မက်သလင်းဘလူး၏ မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားအပေါ် သက်ရောက်မှုများကို တိုင်းတာခြင်း: အောက်ဆီဂျင်၊ ATP နှင့် အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာ

ဓာတ်ခွဲခန်းတစ်ခုက အသက်ရှူခြင်းလုပ်ငန်းစဉ် ချို့ယွင်းနေသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများထဲသို့ မက်သလင်းဘလူး ထည့်ပြီး အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှု မြင့်တက်လာသည်ကို တွေ့ရသည်ဟု ယူဆကြည့်ပါ။ ဆိုးဆေးက မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား၏ လုပ်ငန်းဆောင်တာကို ပြန်လည်ကောင်းမွန်စေခဲ့သည်ဟု ရေးသားရန်မှာ သဘာဝကျပါသည်။ သို့သော် ထိုဝါကျသည် မှားနိုင်ပါသည်။ အောက်ဆီဂျင်စီးဆင်းနှုန်း၊ ATP ထုတ်လုပ်မှုနှင့် အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာတို့သည် သီးခြားအယူအဆ သုံးခုဖြစ်သည်။ အရန်သိမ်းခြင်း၊ တစ်ပြေးညီဖြစ်အောင် ချိန်ညှိခြင်းနှင့် မျှဝေခြင်းတို့က တူညီသော ကလောက်ဖိုင်တွဲတစ်ခုကို အသုံးပြုသကဲ့သို့ ၎င်းတို့သည်လည်း တူညီသော ဆဲလ်တွင်းအင်္ဂါတစ်ခု၌ ဖြစ်ပေါ်ကြသည်။ ဆက်စပ်နေကြသော်လည်း မတူညီသော စည်းမျဉ်းများဖြင့် လည်ပတ်ကြသည်။ တစ်ခုကို အခြားတစ်ခုအဖြစ် ရောထွေးယူဆပါက တိုင်းတာချက်တိုင်း နည်းပညာအရ မှန်ကန်နေလျှင်ပင် အဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုချက် မှားယွင်းသွားမည်ဖြစ်သည်။

မက်သလင်းဘလူးသည် ၎င်းတိုင်းတာနေသော စနစ်အတွင်း ကိုယ်တိုင်ပါဝင်သောကြောင့် ထိုသို့ရောထွေးနိုင်ခြေ များသည်။ ၎င်းသည် လုပ်ငန်းစဉ်၏ အစောပိုင်းအဆင့်တွင် အီလက်ထရွန်များကို လက်ခံပြီး နောက်ပိုင်းအဆင့်တွင် ပေးအပ်သော ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့ စက်ဝန်းလည်ပတ်ပစ္စည်းဖြစ်သည်။ စွမ်းအင်ပြည့်နေသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများအတွင်း စုဝေးလာသည့် အဆီပျော် အပေါင်းအိုင်းယွန်းလည်းဖြစ်ပြီး၊ အသုံးများသော အာရုံခံပစ္စည်းများနှင့် တူညီသည့် လှိုင်းအလျားအပိုင်းအခြားများတွင် အလင်းကို စုပ်ယူ၍ ထုတ်လွှတ်သော အပြာရောင်ပြင်းသည့် ဒြပ်ပေါင်းလည်းဖြစ်သည်။ တိုင်းတာချက်တစ်မျိုးတည်းဖြင့် ထိုအချက်အားလုံးကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားနိုင်မည် မဟုတ်ပါ။ ဘူဒါပက်စ် မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား လေ့လာမှုများတစ်လျှောက် တွေ့ရသော ယုံကြည်စိတ်ချရသည့် ပုံစံမှာ အောက်ဆီဂျင်စီးဆင်းနှုန်း၊ ATP ထုတ်လုပ်နှုန်း၊ အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာနှင့် ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ် ထုတ်လွှတ်မှုတို့ကို အတူတိုင်းတာပြီး အဆင့်တစ်ခုစီ၌ ဆိုးဆေးအတွက် သီးသန့်ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှုများ ပြုလုပ်ခြင်းဖြစ်သည်။

အသက်ရှူခြင်းဆိုင်ရာတိုင်းတာမှုက အောက်ဆီဂျင်စီးဆင်းနှုန်းကို တိုင်းတာခြင်းဖြစ်ပြီး စွမ်းအင်ထုတ်လုပ်မှုကို တိုင်းတာခြင်းမဟုတ်ပါ

Oroboros Oxygraph ဖြင့်ဖြစ်စေ၊ Seahorse ဆဲလ်ပြင်ပစီးဆင်းနှုန်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာစက်ဖြင့်ဖြစ်စေ ပြုလုပ်သည့် အနုစိတ် အသက်ရှူခြင်းဆိုင်ရာတိုင်းတာမှုသည် အချက်တစ်ခုသာ ဖော်ပြသည်။ အောက်ဆီဂျင်က မည်မျှမြန်စွာ ဓာတ်လျော့ခံနေရသနည်းဆိုသည့် အချက်ဖြစ်သည်။ အီလက်ထရွန်တစ်ခုလျှင် ပရိုတွန်မည်မျှကို ပို့ဆောင်ခဲ့သည်၊ အဆင့်ကွာခြားမှု မည်မျှကို ထိန်းသိမ်းခဲ့သည်၊ သို့မဟုတ် ATP synthase က ထိုအဆင့်ကွာခြားမှုကို အသုံးပြုခဲ့သလားဆိုသည်တို့ကို မဖော်ပြပါ။

ဝေါဟာရအသုံးအနှုန်းသည် အရေးကြီးသည်။ သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများတွင် ADP မပါဘဲ ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်း ပေးထားခြင်းက ယိုစိမ့်မှုနှင့်ဆိုင်သော အသက်ရှူခြင်းကို ဖြစ်စေသည်။ ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်းနှင့် ပြည့်ဝစေသော ADP ပမာဏကို ပေးထားခြင်းက အောက်ဆီဒေးတစ် ဖော့စဖော်ရီလေးရှင်း စွမ်းရည်ကို ဖော်ပြပြီး၊ တွဲဖက်မှုဖြတ်တောက်ပစ္စည်းကို အဆင့်ဆင့်တိုးထည့်ခြင်းက အမြင့်ဆုံး အီလက်ထရွန်လွှဲပြောင်းနိုင်စွမ်းကို ဖော်ပြသည်။ မပျက်မစီးရှိသော ဆဲလ်များ၌ Seahorse ဖြင့် တိုင်းတာသော သက်ဆိုင်ရာအချက်များမှာ အခြေခံအသက်ရှူခြင်း၊ oligomycin ကို တုံ့ပြန်သော ATP နှင့်ဆက်စပ်သည့် အသက်ရှူခြင်း၊ ပရိုတွန်ယိုစိမ့်မှု၊ FCCP ဖြင့် သတ်မှတ်သော အမြင့်ဆုံးအသက်ရှူခြင်းနှင့် rotenone နှင့် antimycin တို့ကို ခံနိုင်ရည်ရှိသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားပြင်ပ အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှုတို့ ဖြစ်သည်။ Agilent Mito Stress Test မူဘောင် တွင် ရှင်းလင်းထားသကဲ့သို့ Seahorse ရလဒ်များကို State 3 နှင့် State 4 ဟု ခေါ်ဆိုခြင်းသည် နမူနာပြင်ဆင်ထားပုံက မပံ့ပိုးနိုင်သော တိကျမှုကို ယူသုံးခြင်းဖြစ်သည်။

မက်သလင်းဘလူးသည် အောက်ဆီဂျင်ပိုသုံးလျှင် စွမ်းအင်ပိုရမည်ဟူသော အလိုအလျောက်ယူဆမိသည့် ဆက်စပ်မှုကို ချိုးဖျက်သည်။ သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော ဦးနှောက်မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား လေ့လာမှု အရ ဂီနီဝက်၏ ဦးနှောက်မှ သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများတွင် 100 nM မှ 1 uM အထိ ဆိုးဆေးထည့်သောအခါ glutamate နှင့် malate၊ succinate၊ alpha-glycerophosphate တို့ကို ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်းအဖြစ် အသုံးပြုထားသည့် အနားယူအခြေအနေ အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှု မြင့်တက်လာသည်။ alpha-glycerophosphate ဖြင့် 64 percent ခန့် မြင့်တက်ခဲ့သော်လည်း ကောင်းမွန်နေသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများတွင် ADP ဖြင့် လှုံ့ဆော်ထားသည့် အသက်ရှူခြင်းမှာ အခြေခံအားဖြင့် မပြောင်းလဲခဲ့ပါ။ ယိုစိမ့်မှုနှင့်ဆိုင်သော အသက်ရှူခြင်း မြင့်တက်သော်လည်း ADP ဖြင့် လှုံ့ဆော်ထားသော စီးဆင်းနှုန်း မပြောင်းလဲသောကြောင့် တွက်ချက်ရရှိသည့် အသက်ရှူခြင်းထိန်းချုပ်မှု အချိုးကျဆင်းသည်။ ထိုကျဆင်းမှုက ဆိုးဆေးသည် မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများကို ပျက်စီးစေခဲ့သည်ဟု မဆိုလိုပါ။ ဆိုးဆေးက ပုံမှန်အသက်ရှူခြင်းအပြင် အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲသော ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့စက်ဝန်းတစ်ခုကို ထပ်တိုးပေးခဲ့သည်ဟု ဆိုလိုခြင်းဖြစ်သည်။ မြင့်တက်မှုကိုသာ ဖော်ပြသော မက်သလင်းဘလူး အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှု စမ်းသပ်တိုင်းတာချက်သည် တကယ်ဖြစ်ပေါ်နေသော ဓာတုဖြစ်စဉ်ကို တိုင်းတာထားသော်လည်း စွမ်းအင်ထိန်းသိမ်းမှုအကြောင်း မည်သည့်အချက်မျှ မပြောနိုင်ပါ။

ပြန်လည်ကောင်းမွန်စေမှု စမ်းသပ်ချက်များတွင်လည်း ထိုကွာဟချက်ကို ပိုမိုကြီးမားသော အတိုင်းအတာဖြင့် တွေ့ရသည်။ Complex I ကို ပိတ်ဆို့ထားသောအခါ အောက်ဆီဂျင်စီးဆင်းနှုန်းသည် သုံးဆခန့် ပြန်လည်မြင့်တက်ခဲ့သော်လည်း ATP ထုတ်လုပ်မှုမှာ 1.5 ဆခန့်သာ ပြန်လည်မြင့်တက်ခဲ့သည်။ လျှပ်ကူးတံထံသို့ အောက်ဆီဂျင် ပိုရောက်လာသော်လည်း ၎င်း၏ ပိုနည်းသောအပိုင်းကသာ ATP ထုတ်လုပ်မှုအတွက် အထောက်အကူဖြစ်ခဲ့သည်။ အောက်ဆီဒေးတစ် ဖော့စဖော်ရီလေးရှင်း တိုးတက်လာကြောင်း ပြောဆိုမှုတိုင်းတွင် ATP ဘက်မှ အချက်အလက်လည်း လိုအပ်သည်။ အကောင်းဆုံးမှာ ပိုင်းခြေကို သတ်မှတ်သည့် စံနှုန်းကို ဖော်ပြထားသော အောက်ဆီဂျင်တစ်ယူနစ်လျှင် ATP အချိုးအဖြစ် တင်ပြခြင်းဖြစ်သည်။

ATP စမ်းသပ်တိုင်းတာမှုများက ထုတ်လုပ်နှုန်းကို တိုင်းတာပြီး စုစုပေါင်းပမာဏဖြင့် အစားထိုးမရပါ

ATP စမ်းသပ်တိုင်းတာမှုတစ်ခုက မတူညီသော မေးခွန်းတစ်ခုကို ဖြေဆိုသည်။ အချိန်တစ်ယူနစ်လျှင် ATP မည်မျှ ထုတ်လုပ်သနည်းဆိုသည့် မေးခွန်းဖြစ်သည်။ ပိုးစုန်းကြူး luciferase ၏ အလင်းထုတ်လွှတ်မှုကို မိနစ်အလိုက် စောင့်ကြည့်ခြင်းဖြစ်စေ၊ hexokinase နှင့် glucose-6-phosphate dehydrogenase ကို တွဲဖက်အသုံးပြု၍ 340 nm တွင် ဖတ်ယူသော စမ်းသပ်တိုင်းတာမှုဖြစ်စေ၊ အချိန်နှင့်အမျှ ပြောင်းလဲမှုကို ဖတ်ယူခြင်းက နှုန်းတစ်ခုကို ပေးသည်။ အဆုံးမှတ်တစ်ခုတည်းတွင် စုစုပေါင်း ATP ကို တိုင်းတာခြင်းက ရှိနေသောပမာဏကို ပေးသည်။ ထိုပမာဏသည် ထုတ်လုပ်မှုမှ သုံးစွဲမှုကို နုတ်ထားသည့် ရလဒ်ကို ထင်ဟပ်ပြီး၊ ၎င်းတစ်ခုတည်းဖြင့် အောက်ဆီဒေးတစ် ဖော့စဖော်ရီလေးရှင်းအကြောင်း သိနိုင်သည့်အချက် အလွန်နည်းသည်။

ဘူဒါပက်စ်အဖွဲ့သည် adenylate kinase ကို ဖိနှိပ်ထားသော တွဲဖက်အင်ဇိုင်းနည်းလမ်းကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ 1 မှ 2 uM အထိ မက်သလင်းဘလူးသည် rotenone နှင့် antimycin တို့ဖြင့် သီးခြားကုသထားသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများတွင် ATP ထုတ်လုပ်မှုကို အနည်းငယ်သာဖြစ်သော်လည်း စာရင်းအင်းအရ သိသာစွာ မြှင့်တင်ပေးကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ယင်းသည် အမှန်တကယ် ပြန်လည်ကောင်းမွန်မှုဖြစ်သော်လည်း တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းသာဖြစ်သည်။ TEGDMA အဆိပ်သင့်မှု လေ့လာမှု သည် မတူညီသော စမ်းသပ်မော်ဒယ်တစ်ခု၌ အလားတူရလဒ်ပုံစံကို ရရှိခဲ့သည်။ သွားဘက်ဆိုင်ရာ မိုနိုမာ TEGDMA 5 mM သည် Complex I နှင့်ဆက်စပ်သော အသက်ရှူခြင်းကို စီးဆင်းနှုန်းယူနစ် 286 ခန့်မှ 28 သို့ ကျဆင်းစေခဲ့ပြီး၊ ဆိုးဆေး 2 uM က 86 ခန့်အထိ ပြန်လည်မြင့်တက်စေခဲ့သည်။

အရောင်ရှိသော ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့ ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုအတွက် မဖြစ်မနေပြုလုပ်ရမည့် ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှု နှစ်ခုရှိသည်။ ပထမ၊ တိုင်းတာရရှိသော ATP ထုတ်လုပ်မှု၏ မည်မျှသောအပိုင်းသည် ATP synthase အပေါ် မူတည်ကြောင်း သတ်မှတ်ရန် oligomycin ဖြင့် စမ်းသပ်ပါ။ ဒုတိယ၊ ပမာဏသိထားသော ATP၊ ဓာတ်ပြုပစ္စည်းအပြည့်အစုံနှင့် အမှန်တကယ်အသုံးပြုထားသော ဆိုးဆေးပြင်းအားများကို ထည့်၍ ဆဲလ်မပါသော ထပ်ဖြည့်ပမာဏ ပြန်လည်တိုင်းတာရရှိမှု စမ်းသပ်ချက်ကို ပြုလုပ်ပါ။ အနည်းဆုံး 0၊ 100 nM၊ 300 nM၊ 1 uM နှင့် 2 uM တို့ ပါဝင်သင့်သည်။ ဆိုးဆေးသည် ထုတ်လွှတ်လိုက်သော အလင်းကို စုပ်ယူနိုင်သည်၊ အချက်ပြအင်ဇိုင်းကို တားဆီးနိုင်သည်၊ သို့မဟုတ် ဓာတ်ပြုပစ္စည်း၏ ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့ ဓာတုဖြစ်စဉ်ကို ပြောင်းလဲနိုင်သည်။ ယေဘုယျ luciferase စမ်းသပ်တိုင်းတာမှု လမ်းညွှန် က ဤအနှောင့်အယှက်အမျိုးအစားအတွက် ဇီဝဓာတုနည်းဖြင့် သီးခြားပြန်စစ်သော စမ်းသပ်မှုများကို ပြုလုပ်ရန် အကြံပြုထားသည်။ ပြင်းအားပိုမြင့်သည့်အခါ အလင်းလျော့ပါးမှု ပိုဆိုးတတ်သည်ဆိုရုံဖြင့် 1 uM တွင် တိုင်းတာမှုအမှား မရှိဟု မယူဆပါနှင့်။

အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာ အာရုံခံပစ္စည်းများက ဆိုးဆေးဖြန့်ဝေမှုကို တိုင်းတာပြီး စီးဆင်းနှုန်းကို မတိုင်းတာပါ

Safranine O၊ TMRM နှင့် TMRE၊ rhodamine 123 နှင့် JC-1 တို့အားလုံးသည် အမြှေးပါးကို ဖြတ်သန်းနိုင်သော အပေါင်းအိုင်းယွန်းများဖြစ်သည်။ ၎င်းတို့သည် လျှပ်စစ်ဓာတု ညီမျှခြေကို လိုက်၍ အနှုတ်လျှပ်စစ်ဓာတ်ရှိသော မက်ထရစ်အတွင်း စုဝေးကြသည်။ ထို့ကြောင့် စုစုပေါင်းဖလူအိုရက်ဆင့်အလင်းသည် အာရုံခံပစ္စည်းရှိနေသည့် နေရာမှတစ်ဆင့် လျှပ်စစ်အလားအလာကို သွယ်ဝိုက်ဖော်ပြသည်။ ၎င်းတို့အနက် မည်သည့်ပစ္စည်းကမျှ ATP သို့မဟုတ် အီလက်ထရွန်စီးဆင်းနှုန်းကို မတိုင်းတာပါ။

အာရုံခံပစ္စည်းတစ်မျိုးစီတွင် ပိုမိုသင့်လျော်သော နမူနာပြင်ဆင်ပုံရှိသည်။ Safranine O သည် သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများနှင့် အမြှေးပါးစိမ့်ဝင်နိုင်အောင် ပြုလုပ်ထားသော ဆဲလ်များအတွက် သင့်လျော်သည်။ ပုံမှန်အားဖြင့် 2 uM ခန့်၊ လှုံ့ဆော်အလင်းလှိုင်းအလျား 495 nm ခန့်နှင့် ထုတ်လွှတ်အလင်းလှိုင်းအလျား 585 nm ခန့်တွင် အသုံးပြုကြပြီး၊ အာရုံခံပစ္စည်း စုပ်ယူဝင်ရောက်မှုက စုစုပေါင်းဖလူအိုရက်ဆင့်အလင်းကို ပြောင်းလဲစေသော အလင်းလျော့ပါးမှုအခြေအနေ၌ လုပ်ဆောင်သည်။ TMRM နှင့် TMRE တို့သည် မပျက်မစီးရှိသော ဆဲလ်များတွင် နာနိုမိုလာအဆင့် နည်းပါးသော ထည့်သွင်းပမာဏဖြင့် အလင်းလျော့ပါးမှုမဖြစ်သော ပုံစံ၌ အသုံးပြုရန် သင့်လျော်သည်။ ထိုအခြေအနေတွင် လျှပ်စစ်အလားအလာ ပျက်ပြယ်သွားသောအခါ ဆိုးဆေးထွက်လာပြီး မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား၏ ဖလူအိုရက်ဆင့်အလင်း ကျဆင်းသည်။ ထည့်သွင်းပမာဏမြင့်သောအခါ ကိုယ်တိုင်အလင်းလျော့ပါးစေမှုကြောင့် အချက်ပြပြောင်းလဲမှု၏ ဦးတည်ချက် ပြောင်းပြန်ဖြစ်နိုင်သည်။ JC-1 သည် အစိမ်းနှင့် အနီအချိုးကို အဆင်ပြေစွာ ပေးနိုင်သော်လည်း ထည့်သွင်းပမာဏနှင့် မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားထုထည်အပေါ် မူတည်သည်။ ထို့ကြောင့် ပမာဏတိကျစွာ တိုင်းတာသည့်လုပ်ငန်းတွင် သေချာစွာ ထိန်းချုပ်ထားသော TMRM ထက် အားနည်းသည်။ ထိုအားသာချက်နှင့် အားနည်းချက်များကို အသုံးများသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာ အာရုံခံပစ္စည်းများအကြောင်း သုံးသပ်ချက် တွင် အကျဉ်းချုပ်ဖော်ပြထားသည်။

မက်သလင်းဘလူးသည် အမှန်တကယ်အသုံးပြုနေသော ပြင်းအားများတွင်ပင် အလင်းဆိုင်ရာ အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသည်။ 600 မှ 665 nm ဝန်းကျင်ရှိ ၎င်း၏ အလင်းစုပ်ယူမှုအပိုင်းအခြားများသည် အနီရောင် အာရုံခံပစ္စည်း၏ အလင်းထုတ်လွှတ်မှုနှင့် ထပ်နေသည်။ ထို့ကြောင့် နမူနာအတွင်း အလင်းစုပ်ယူခံရမှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်သော စစ်ထုတ်သက်ရောက်မှု၊ အလင်းလျော့ပါးမှုနှင့် လှုံ့ဆော်အလင်း စုပ်ယူခံရမှုတို့အားလုံး ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသည်။ ထိုဆိုးဆေးသည် ဒုတိယ အဆီပျော်အပေါင်းအိုင်းယွန်းတစ်ခုလည်းဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းကိုယ်တိုင်၏ ဖြန့်ဝေမှုက တိုင်းတာနေသော လျှပ်စစ်အလားအလာနှင့်အတူ ပြောင်းလဲသည်။ ကာကွယ်ရန်နည်းလမ်းမှာ သီးခြားတိုင်းတာချက်များဖြင့် ထပ်မံအတည်ပြုခြင်းနှင့် နမူနာမပါသော စမ်းသပ်ချက်များဖြစ်သည်။ အာရုံခံပစ္စည်းတစ်မျိုးတည်း၊ ဆိုးဆေးတစ်မျိုးတည်း၊ အာရုံခံပစ္စည်းနှင့် ဆိုးဆေးပြင်းအားတစ်ခုစီ ပေါင်းစပ်ထားခြင်း၊ သုညရည်ညွှန်းချက်အဖြစ် FCCP ဖြင့် လျှပ်စစ်အလားအလာ အပြည့်အဝပျက်ပြယ်စေခြင်း၊ ဖြစ်နိုင်လျှင် အလင်းဂုဏ်သတ္တိ မတူသော ဒုတိယအာရုံခံပစ္စည်းတစ်ခုတို့ကို အသုံးပြုသင့်သည်။ Complex III ကို ရှောင်ကွင်းသော လမ်းကြောင်း လေ့လာမှု သည် antimycin နှင့် myxothiazol တို့ဖြင့် တားဆီးပြီးနောက် အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာ ပြန်လည်ကောင်းမွန်မှုကို safranine O နှင့် TMRM နှစ်မျိုးစလုံးဖြင့် ထပ်မံတိုင်းတာ၍ သဘောသဘာဝအရ တူညီသော ပြန်လည်ကောင်းမွန်မှုကို ရရှိခြင်းဖြင့် ထိုနမူနာကို ပြသခဲ့သည်။ အလင်းအခြေပြု အချက်ပြပစ္စည်းတစ်မျိုးသည် အရိပ်အမြွက်သာဖြစ်သည်။ သီးခြားလွတ်လပ်သော အချက်ပြပစ္စည်းနှစ်မျိုးသည် အထောက်အထားဖြစ်သည်။

နမူနာပြင်ဆင်ပုံ သုံးမျိုး၊ မတူညီသော မေးခွန်း သုံးမျိုး

သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများ၊ အမြှေးပါးစိမ့်ဝင်နိုင်အောင် ပြုလုပ်ထားသော ဆဲလ်များနှင့် မပျက်မစီးရှိသော ဆဲလ်များသည် စမ်းသပ်တိုင်းတာမှုတစ်ခု၏ အပြန်အလှန်အစားထိုးနိုင်သော အာရုံခံနိုင်စွမ်းချိန်ညှိချက်များ မဟုတ်ပါ။ ၎င်းတို့သည် လုပ်ဆောင်ပုံအခြေခံမူများ မတူညီသော သီးခြားအယူအဆများဖြစ်သည်။

သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများသည် အီလက်ထရွန်သယ်ပို့ကွင်းဆက်၊ အတွင်းအမြှေးပါးနှင့် မက်ထရစ်အတွင်း လုပ်ဆောင်မှုစနစ်များကို ထိန်းသိမ်းထားသော်လည်း ဆဲလ်အမြှေးပါး၊ ဆဲလ်ရည်နှင့် ကွန်ရက်ဖွဲ့စည်းပုံတို့ကို ဖယ်ရှားထားသည်။ ထိုဖယ်ရှားမှုကပင် ရည်ရွယ်ချက်ဖြစ်သည်။ ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်းများ၊ ADP၊ တားဆီးပစ္စည်းများနှင့် ဆိုးဆေးပြင်းအားများကို အတိအကျသတ်မှတ်နိုင်သောကြောင့် သက်ဆိုင်ရာလမ်းကြောင်းကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သည်။ သို့သော် သဘာဝအခြေအနေရှိ ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်း ပံ့ပိုးမှု၊ အချက်ပြမှုနှင့် လိုအပ်ချက်တို့ ဆုံးရှုံးသွားသည်။

အမြှေးပါးစိမ့်ဝင်နိုင်အောင် ပြုလုပ်ထားသော ဆဲလ်များသည် မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများကို ဆဲလ်ဖွဲ့စည်းပုံ၏ အများစုအတွင်း ဆက်လက်ထားရှိပြီး၊ ဖွင့်ထားသော ဆဲလ်အမြှေးပါးမှတစ်ဆင့် ပြင်ပမှပေးသော ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်းများနှင့် ADP ကို ဝင်ရောက်ခွင့်ပြုသည်။ ဆဲလ်အခြေအနေအတွင်း ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်းနှင့်ဆိုင်သော လမ်းကြောင်းချို့ယွင်းမှုကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် သင့်လျော်သော နည်းလမ်းဖြစ်သည်။ စိမ့်ဝင်နိုင်စွမ်းကို အလွန်အကျွံဖန်တီးပါက အပြင်အမြှေးပါး ပျက်စီးနိုင်ပြီး၊ ဆဲလ်ရည်အတွင်း ထိန်းညှိမှုများလည်း ဆေးကြောထွက်သွားသည်။

မပျက်မစီးရှိသော ဆဲလ်များသည် အရာအားလုံးကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ဆဲလ်အမြှေးပါး အတားအဆီး၊ ဆဲလ်ရည်အတွင်း ဓာတ်လျော့ပစ္စည်းများ၊ ဆဲလ်အတွင်းရှိ ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်း သယ်ပို့မှု၊ မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားကွန်ရက်နှင့် ATP လိုအပ်ချက်တို့ ပါဝင်သည်။ ၎င်းတို့သည် ဇီဝကမ္မအခြေအနေနှင့် အနီးစပ်ဆုံးဖြစ်ပြီး ယန္တရားကို တိတိကျကျခွဲခြားရန် အခက်ခဲဆုံးဖြစ်သည်။ အကြောင်းမှာ ဆိုးဆေး စုပ်ယူဝင်ရောက်မှု၊ ဓာတ်လျော့မှုနှင့် သီးခြားနေရာတွင် ထိန်းသိမ်းစုဝေးမှုတို့အားလုံးက မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားထံ အမှန်တကယ်ရောက်ရှိသော ဆိုးဆေးထိတွေ့မှုကို သတ်မှတ်ပေးသောကြောင့်ဖြစ်သည်။

TEGDMA လေ့လာမှုသည် အဆင့်သုံးဆင့်စလုံးကို ရည်ရွယ်ချက်ရှိရှိ အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဓာတ်တိုးမှုနှင့် လျှပ်စစ်အလားအလာကို ဆိုးဆေးက ပြန်လည်ကောင်းမွန်စေမှုအတွက် သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော ဦးနှောက်မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားများ၊ ချို့ယွင်းမှုသည် Complex I နှင့်ဆက်စပ်သော ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်း ဓာတ်တိုးမှုတွင် ရှိကြောင်း အဓိကခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် အမြှေးပါးစိမ့်ဝင်နိုင်အောင် ပြုလုပ်ထားသော သွားပျော့ဖတ် ပင်မဆဲလ်များ၊ ဖိနှိပ်ခံထားရသော အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှုအပေါ် ဆိုးဆေး 2 uM ၏ ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ အသားတင်သက်ရောက်မှုအတွက် မပျက်မစီးရှိသော ပင်မဆဲလ်များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ နမူနာပြင်ဆင်ပုံ မတူညီသည့်အကြား မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား တိုင်းတာချက်များကို နှိုင်းယှဉ်နေသော စာဖတ်သူများအတွက် မက်သလင်းဘလူးက အသက်ရှူကွင်းဆက်တစ်လျှောက် အီလက်ထရွန်များကို မည်သို့ရွှေ့ပေးသနည်းဆိုသည့် တွဲဖက်ရှင်းလင်းဆောင်းပါးက လမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ နောက်ခံအချက်အလက်ကို ပေးထားသည်။ မက်သလင်းဘလူး အသက်ရှူခြင်းလေ့လာမှုများကို ဖတ်ရှုရန် လမ်းညွှန်က အသုံးပြုပမာဏနှင့် တားဆီးပစ္စည်းဆိုင်ရာ ယုတ္တိကို ရှင်းပြထားသည်။

ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့တွင် ပါဝင်သော ဆိုးဆေးအတွက် လိုအပ်သည့် ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှုများ

ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့ စက်ဝန်းလည်ပတ်ပစ္စည်းတစ်ခုသည် သာမန်တားဆီးပစ္စည်းတစ်ခုထက် ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှု ပိုများရန် လိုအပ်သည်။ အကြောင်းမှာ ဆိုးဆေးသက်သက်၏ ဓာတုဖြစ်စဉ်က ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် တူသယောင်ဖြစ်စေနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။

အသက်ရှူခြင်းဆိုင်ရာတိုင်းတာမှုအတွက် တိုင်းတာချက်တဖြည်းဖြည်းလွဲရွေ့မှုကို စစ်ဆေးရန် ကြားခံပျော်ရည်သက်သက်ပါသော တိုင်းတာခန်း၊ ဇီဝပစ္စည်းမပါဘဲ ကြားခံပျော်ရည်နှင့် ဆိုးဆေးပါသော တိုင်းတာခန်း၊ ဆိုးဆေးနှင့် စမ်းသပ်မှုအတွင်းရှိ ဆဲလ်ပြင်ပ ဓာတ်လျော့ပစ္စည်းမှန်သမျှ ပေါင်းစပ်ထားသော စမ်းသပ်ချက်တို့ကို ပြုလုပ်ပါ။ မပျက်မစီးရှိသော ဆဲလ်များတွင် မိုင်တိုကွန်ဒရီးယားပြင်ပ အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှုကို သတ်မှတ်ရန် နောက်ဆုံးအဆင့်၌ rotenone နှင့် antimycin ကို ထည့်သုံးပါ။ ဓာတ်လျော့ခံထားရသော ဆိုးဆေးသည် အောက်ဆီဂျင်ထံ အီလက်ထရွန်များ လွှဲပေး၍ ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ် ဖြစ်ပေါ်စေကာ ပြန်လည်ဓာတ်တိုးသွားကြောင်း သတိပြုပါ။ ထို့ကြောင့် အီလက်ထရွန်ပေးအပ်ပစ္စည်း မပါသော ဆိုးဆေးသက်သက် နမူနာလွတ်စမ်းသပ်ချက်သည် NADH သို့မဟုတ် NADPH ရရှိလာသည်နှင့် ပေါ်ပေါက်သည့် ဆဲလ်မပါသော အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှုကို လျှော့တွက်မိစေသည်။

ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ်အတွက် ရွေးချယ်တိကျမှုမရှိသော DCFDA ဆိုးဆေးများထက် စံချိန်ညှိထားသော Amplex UltraRed နှင့် horseradish peroxidase ကို တွဲသုံးရန် ဦးစားပေးပါ။ catalase ဖြင့် အတည်ပြုပါ။ ဆိုးဆေးသည် အလင်းတုံ့ပြန်လွယ်စေသော ပစ္စည်းဖြစ်သောကြောင့် အလင်းပေးခြင်းအပေါ် မူတည်မှုကိုလည်း စမ်းသပ်ပါ။ ဦးနှောက်မိုင်တိုကွန်ဒရီးယား လေ့လာမှုတွင် ဆိုးဆေး 100 nM မျှဖြင့်ပင် ပါအောက်ဆိုဒ်ဝန် လေးဆကျော် မြင့်တက်လာပြီး ဖယ်ရှားနှုန်း နှေးသွားကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ပါအောက်ဆိုဒ်သည် စူပါအောက်ဆိုဒ် ကြားခံအဆင့်မပါဘဲ ဓာတ်လျော့ခံထားရသော ဆိုးဆေးမှ တိုက်ရိုက်ဖြစ်ပေါ်ခဲ့သည်။ အာရုံခံပစ္စည်း ရွေးချယ်မှုနှင့် အလင်းဆိုင်ရာ ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှု အသေးစိတ်များကို ဆိုးဆေးစမ်းသပ်မှုများတွင် ဓာတ်ပြုလွယ်သော အောက်ဆီဂျင်မျိုးစိတ်များကို တိုင်းတာခြင်း ဆိုင်ရာ တွဲဖက်ဆောင်းပါးတွင် ရှင်းပြထားသည်။ ပါအောက်ဆိုဒ်သည် မည်သည့်အချိန်၌ အချက်ပြအဖြစ် လုပ်ဆောင်ပြီး မည်သည့်အချိန်၌ ဝန်ထုပ်ဝန်ပိုးဖြစ်လာသနည်းဆိုသည့် ပိုမိုကျယ်ပြန့်သော မေးခွန်းကို ဆဲလ်အတွင်း ဓာတ်တိုး-ဓာတ်လျော့ ဟန်ချက်နှင့် ဓာတ်တိုးဆန့်ကျင်မှုဆိုင်ရာ ပြောဆိုချက်များ နှင့်အတူ ဆွေးနွေးထားသည်။

လမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ပြောဆိုချက်များအတွက် Complex III တားဆီးပစ္စည်း၏ နေရာနှစ်ခုစလုံးကို စမ်းသပ်ပါ။ Qi နေရာတွင် antimycin A၊ Qo နေရာတွင် myxothiazol နှင့်အတူ Complex IV ၏ နောက်ဆုံးအဆင့်စမ်းသပ်ချက်အတွက် cyanide ကို အသုံးပြုပါ။ အစောပိုင်း ကြွက်ဦးနှောက် လေ့လာမှုတစ်ခုက ဆိုးဆေးသည် rotenone ဖြင့် ပိတ်ဆို့ထားသော အသက်ရှူခြင်းကို ပြန်လည်ကောင်းမွန်စေသော်လည်း antimycin ဖြင့် ပိတ်ဆို့ထားသော အသက်ရှူခြင်းကို မပြန်လည်ကောင်းမွန်စေကြောင်း ဖော်ပြခဲ့သည်။ နောက်ပိုင်း မျိုးစိတ်သုံးမျိုး လေ့လာမှုတွင်မူ တားဆီးပစ္စည်းနှစ်မျိုးစလုံးနှင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ပြန်လည်ကောင်းမွန်မှုအပြင် cytochrome c ကို တိုက်ရိုက်ဓာတ်လျော့စေမှု အထောက်အထားကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ရှောင်ကွင်းလမ်းကြောင်းကို အပြီးသတ်သတ်မှတ်ပြီးသားဟု မယူဆဘဲ ပိုမိုသစ်သော အချက်အလက်များနှင့် ကိုက်ညီနိုင်သည့် လမ်းကြောင်းအဖြစ်သာ သဘောထားပါ။ ဆိုးဆေးပြင်းအား၊ တားဆီးပစ္စည်း၏ လုပ်ဆောင်ရာနေရာ၊ ဓာတ်ပြုအခြေခံပစ္စည်းအခြေအနေနှင့် ဆိုးဆေးဖြန့်ဝေမှုတို့အားလုံးသည် တွေ့ရှိရသော လမ်းကြောင်းကို ပြောင်းလဲစေသောကြောင့်ဖြစ်သည်။

စမ်းသပ်တိုင်းတာမှု ရွေးချယ်ရေးဇယား

တိုင်းတာမှုမှ မေးခွန်းကို ပြန်ရွေးခြင်းမဟုတ်ဘဲ မေးခွန်းအပေါ်မူတည်၍ တိုင်းတာမှုကို ရွေးရန် ဤဇယားကို အသုံးပြုပါ။

အနည်းဆုံး ယုံကြည်လက်ခံနိုင်သော ပြောဆိုချက်တစ်ခုအတွက် တူညီသော ဆိုးဆေးပြင်းအားများဖြစ်သည့် 100 nM၊ 300 nM၊ 1 uM နှင့် 2 uM တို့ကို အသုံးပြု၍ ယိုစိမ့်မှု၊ ADP၊ oligomycin နှင့် တွဲဖက်မှုဖြတ်တောက်ပစ္စည်း အခြေအနေများအောက်တွင် အောက်ဆီဂျင်စီးဆင်းနှုန်းကို တိုင်းတာရမည်။ ထို့အပြင် ATP ထုတ်လုပ်နှုန်း၊ ဖြစ်နိုင်လျှင် အာရုံခံပစ္စည်းနှစ်မျိုးဖြင့် အမြှေးပါးလျှပ်စစ်အလားအလာနှင့် catalase၊ ဆဲလ်မပါသော ထိန်းချုပ်စမ်းသပ်မှုများပါဝင်သည့် စံချိန်ညှိထားသော ပါအောက်ဆိုဒ်ထုတ်လွှတ်မှုကိုလည်း တိုင်းတာရမည်။ ဆက်စပ်နေသော အချက်အလက်အစုကို ဖော်ပြပါ။ အောက်ဆီဂျင်စီးဆင်းနှုန်း၊ ATP ထုတ်လုပ်နှုန်း၊ အောက်ဆီဂျင်တစ်ယူနစ်လျှင် ATP၊ လျှပ်စစ်အလားအလာနှင့် ပါအောက်ဆိုဒ်တို့ ဖြစ်သည်။ ထိုကိန်းဂဏန်းများအနက် မည်သည့်တစ်ခုမဆို တစ်ခုတည်းရှိနေပါက အဓိပ္ပာယ်ကို ရှာဖွေနေရဆဲ တိုင်းတာချက်တစ်ခုသာ ဖြစ်သည်။