Metylenblått og Bartonella: laboratoriefunn og begrensninger i klinisk dokumentasjon

En dyrkingsskål og en pasient har et ord til felles, infeksjon, men ikke et begrep. I skålen er infeksjon et antall kolonier på agar. Hos pasienten dreier det seg om bakterier inne i celler og blodårer, legemidler som beveger seg gjennom blod og vev, og et immunsystem som gjør en del av arbeidet. Blander man disse sammen, begynner et slående laboratorietall å ligne en behandling. Holder man dem atskilt, blir det samme tallet det det er: en grunn til å gjøre det neste forsøket.

Dette skillet er hele formålet med denne gjennomgangen av metylenblått og Bartonella. To laboratoriestudier fra én forskningsgruppe testet metylenblått mot Bartonella henselae i tilstander uten vekst. Begge rapporterte sterk aktivitet i glass og plast. Ingen av dem testet det på mennesker.

Hvorfor forskere tester stasjonærfasen

De fleste antibiotikatester bruker celler i vekst. Denne modellen overser et vanskeligere tilfelle: celler som har sluttet å dele seg og tåler legemidler som dreper deres voksende søsterceller.

Bartonella kan vedvare i kroppen, blant annet inne i erytrocytter og endotelceller. Gruppen undersøkte derfor hvilke godkjente legemidler som kan drepe B. henselae etter at bakterien har gått inn i stasjonærfasen. En lav MIC mot celler i vekst forutsa ikke drapseffekt i stasjonærfasen. Rifampicin hadde en svært lav MIC, men drepte stasjonære celler dårlig, mens forbindelser med høyere MIC-verdier drepte dem godt. Lesere som ønsker en generell metode for å lese denne typen artikkel, finner den i veiledningen til å lese forskning på metylenblått.

Første screening: Li og kolleger, 2019

Screeningen av stasjonærfase publisert i Antibiotics i 2019 brukte én stamme, B. henselae JK53, dyrket i Schneider-medium med 10 prosent føtalt bovint serum ved 37 C med 5 prosent CO2. Én dag gamle kulturer besto hovedsakelig av spredte celler som delte seg. Fem dager gamle kulturer, med rundt 10 opphøyd i 8 kolonidannende enheter per mL, ble regnet som stasjonærfase og inneholdt synlige aggregater.

Analysen brukte SYBR Green I med propidiumjodid, kalibrert mot blandinger av levende celler og celler drept med isopropanol. Fordi metylenblått er sterkt farget, ble treff bekreftet med mikroskopi og deretter med kolonitelling på blodagar, det strengere endepunktet.

Blant 1,581 godkjente legemidler ved 50 mikromolar ga metylenblått en gjenværende levedyktighet på 16 prosent målt med plateleser og 25 prosent ved mikroskopi. Daptomycin ga 21 prosent, flere azoler 22 til 27 prosent, gentamicin 32 prosent, erytromycin 66 prosent og ciprofloksacin 74 prosent. Pyrviniumpamoat så sterkere ut på plateleseren, men kunne ikke vurderes med mikroskopi på grunn av sin egen fluorescens.

Mot B. henselae i vekst var MIC for metylenblått 0.08 til 0.16 mikrogram per mL. Mot fem dager gamle stasjonære celler ved 5 mikrogram per mL falt kolonitallet til ingen påvisbare kolonier etter én dags eksponering, tilsvarende daptomycin og pyrviniumpamoat ved de testede konsentrasjonene. Et separat forsøk som målte drapseffekt over tid, brukte 10 mikrogram per mL. Dette er eksponeringsnivåer i laboratoriet, ikke doser, og artikkelen beskriver dem som det. En referert maksimal plasmakonsentrasjon hos mennesker på rundt 3.9 mikrogram per mL oppgis i artikkelen bare som bakgrunnsinformasjon. Oversikten over farmakokinetikken til metylenblått forklarer hvorfor en plasmaverdi ikke kan tolkes som en vevsverdi.

To begrensninger er uttrykkelig nevnt i artikkelen. Det var ingen biofilmmodell og ingen testing av kombinasjoner med metylenblått. De fem dager gamle aggregatene var klynger i stasjonær væskekultur, ikke et validert biofilmforsøk. Forfatterne etterlyste dyreforsøk, kombinasjonsforsøk, biofilmforsøk og testing på andre Bartonella-arter.

Kombinasjoner og celler fra biofilm: Zheng og kolleger, 2020

Oppfølgingsstudien fra 2020 i BMC Microbiology beholdt samme stamme og medium, men gikk over til seks dager gamle stasjonære kulturer og la til to ting den første artikkelen manglet: kombinasjoner av to legemidler og en modell med celler fra biofilm.

For enkeltlegemidler ved samme konsentrasjon på 5 mikrogram per mL i 24 timer etterlot metylenblått 3.2 ganger 10 opphøyd i 4 kolonidannende enheter per mL, sammenlignet med en kontroll på rundt 2.8 ganger 10 opphøyd i 10. Ciprofloksacin, gentamicin og nitrofurantoin etterlot færre kolonier på samme tidspunkt. Dette skiller seg fra resultatet i 2019, der samme nominelle nivå ga ingen påvisbare kolonier etter én dag. Kulturenes alder, tetthet og håndtering var forskjellig, så drapseffekten var reproduserbar i retning, men ikke identisk i størrelse. Denne variasjonen mellom forsøk er én grunn til at vanlige sikkerhets- og interaksjonsvurderinger behandler laboratoriepotens og klinisk effekt som separate forhold.

Kombinasjonsscreeningen er den mest siterte delen. Hver komponent ble holdt på 5 mikrogram per mL. Både azitromycin pluss metylenblått og rifampicin pluss metylenblått ga ingen påvisbare stasjonærfasekolonier etter 24 timer, det samme gjorde begge kombinasjonene med ciprofloksacin. Dette gjaldt bare disse fire av 25 testede kombinasjoner. Det ble ikke utført noen formell synergianalyse, så det riktige uttrykket er en aktiv kombinasjon under disse betingelsene, ikke dokumentert synergi.

Biofilmforsøket testet celler hentet fra en ung, oppbrutt biofilm, ikke inntrengning i en intakt, moden biofilm. Kulturene ble dyrket i fem dager, fortynnet i brønnplater i ytterligere fem dager, bekreftet med krystallfiolettfarging og deretter skrapt av før legemiddeleksponering. Ved 5 mikrogram per mL reduserte metylenblått alene antallet til 2.3 ganger 10 opphøyd i 2 innen dag 6, blant de beste enkeltmidlene, men ikke til null. Begge kombinasjonene med metylenblått nådde null innen dag 6, det samme gjorde begge kombinasjonene med ciprofloksacin.

Forfatterne påpekte de samme begrensningene som en grundig leser ville lagt merke til: ung, avskrapt biofilm fremfor gammel, intakt biofilm; én praktisk konsentrasjon for alle legemidler i stedet for hvert legemiddels egen realistiske toppkonsentrasjon; bare utvalgte kombinasjoner med azitromycin eller rifampicin; én stamme; ingen dyr; ingen pasienter. Senere forsøk med tre legemidler ble foreslått, ikke rapportert.

Sammenligning av studiedesign

Tabellen sammenfatter poenget med denne artikkelen. Alt til venstre for den siste kolonnen er arbeid med kulturer. Ingenting i noen av artiklene hører hjemme i den siste kolonnen.

Bartonella er ikke Borrelia

Begge artiklene nevner Borrelia burgdorferi, spiroketen som forårsaker Lyme-borreliose, fordi fargestoffanalysen kom fra tidligere arbeid med Borrelia i stasjonærfase ved samme laboratorium, der metylenblått og daptomycin også hadde gitt treff. Denne historikken gir nyttig bakgrunn og er en vanlig kilde til feil.

Ingen forsøk i noen av Bartonella-artiklene tester Borrelia side om side med Bartonella. Organismene er forskjellige, mediene er forskjellige, konsentrasjonene er forskjellige, og den antatte membraneffekten av metylenblått i Bartonella ble omtalt som spekulasjon som krevde flere studier. Resultater bør ikke overføres mellom arter, og ingen av artiklene støtter brede påstander om parasitter. Sammenligningen av persisterceller hos Borrelia og Bartonella holder derfor de to forskningsfeltene atskilt.

Hvorfor kulturer ikke kan omsettes til en protokoll

Søkeinteressen for en protokoll med metylenblått mot Bartonella er forståelig. Disse artiklene er grunnen til at dette uttrykket bør behandles som et varselsignal fremfor en handleliste.

For det første er 5 mikrogram per mL i en brønn ikke en resept. Det sier ingenting om absorpsjon, fordeling, proteinbinding, inntrengning i celler eller tolerabilitet. Forfatterne valgte dette som et grovt gjennomsnitt av antibiotikas toppkonsentrasjoner og sa at fremtidige forsøk burde bruke hvert legemiddel på sitt eget realistiske nivå.

For det andre betyr null kolonier ingen kolonier under disse utplatingsbetingelsene, ikke sterilt vev. Persisterceller, intracellulære bakterier og begrensninger ved prøvetaking ligger alle utenfor agarplaten.

For det tredje kan kombinasjoner som steriliserer en brønn, svikte eller gjøre skade i en kropp. Azitromycin pluss metylenblått og rifampicin pluss metylenblått er laboratoriekombinasjoner ved laboratorieeksponeringer. Uten farmakokinetiske data fra dyr og kontrollerte data fra mennesker finnes det ingen fastsatt dose, ingen varighet og ikke noe nytte–risiko-forhold. Alle som vurderer alternativer, bør diskutere dem med en lege og gå gjennom når bruk av metylenblått krever medisinsk oppfølging, før de trekker noen konklusjon fra data fra dyrkingsskåler.

Den avgrensede konklusjonen disse artiklene støtter, er denne: Metylenblått har reproduserbar aktivitet mot B. henselae JK53 som ikke vokser, in vitro, også i laboratoriekombinasjoner med to legemidler. De sterkeste resultatene for kombinasjoner og celler fra biofilm kommer fra studien i 2020. Alt annet, inkludert om denne aktiviteten har betydning for bartonellose hos mennesker, er fortsatt uprøvd.