EMB-agar versus MacConkey-agar: valg og tolkning av dyrkningsmedier

En student stryker ut den samme vannprøven på to skåler. På den ene oppstår mørke kolonier med grønn metallisk glans. På den andre oppstår klart rosa kolonier med en diffus halo. Begge skålene ble inokulert fra samme rør, inkubert side om side og avlest på samme tidspunkt. Studenten spør hvilken skål som er riktig.

Begge skålene er riktige. De besvarer ulike spørsmål. Forvirringen oppstår når de to mediene behandles som utskiftbare screeningsmedier for tarmbakterier. De har et felles formål, nemlig å selektere gramnegative enteriske organismer og skille laktosefermenterende fra ikke-fermenterende organismer, men de oppnår dette med ulik kjemi og ulik visuell logikk. Når du først forstår de to underliggende prinsippene, blir valg av skål og avlesning av kolonier rutine.

Kort svar

EMB-agar bruker to fargestoffer, eosin Y og metylenblått, som har en dobbeltfunksjon: De hemmer vekst av grampositive organismer og felles ut rundt sterke syreprodusenter slik at det dannes mørke kolonier, klassisk med metallisk grønn glans for Escherichia coli. MacConkey-agar fordeler oppgavene: gallesalter pluss krystallfiolett hemmer grampositive organismer, laktose fungerer som substrat for fermentering, og nøytralrødt viser syredannelse som rosa eller røde kolonier. Hvis oppgaven er en tydelig presumptiv demonstrasjon av E. coli, har EMB sin plass. Hvis oppgaven er et tydelig skille mellom rosa og fargeløse kolonier for laktosefermenterende og ikke-fermenterende organismer, særlig i arbeidsflyter for avførings- eller urinprøver, er MacConkey vanligvis enklere å lese. Ingen av skålene identifiserer en organisme ut fra farge alene.

EMB: fargestoffer som både selekterer og indikerer

EMB-prinsippet kombinerer seleksjon og indikasjon i de samme molekylene. ASM-protokollen for eosin-metylenblåagar beskriver EMB som både selektivt og differensielt, der fargestoffparet hemmer mange grampositive organismer, mens laktosefermentering fører til opptak og utfelling av fargestoffene. En standard Levine-formulering inneholder pepton, laktose, fosfat, eosin Y, metylenblått og agar, slik det er oppført i FDA BAM-metoden for Levine EMB-agar. Merk at eldre EMB-oppskrifter noen ganger tilsatte sukrose sammen med laktose, mens Levine EMB inneholder laktose uten sukrose, så registrer hvilken formulering laboratoriet ditt bruker.

Å lese EMB innebærer å tolke fargestoffenes oppførsel. Kraftig laktosefermentering produserer nok syre til å gi omfattende utfelling av fargestoffene, noe som gir E. coli mørk blåsvart kjerne og, i det klassiske tilfellet, en metallisk grønn glans i reflektert lys. Svakere fermenterende organismer som Enterobacter og Klebsiella vokser vanligvis som rosa til lilla, mukøse kolonier uten denne glansen. Ikke-fermenterende organismer som Salmonella, Shigella og Proteus vokser vanligvis som fargeløse eller gjennomskinnelige kolonier fordi de ikke produserer den kraftige syredannelsen som får fargestoffene til å felles ut. Grampositive organismer hemmes vanligvis, men graden av hemming varierer med stamme og produkt. Fullstendig kjemi for fremstilling av fargestoffene, inkludert hvorfor metylenblått i utgangspunktet oppfører seg som et kationisk fargestoff, hører hjemme i en egen gjennomgang av fargestoffformuleringer, og den generelle mikroskopikonteksten finnes i et atlas over fargemetoder. Denne artikkelen holder seg til valg og avlesning av skåler.

Figuren ovenfor er illustrativ. Den viser den visuelle logikken du kan forvente: mørke kolonier med glans, rosa mukøse kolonityper og bleke typer på EMB, sammenlignet med rosa versus bleke typer på MacConkey. Bruk den til å lære mønsteret, og bekreft deretter hver vurdering mot fotograferte kontroller og produktvedlegget for det nøyaktige mediet du bruker på laboratoriebenken.

MacConkey: separate funksjoner, enklere visuell regel

MacConkey-prinsippet tildeler hver oppgave til en separat ingrediens. ASM-protokollen for MacConkey-agar beskriver den samme selektive og differensielle funksjonen, og FDA BAM-metoden for MacConkey-agar oppgir de funksjonelle komponentene: peptoner, laktose, gallesalter, salt, nøytralrødt, krystallfiolett og agar. Gallesalter pluss krystallfiolett selekterer mot grampositive organismer. Laktose fungerer som substrat for fermentering. Nøytralrødt fungerer som pH-indikator og blir rosa til rødt der det dannes syre, noen ganger med utfelt galle rundt sterke fermenterende organismer.

Avlesningsregelen er bevisst enkel: Rosa betyr laktosefermenterende, mens fargeløs eller blek betyr ikke-fermenterende. E. coli fremstår som rosa til rød, ofte med en halo av utfelt galle. Klebsiella og Enterobacter fremstår som rosa og er ofte mukøse på grunn av kapslene sine. Salmonella, Shigella, Proteus og mange andre gramnegative staver fremstår som fargeløse. En fordel som er viktig i undervisningslaboratorier, er at gallesalter vanligvis reduserer sverming hos Proteus, slik at isolerte kolonier er lettere å oppnå på MacConkey enn på ikke-selektive medier. Hemmingen er imidlertid ikke absolutt, og saltfrie alternativer finnes når kontroll av sverming er hovedprioriteten.

Den molekylære årsaken til at fargestoffene oppfører seg slik, kan spores til ladning og struktur. Metylenblått er et kationisk fenotiazin-fargestoff der struktur og egenskaper forklarer affiniteten til sure bakterieoverflater, den samme affiniteten som virker når det felles ut i sure soner på EMB.

Sammenligning i korte trekk

Les tabellen som en beslutningsprosedyre. Når øvelsen krever at studentene ser en gradient i fermenteringsstyrke med ett dramatisk endepunkt, viser EMB dette. Når øvelsen krever et raskt binært skille før biokjemisk bekreftelse, viser MacConkey dette.

Hvilket medium til hvilken prøve

For vannøvelser som tar sikte på presumptiv gjenkjenning av fekale koliforme bakterier eller E. coli, er EMB attraktivt fordi glansen er visuelt karakteristisk. MacConkey egner seg også for enteriske gramnegative organismer og har historisk vært brukt til vannprøver, men ingen av skålene erstatter en forskriftsbestemt vannmetode, som kan spesifisere medier som modifisert mTEC eller MI avhengig av testen. Kontroller hvilken metode laboratoriet ditt er pålagt å følge.

For separasjon av fermenterende og ikke-fermenterende organismer i avføringsprøver er MacConkey generelt det mest nyttige av de to. Praktisk arbeid med avføringsprøver for Salmonella eller Shigella inkluderer vanligvis mer selektive enteriske medier som XLD eller Hektoen enteric i stedet for å basere seg på MacConkey alene.

For undervisning med urinprøver som etterligner klinisk arbeidsflyt, kombiner MacConkey med blodagar. MacConkey gir en tidlig sortering av gramnegative organismer, mens blodagar gir vekst av organismer som MacConkey hemmer. Denne kombinasjonen er standard i kliniske beskrivelser av oppsett for urindyrkning.

For ren konseptundervisning kan begge brukes. EMB lærer studentene at fermenteringsstyrke har betydning, og at ett molekyl kan fylle to roller. MacConkey lærer modulær utforming: selektor, substrat og indikator holdes adskilt. Studenter som stryker ut en kjent E. coli, en kjent Klebsiella aerogenes og en kjent Salmonella side om side på begge medier, blander sjelden sammen de to prinsippene igjen.

Fallgruver ved avlesning som går igjen hvert semester

Den vanligste feilen er identifikasjon ut fra farge alene. Rosa på MacConkey kan være E. coli, Klebsiella, Enterobacter eller en annen fermenterende organisme. Fargeløs kan være Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas eller en annen ikke-fermenterende organisme. Farge er en screeningsfenotype som styrer videre bekreftende arbeid som gramfarging, oksidasetest, biokjemiske paneler eller instrumentbasert identifikasjon, ikke et artsnavn.

Den andre feilen er å legge for stor vekt på manglende glans. Noen ekte E. coli-kolonier, særlig isolerte kolonier, danner lite eller ingen metallisk glans på EMB. Fravær av glans utelukker ikke E. coli, og tilstedeværelse av glans beviser det ikke. Behandle glansen som en presumptiv indikasjon.

Den tredje feilen er å sammenligne skåler med ulik alder. Forsinket laktosefermenterende organismer kan bli rosa på MacConkey etter forlenget inkubasjon, noe som gjør det tydelige skillet mellom fermenterende og ikke-fermenterende mindre klart. Les av på det tidspunktet laboratoriet har spesifisert, og registrer inkubasjonstiden sammen med resultatet.

Den fjerde feilen er å lese blandet vekst som én organisme. En rosa koloni ved siden av en fargeløs koloni representerer to fenotyper, ikke en mellomform. Plukk godt isolerte kolonier og arbeid med hver morfotype separat. Mukøs tekstur innebærer en lignende fallgruve: Både Klebsiella og Enterobacter kan se mukøse ut, så kapselen alene avgjør aldri navnet. Organismen som tidligere ble undervist som Enterobacter aerogenes, klassifiseres nå som Klebsiella aerogenes, noe som forklarer hvorfor eldre tabeller og nyere etiketter kan se ut til å være uenige.

Kontroller og en avsluttende regel

Kjør fotograferte eller ferske kontroller ved hver økt: E. coli for reaksjonen til en sterk fermenterende organisme, Klebsiella aerogenes for mukøs fermentering uten den klassiske glansen, en Salmonella-stamme for den fargeløse reaksjonen til en ikke-fermenterende organisme og Staphylococcus aureus for å bekrefte hemming av grampositive organismer på akkurat det produktet du bruker. Tilpass stammenumre og akseptansekriterier til produsentens produktvedlegg, fordi selektiviteten varierer med innholdet av galle, krystallfiolett og fargestoffer.

Husk én setning ved laboratoriebenken. EMB bruker fargestoffer som både selekterer og signaliserer, noe som gir et tydelig E. coli-signal på bekostning av en mer nyansert avlesning. MacConkey skiller seleksjon fra signalering, noe som gir et enkelt skille mellom rosa og bleke kolonier på bekostning av mindre detaljert informasjon om fermentering. Velg mediet hvis prinsipp passer til spørsmålet, bekreft fargen med riktige tester, og de to skålene slutter å konkurrere og begynner å utfylle hverandre.