Metylenblått og hormese: hvorfor dose–respons-kurver kan skifte retning

En rotte får 4 milligram per kilogram metylenblått etter å ha lært å gjenkjenne en gjenstand, og neste dag husker den. En annen rotte får 50, og den beveger knapt løpehjulet sitt. Molekylet er det samme. Retningen på effekten er det ikke. Alle som har lest mer enn noen få artikler om metylenblått, har støtt på denne reverseringen, og den har et navn: hormese, en bifasisk respons der lave og høye eksponeringer påvirker det samme endepunktet i motsatte retninger.

Navnet er bare nyttig hvis du vet hva det lover, og hva det ikke lover. Denne artikkelen går gjennom fire publiserte datasett om metylenblått, hvert med sitt eget endepunkt, konsentrasjonsområde og forsøksoppsett, og viser hvorfor fargestoffets kjemi gjør slike reverseringer plausible. Den avsluttes med advarselen som dataene krever: En kurve som topper seg i ett forsøk, er en beskrivelse av det forsøket, ikke en metode for å velge en personlig dose.

Mønsteret har et navn, og navnet er snevrere enn det høres ut

Begrepet hormese ble innført i 1943 av Southam og Ehrlich og fikk sin moderne kvantitative form av Calabrese og Baldwin: en adaptiv bifasisk respons som oppstår direkte eller gjennom kompensasjon etter at homeostasen er forstyrret. Legg merke til hva som mangler i den definisjonen. Ordet gunstig forekommer ikke. Hormese sier at kurven skifter retning, ikke noe mer.

Formen du ser, avhenger av hvilket endepunkt som står på den vertikale aksen. Når endepunktet er en positiv funksjon, som enzymaktivitet, oksygenforbruk eller hukommelsesskår, gir stimulering ved lav dose etterfulgt av hemming ved høy dose en omvendt U. Når endepunktet er noe uønsket, som sykdomsforekomst, gir reduksjon ved lav dose etterfulgt av økning ved høy dose en J eller U. Samme sammenheng, forskjellig ordinat. De fleste studier av metylenblått måler positive funksjoner, så denne artikkelen omtaler omvendte U-kurver, med forståelsen av at bokstaven er et valg knyttet til hvordan dataene fremstilles.

Oversiktsartikkelen fra 2008 som samlet metylenblåtts hormetiske responser konkretiserer størrelsesordenen. På tvers av atferd, fysiologi og biokjemi når responsene innenfor den stimulerende sonen omtrent 130 til 160 prosent av kontrollnivået, med et gjennomsnitt nær 140, før de faller tilbake gjennom kontrollnivået og deretter under det når dosen fortsetter å øke. Dette intervallet er en oppsummering av mange forsøk, ikke en egenskap ved molekylet. Hver kurve nedenfor har sin egen topp i sine egne enheter.

Hvorfor akkurat dette molekylet kan skifte virkningsretning

Metylenblått er ikke en enkel elektrondonor. Det er en reversibel elektrontransportør. Den oksiderte blå formen tar opp elektroner og blir den fargeløse reduserte formen, og den reduserte formen kan overføre disse elektronene videre. Elektronoverføringen bak disse kurvene er beskrevet i gjennomgangen av hvordan metylenblått flytter elektroner, og denne transportfunksjonen er hele poenget her.

Ved lave konsentrasjoner gir denne syklusen celleåndingen en alternativ vei. Det reduserte fargestoffet kan oksideres ved cytokromoksidase, det siste enzymet i elektrontransportkjeden, og øke enzymets omsetningshastighet sammen med oksygenforbruket og respirasjonskapasiteten. Ved høyere konsentrasjoner begynner den samme elektronhungrige kjemien å konkurrere med den normale kjeden i stedet for å hjelpe den: Den leder elektroner bort fra deres vanlige vei, forbruker oksygen direkte og danner reaktive oksygenforbindelser i stedet for å bidra til nyttig energiproduksjon. En liten katalytisk transportør gir større gjennomstrømning; et overdrevent konkurrerende elektronsluk gir mindre. Kjemien gjør et retningsskifte plausibelt, men garanterer ingenting om hvor et bestemt endepunkt vil nå sin topp.

Uavhengig dokumentasjon på konsentrasjonsavhengigheten kommer fra celler helt uten mitokondrier. I erytrocyttforsøkene fra 1976 stimulerte en lav konsentrasjon på 1 mikromolar heksosemonofosfatshunten via en mekanisme som var sterkt avhengig av oksyhemoglobin, mens en hundre ganger høyere konsentrasjon på 0.1 millimolar knapt var påvirket av om oksyhemoglobin var til stede, og dannet hydrogenperoksid påvist med alle de tre analysemetodene som ble brukt. Samme fargestoff, to mekanismer, atskilt av konsentrasjonen. Røde blodceller kan ikke utføre celleånding, så dette er ikke en mitokondriell kurve, men den viser at fargestoffets redokskjemi endrer karakter når konsentrasjonen øker, noe som er nettopp det den mitokondrielle forklaringen forutsetter.

Fire kurver, fire oppsett

Figuren nedenfor gjengir de fire datasettene side om side. Hvert panel beholder sine egne akser og betingelser, fordi det å legge dem oppå hverandre på én skala ville vært den første løgnen denne artikkelen kunne fortelle. Tegningen er skjematisk; nøyaktige verdier og betingelser står i teksten.

Panel A: cytokromoksidase i homogenat av rottehjerne. Den tydeligste mitokondrielle kurven kommer fra en sekundærkilde, fremstilt i oversiktsartikkelen ut fra data fra rottehjernehomogenat: omtrent 138 prosent av kontrollaktiviteten ved 0.5 mikromolar, tilbake til kontrollnivået nær 5 mikromolar og under utgangsnivået nær 10 mikromolar, der forfatterne antyder at fargestoffet tar elektroner fra kjedens normale komplekser. Homogenat, mikromolar, spektrofotometrisk analyse. Den setningen er hele konteksten, og kurven betyr ingenting utenfor den.

Panel B: rotters hukommelse og aktivitet i løpehjul. I studien av rotters hukommelse ble effekten av enkeltinjeksjoner gitt etter trening undersøkt 24 timer senere. Doser på 1 til 10 milligram per kilogram ga ingen påviselig forskjell fra saltvann i bevegelsesaktivitet eller matinntak, mens 50 til 100 milligram per kilogram reduserte aktiviteten i løpehjulet kraftig (median 35 mot 279 omdreininger), og den høyeste dosen førte til piloereksjon, ukoordinerte bevegelser og ett dødsfall. Dosen på 4 milligram per kilogram forbedret habituering og gjenkjenning av gjenstander: Behandlede rotter brukte nesten 10 sekunder mer på den nye gjenstanden. Oksygenforbruket i hjernen økte både i homogenat eksponert for redusert fargestoff ved lave mikromolare konsentrasjoner og i hjerner tatt ut 24 timer etter 1 milligram per kilogram in vivo. Legg merke til skillet: Atferdsforsøket brukte systemiske doser etter trening, mens målingene av oksygenforbruk brukte homogenatkonsentrasjoner pluss én dose in vivo. Dette er to forsøk, ikke én kurve.

Panel C: sebrafisk i T-labyrint. I sebrafiskstudien ble trente fisk holdt nedsenket i 12 timer etter trening ved nominelle badkonsentrasjoner på 0.1, 0.5, 5.0 eller 10.0 mikromolar, med blå konditorfarge som kontroll. Gruppen ved 0.5 mikromolar presterte best, 5.0-gruppen var på nivå med kontrollgruppen, og 10.0-gruppen presterte dårligere enn gruppene med lavere dose. To forbehold følger med panelet. Mikromolar i et bad er ikke mikromolar i blod eller hjerne; fordeling og akkumulering ligger mellom vannet i karet og vevet. Og statistikken er svakere enn kurveformen antyder: Den høye dosen skilte seg fra gruppene med lavere dose, men ingen andre signifikante gruppeforskjeller ble rapportert. Kurven er reell, men grov.

Panel D: erytrocyttshunten. Metz og kolleger sammenlignet 1 mikromolar med 0.1 millimolar i humane røde blodceller under luft, karbonmonoksid og en blanding som ga nesten fullstendig dannelse av karboksyhemoglobin ved fysiologisk oksygentrykk. Stimuleringen ved lav dose kollapset uten oksyhemoglobin; stimuleringen ved høy dose var knapt påvirket. Peroksid oppsto bare ved den høye dosen. Dette panelet hører hjemme ved siden av de andre som kjemi, ikke som et fjerde punkt på en slags overordnet kurve: ingen mitokondrier, hundre gangers forskjell i konsentrasjon, manipulerte gassblandinger.

Hvorfor toppene ikke samsvarer, og heller ikke bør gjøre det

De fire toppene ligger ved 0.5 mikromolar i et homogenat, 4 milligram per kilogram injisert etter trening, 0.5 mikromolar i vannet i et kar og et lavt–høyt konsentrasjonspar med hundre gangers forskjell i røde blodceller. Å behandle to av disse som samme tall er en kategorifeil. Hvert endepunkt har sin egen kurve: Optimum for hukommelse trenger ikke å samsvare med optimum for oksidaseaktivitet, oksygenforbruk, bevegelsesaktivitet eller peroksidproduksjon. Hver konsentrasjonsenhet betyr noe forskjellig: Mikromolar i homogenat, nominell mikromolar i bad, systemiske milligram per kilogram og konsentrasjoner i plasma, hjerne og mitokondrier er ulike størrelser, og metylenblåtts tendens til å akkumuleres i mitokondrier og hjerne gjør at de forblir forskjellige. Hver modell tilfører sin egen farmakokinetikk: Art, administrasjonsvei og tidspunkt avgjør hvilket vev som møter hvor mye fargestoff, og hvor lenge.

Det er også her betydningen av dose og administrasjonsvei for sikkerheten ved metylenblått blir viktig, siden høydoseeffektene i disse artiklene — redusert motorisk aktivitet, ukoordinerte bevegelser, én død rotte og peroksiddannelse — er tegn på toksisitet i sine egne forsøksoppsett, ikke sikkerhetsmarginer for noen andre. Og alle som fristes til å omregne 4 milligram per kilogram hos en rotte til et doseringsregime for mennesker, bør først lese om hvordan dyrefunn forholder seg til dokumentasjon fra mennesker: Enkel omregning i milligram per kilogram på tvers av arter er utilstrekkelig.

Feilen du må unngå

Den omvendte U-en er fristende fordi den ser ut som en dosevelger med et optimalt punkt markert. Det er den ikke. Hormese beskriver hva som skjedde med ett endepunkt i ett oppsett. Samler du fire slike beskrivelser, får du fire topper i fire enhetssystemer, noe som er det motsatte av en dosevelger. Den redelige bruken av disse kurvene er sammenlignende og advarende: Forvent at effekter skifter retning med konsentrasjonen, forvent at hvert endepunkt skifter retning ved sitt eget punkt, og vær skeptisk til enhver påstand som låner toppen fra ett forsøk for å begrunne en dose hos en annen art, via en annen administrasjonsvei, i et annet vev eller til et annet formål. Skillet mellom forsøksmønstre og personlige doseringsbeslutninger er poenget med hele denne artikkelen, gjentatt enda en gang så det ikke overses.

Slik leser du den neste artikkelen om dose–respons

Fire spørsmål passer til nesten enhver kurve for metylenblått du vil møte. Hvilket endepunkt står på den vertikale aksen, og ville en reversering av det tegne en U eller en J? Hvilken konsentrasjon angir den horisontale aksen faktisk: nominell badkonsentrasjon, homogenat, plasma, estimert hjernekonsentrasjon eller administrert systemisk dose? Hvilken modell og hvilke tidspunkter ga kurven: homogenat, cellekultur med lyset på eller av, trente dyr dosert før eller etter trening, testet når? Og hva var kontrollen: saltvann, blå konditorfarge eller bæremedium, og støtter artikkelens statistikk hver påstand om parvise forskjeller eller bare den overordnede formen? En artikkel som svarer på alle fire, er verdt tiden din. En som rapporterer en topp uten dem, har gitt deg et tall uten en adresse.