tilstand 3 er respirasjon med både substrat og ADP til stede: ATP-syntase tapper gradienten, membranpotensialet synker, kjeden øker tempoet for å bygge det opp igjen, og oksygenforbruket er høyt fordi ATP produseres. Tilstand 4 er respirasjon etter at ADP er brukt opp: ATP-syntase går på tomgang, gradienten øker, det høye membranpotensialet motvirker videre pumping, og oksygenforbruket faller til det nivået som trengs for å kompensere for lekkasje.

Respirasjonskontrollforholdet, tilstand 3 delt på tilstand 4, viser derfor hvor tett koblet preparatet er. Et høyt forhold betyr at ADP styrer respirasjonen i stor grad. Et fallende forhold samtidig som tilstand 4 øker, betyr at lekkasje tar over. Dette er perspektivet som gjør resultatene med metylenblått nedenfor forståelige.

Én tankemodell er verdt å beholde. Høyt membranpotensial bremser kjeden. Når potensialet svekkes, øker tempoet. Kjeden reagerer på hvor krevende pumpingen har blitt, ikke direkte på om ATP produseres.

Når endepunktene følger hverandre

Det tydeligste eksemplet på kobling kommer fra isolerte mitokondrier fra marsvinhjerne med blokkerte respirasjonskomplekser. Ved 100 nanomolar til 1 mikromolar metylenblått økte oksygenforbruket i hvile med glutamat pluss malat, suksinat eller glyserofosfat som brensel, mens ADP-stimulert respirasjon var uendret. I mitokondrier der kompleks I eller kompleks III var forgiftet, økte fargestoffet ATP-produksjonen moderat, gjenopprettet membranpotensialet og forbedret kalsiumopptaket. Den foreslåtte ruten er en snarvei: fargestoffet tar imot elektroner oppstrøms for blokkeringen og overfører dem til cytokrom c, slik at det skadede komplekset omgås.

Et annet tilfelle der endepunktene følger hverandre, bruker en helt annen ATP-kilde. I isolerte hjernemitokondrier med hemmet ATP-syntase stimulerte metylenblått fortsatt respirasjonen med alle substratene som ble testet. Men ATP-syntesen økte bare med alfa-ketoglutarat og glutamat, de to substratene som danner suksinyl-CoA. Når oligomycin blokkerte ATP-syntase, kom det ekstra ATP-et fra substratnivåfosforylering via suksinyl-CoA-ligase i sitronsyresyklusen, ikke fra oksidativ fosforylering. Fargestoffet gjenopprettet også membranpotensialet når kompleks I og ATP-syntase ble hemmet samtidig. Her fulgte oksygenforbruk og ATP hverandre, men bare når substratet muliggjorde den andre veien til ATP. Med suksinat eller malat økte respirasjonen uten ekstra ATP. Samme fargestoff, samme kammer, forskjellig brensel, forskjellig svar.

Når endepunktene skiller lag

Tilfellene der endepunktene skiller lag, er like godt publisert og like lærerike. I en studie fra 1997 av isolerte mitokondrier fra rottelever økte metylenblått respirasjonen i tilstand 4 i tett koblede mitokondrier som respirerte med suksinat. Det drev respirasjonskontrollforholdet ned. Effekten var synlig fra 0.5 mikromolar og kraftig ved 5 mikromolar, en konsentrasjon nær plasmanivåene etter en intravenøs bolus på 100 milligram. Ved 5 mikromolar svulmet mitokondriene også opp, men svikten i koblingen oppstod først ved lavere konsentrasjoner. Det taler for at lekkasjen kom før den strukturelle skaden, snarere enn som følge av den. I frakoblede mitokondrier stimulerte fargestoffet respirasjonen på en metningsbar, konsentrasjonsavhengig måte. Oksygenforbruket økte i begge preparatene. ATP-syntesen per forbrukt oksygen gjorde det ikke. Dette er et skoleeksempel på frakobling kombinert med elektrontransport, i samme molekyl.

Det mest slående skillet kommer fra netthinnen. Hos mus med AIF-mangel og i rotenonbehandlede fotoreseptorceller bevarte metylenblått netthinnens tykkelse, fotoreseptormarkører og mitokondriestruktur. Det senket også forholdet mellom NADH og NAD og dempet stressmekanismer, blant annet responsen på ufoldede proteiner og mitofagi. Dette skjedde uten at ATP-underskuddet ble rettet opp. Beskyttelse uten gjenopprettet energi betyr at fordelen kom via redoksbalanse og mitokondrienes integritet, ikke via ekstra ATP. Den som setter likhetstegn mellom vevets overlevelse og gjenopprettet energiproduksjon, ville feiltolke dette forsøket fullstendig.

Arbeidet med hjernemitokondrier legger en kostnadspost til det samme regnskapet. De samme lave konsentrasjonene som forbedret bioenergetikken, økte også produksjonen av hydrogenperoksid under alle de testede betingelsene og bremset fjerningen av det. Dette ble målt med en kalibrert Amplex-analyse, ikke med et uspesifikt fargestoff. Mer ATP og mer oksidant kom sammen.

En praktisk sjekkliste for lesing

Fire spørsmål skiller et koblet resultat fra et frakoblet.

For det første: Hvilket endepunkt ble faktisk målt? Oksygenforbruk alene kan ikke si noe om ATP. ATP-syntese, membranpotensial og respirasjonskontrollforhold bidrar hver med en brikke som oksygenelektroden ikke kan se. Veiledningen til å lese påstander fra forskning på metylenblått går grundig gjennom denne disiplinen rundt endepunkter.

For det andre: Hvilket substrat fikk mitokondriene? Resultatet med suksinyl-CoA viser at valget av brensel kan avgjøre om ekstra respirasjon i det hele tatt kan bli til ekstra ATP.

For det tredje: Hvilken konsentrasjon ble brukt? Metylenblått i nanomolare til lave mikromolare konsentrasjoner ga beskjedne bioenergetiske gevinster i hjernemitokondrier, men med en oksidantkostnad. En halv mikromolar og mer svekket koblingen i levermitokondrier; ved 5 mikromolar kom oppsvulming i tillegg. Konsentrasjonen er en del av mekanismen, ikke en bakgrunnsdetalj.

For det fjerde: Hvilken modell ga resultatet? Isolerte mitokondrier avdekker koblingene, men intakte celler og vev tilfører transport, reduksjon til den fargeløse formen og konkurrerende mottakere av elektroner. Arbeid med dosering i laboratoriet, blant annet hvordan konsentrasjon og protokoll former effektene av metylenblått, er broen mellom tall fra kammeret og enhver påstand om et menneske.

Oksygenforbruk viser elektronstrøm. ATP viser hvor mye av denne strømmen som ble fanget opp. Metylenblått kan endre begge deler, og forsøkene ovenfor viser alle de fire kombinasjonene som følger: begge øker, respirasjonen øker bare der substratet tillater det, respirasjonen øker mens koblingen svekkes, og vevet bevares mens ATP forblir uendret. Tallet på oksygenelektroden er starten på tolkningen, ikke slutten.