Żbigħ sempliċi bil-blu tal-metilen kontra żbigħ ta’ Gram: x’jista’ jipprova kull metodu

Student jipprepara kampjun mifrux minn kultura bit-tikketta E. coli, jgħattih bil-blu tal-metilen għal minuta, ilaħalħu, u jħares mil-lenti tal-immersjoni fiż-żejt. Bacilli blu jimlew il-kamp viżiv. Ir-rapport tal-laboratorju jgħid: "Bacilli Gram-negattivi identifikati bħala E. coli." L-osservazzjoni hija korretta. Dik il-ħġieġa ma tiġġustifikax il-konklużjoni.

L-iżball huwa kunċettwali, mhux tekniku. L-istudent ittratta żbigħ sempliċi bħallikieku kien test differenzjali. Żbigħ sempliċi u żbigħ ta’ Gram iwieġbu mistoqsijiet differenti għax huma bbażati fuq kunċetti differenti ta’ żbigħ. Wieħed jistaqsi: liema forma hija preżenti. L-ieħor jistaqsi: kif iġib ruħu l-ħajt taċ-ċellula meta jiġi ssuġġettat għal test. Jekk tħallat it-tnejn, ħġieġa miżbugħa kif suppost twassal għal rapport mhux ġustifikat.

Dan it-tqabbil iżomm iż-żewġ metodi separati, juri x’tippermettilek tiddikjara kull riżultat, u jwieġeb iż-żewġ mistoqsijiet li l-istudenti jistaqsu l-aktar: il-blu tal-metilen jista’ jintuża fiż-żbigħ ta’ Gram, u x’juri tassew żbigħ ta’ E. coli bil-blu tal-metilen.

It-tweġiba fil-qosor

Iż-żbigħ sempliċi bil-blu tal-metilen jagħti l-istess kulur blu lil kull ċellula li tista’ tinżebagħ, għalhekk juri l-morfoloġija (bacilli, sferi, spirali) u l-arranġament (waħedhom, f’pari, f’ktajjen), iżda ma juri xejn dwar il-kategorija ta’ Gram. Iż-żbigħ ta’ Gram iżid il-jodju, pass ta’ dekolorizzazzjoni, u kontrożebgħa, u għalhekk jifred il-batterji fi Gram-pożittivi (vjola) u Gram-negattivi (roża jew ħomor) skont kif l-għata tagħhom iżżomm iż-żebgħa. Bacilli blu wara l-blu tal-metilen ifissru "ċelluli f’forma ta’ virga huma preżenti." Bacilli roża wara s-sekwenza sħiħa ta’ Gram ifissru "bacilli Gram-negattivi huma preżenti." It-tieni dikjarazzjoni għandha bażi aktar soda għax il-proċedura wettqet test addizzjonali.

Għall-familja usa’ ta’ metodi batterjali b’żebgħa waħda li jagħmel parti minnha dan l-artiklu, ara l-atlas taż-żbigħ fil-mikroskopija.

Żbigħ sempliċi: żebgħa waħda, mistoqsija waħda

Il-blu tal-metilen huwa żebgħa bażika (katjonika). Il-jonu kkulurit tiegħu għandu ċarġ pożittiv u jeħel ma’ strutturi b’ċarġ negattiv fiċ-ċellula, inklużi l-aċidi nuklejċi u l-gruppi aċidużi tal-wiċċ, u għalhekk iċ-ċelluli jidhru blu fuq sfond ċar. OpenStax jiddeskrivi dan il-prinċipju taż-żbigħ pożittiv fil-kapitlu tiegħu dwar iż-żbigħ. Il-katjon taż-żebgħa nnifsu huwa l-jonu żgħir u ċatt tal-fenotijażina deskritt fid-dettall fir-referenza dwar il-kimika tal-blu tal-metilen; il-kontrajonu tal-klorur mhuwiex dak li jagħti l-kulur.

Protokoll standard għat-tagħlim huwa sempliċi apposta: ipprepara kampjun mifrux irqiq, ħallih jinxef fl-arja, iffissah bis-sħana, għattih b’soluzzjoni milwiema ta’ blu tal-metilen ta’ madwar 1% għal madwar minuta, laħalħu bil-mod bl-ilma, nixxfu billi tmissu ħafif b’karta assorbenti, u eżaminah b’immersjoni fiż-żejt. Protokoll tat-tagħlim ta’ LibreTexts jagħti eżattament din il-verżjoni ta’ 1% għal minuta, filwaqt li jinnota li xi laboratorji jtawlu l-ħin. L-ebda mordent, l-ebda dekolorizzant, l-ebda tieni żebgħa. Din l-assenza hija l-punt ewlieni. B’żebgħa waħda biss u mingħajr tneħħija selettiva, kull ċellula li torbot iż-żebgħa tispiċċa bl-istess kulur.

B’E. coli, il-kamp viżiv mistenni fih bacilli blu, waħedhom jew f’pari jew fi gruppi żgħar. Il-blu ġej miż-żebgħa. Il-forma ta’ virga ġejja mill-organiżmu. Iżda din il-kombinazzjoni ma tidentifikax l-organiżmu, għax ħafna speċi għandhom forma ta’ virga u ħafna bacilli jinżebgħu blu f’żbigħ sempliċi. ATCC jagħmilha ċara fil-gwida tiegħu għall-kulturi mikrobijoloġiċi li dan il-metodu huwa limitat għall-morfoloġija biss. Rapport korrett jgħid: "ġew osservati bacilli blu." Kull dikjarazzjoni lil hinn mill-forma u l-arranġament teħtieġ aktar evidenza.

Żbigħ ta’ Gram: erba’ reaġenti, test wieħed tal-imġiba

Iż-żbigħ ta’ Gram huwa żbigħ differenzjali. Jissuġġetta ċ-ċelluli kollha għall-istess sekwenza u juri liema ċelluli jżommu l-ewwel żebgħa u liema jitilfuha. Il-protokolli taż-żbigħ ta’ Gram tal-American Society for Microbiology jiddefinixxu l-ordni standard ta’ erba’ passi: vjola tal-kristall (żebgħa primarja), jodju ta’ Gram (mordent), alkoħol jew taħlita ta’ aċetun u alkoħol (dekolorizzant), imbagħad safranina (kontrożebgħa).

Il-mudell standard tat-tagħlim jispjega din id-diviżjoni permezz tal-istruttura tal-għata taċ-ċellula. Iċ-ċelluli Gram-pożittivi għandhom ħajt oħxon ta’ peptidoglikan li jiddeidrata u jżomm il-kumpless tal-vjola tal-kristall u l-jodju waqt il-ħasil bl-alkoħol. Iċ-ċelluli Gram-negattivi għandhom saff irqiq ta’ peptidoglikan flimkien ma’ membrana esterna rikka fil-lipidi li d-dekolorizzant ifixkel, għalhekk il-kumpless jitneħħa bil-ħasil u ċ-ċelluli mbagħad jieħdu s-safranina. Ir-reviżjoni dwar iż-żbigħ ta’ Gram f’NCBI Bookshelf tagħti din l-ispjegazzjoni tal-ħajt taċ-ċellula. L-ispeċjalisti jżidu li l-proċessi fiżikokimiċi sħaħ huma aktar ikkumplikati mill-ħxuna tal-ħajt biss, iżda għall-interpretazzjoni fil-laboratorju r-regola tal-imġiba tibqa’ valida: il-vjola jfisser li l-kumpless inżamm, ir-roża jfisser li ntilef u mbagħad intużat kontrożebgħa.

Panewijiet illustrattivi. Tpinġijiet stilizzati għat-tqabbil tal-metodi, mhux mikrografiji meħuda b’kamera. Il-kuluri huma ssimplifikati biex jgħallmu l-loġika: kulur wieħed f’żbigħ sempliċi, żewġ kuluri wara d-dekolorizzazzjoni ta’ Gram.

Il-blu tal-metilen jista’ jintuża fiż-żbigħ ta’ Gram

Din il-mistoqsija għandha żewġ interpretazzjonijiet, u jeħtieġu tweġibiet differenti.

L-ewwel interpretazzjoni: applikazzjoni waħda tal-blu tal-metilen tista’ tieħu post is-sekwenza kollha ta’ Gram. Le. Mingħajr jodju, dekolorizzant, u kontrożebgħa ma jkun hemm ebda pass differenzjali, għalhekk ma tiġi ttestjata ebda kategorija ta’ Gram. Kamp viżiv blu wara l-blu tal-metilen waħdu huwa riżultat ta’ żbigħ sempliċi anki jekk il-flixkun ikun ħdejn ir-reaġenti ta’ Gram. Tirreġistrahx bħala riżultat ta’ Gram.

It-tieni interpretazzjoni: il-blu tal-metilen jista’ jieħu post is-safranina bħala l-kontrożebgħa fil-pass 4. Funzjonalment jista’ jagħti kulur liċ-ċelluli dekolorizzati, u eżerċizzju f’ktieb tat-tagħlim ibassar ċelluli Gram-pożittivi vjola u ċelluli Gram-negattivi blu wara sostituzzjoni bħal din. Il-loġika hija valida għax ċelluli Gram-negattivi dekolorizzati kif suppost ikunu kważi bla kulur u jieħdu żebgħa katjonika oħra. Iżda dan mhuwiex il-protokoll standard. Il-protokolli ta’ ASM jispeċifikaw is-safranina, b’alternattivi rikonoxxuti bħall-fuksina bażika f’xi varjanti, mhux il-blu tal-metilen. Hemm ukoll żvantaġġ prattiku: huwa aktar diffiċli tiddistingwi l-blu mill-vjola milli r-roża mill-vjola, speċjalment għall-prinċipjanti u speċjalment b’bozoz tal-mikroskopju li jkunu tilfu mill-qawwa tagħhom. Għax-xogħol tal-kors u għal kull riżultat importanti, uża l-kontrożebgħa msemmija fil-protokoll tiegħek, ġeneralment is-safranina, u ttratta kontrożebgħa bil-blu tal-metilen bħala varjant ta’ dimostrazzjoni aktar milli bħala standard ekwivalenti.

Il-mistoqsija relatata ta’ kif il-blu tal-metilen jitqabbel ma’ għażliet oħra b’żebgħa waħda hija ttrattata f’tqabbil ta’ metodi ta’ żbigħ sempliċi tal-batterji.

X’jipprova żbigħ ta’ E. coli bil-blu tal-metilen, u x’ma jipprovax

E. coli huwa bacillu Gram-negattiv, iżda dik is-sentenza tgħaqqad fatti minn diversi metodi: il-morfoloġija mill-mikroskopija, ir-reazzjoni ta’ Gram minn żbigħ ta’ Gram, l-identità minn kultura flimkien ma’ testijiet bijokimiċi jew molekulari. Kampjun mifrux miżbugħ bil-blu tal-metilen jikkontribwixxi biss l-ewwel parti. Jistabbilixxi li fil-kampjun miżbugħ hemm ċelluli f’forma ta’ virga u kif huma rranġati. Ma jistabbilixxix ir-reazzjoni ta’ Gram, għax ma sar ebda test ta’ dekolorizzazzjoni. Ma jidentifikax l-ispeċi, għax bacilli ta’ ħafna speċi jidhru simili f’din ir-riżoluzzjoni.

Hawnhekk ir-rapporti jiżbaljaw b’mod prevedibbli. Min jikteb idaħħal għarfien minn qabel ("din il-kultura suppost hija E. coli, u E. coli huwa Gram-negattiv") fil-linja tal-osservazzjoni, u għalhekk il-ħġieġa tidher li tikkonferma dak li fil-fatt kien assunt. Rapport aktar ċar jifred il-livelli: "Żbigħ sempliċi bil-blu tal-metilen: ġew osservati bacilli blu; morfoloġija biss, ma ġiet ittestjata ebda kategorija ta’ Gram." Imbagħad, jekk sar żbigħ ta’ Gram kif suppost b’kontrolli: "Żbigħ ta’ Gram: bacilli roża, konsistenti ma’ Gram-negattivi." L-identità tal-ispeċi tiġi aktar tard, mill-proċess ta’ identifikazzjoni, mhux mill-kulur waħdu.

Gwida prattika għall-interpretazzjoni

Uża din ir-regola biex tiddeċiedi waqt ix-xogħol fil-laboratorju. Jekk iċ-ċelluli kollha għandhom kulur wieħed u l-protokoll uża żebgħa waħda mingħajr dekolorizzant, wettaqt żbigħ sempliċi. Irrapporta l-forma, stima tad-daqs, u l-arranġament. Ieqaf hemm. Jekk il-protokoll uża l-vjola tal-kristall, il-jodju, id-dekolorizzant, u l-kontrożebgħa b’kontrolli pożittivi u negattivi magħrufa, wettaqt żbigħ ta’ Gram. Irrapporta l-kulur flimkien mal-morfoloġija: kokki vjola f’ktajjen, bacilli roża, u l-bqija.

Tliet żbalji jispjegaw il-biċċa l-kbira tal-konfużjoni. L-ewwel, li wieħed jinterpreta l-bacilli blu bħala konferma ta’ E. coli. It-tieni, li jirreġistra ħġieġa miżbugħa bil-blu tal-metilen taħt l-intestatura "Żbigħ ta’ Gram" f’pitazz, li qarrejja aktar tard jinterpretaw ħażin. It-tielet, li jibdel il-kontrożebgħat mingħajr ħsieb u mbagħad iqabbel il-kuluri bejn laboratorji bħallikieku ntużaw l-istess paletti tal-kuluri. Kull żball għandu l-istess soluzzjoni: semmi l-metodu li fil-fatt twettaq, u ddikjara biss dak li jittestja dak il-metodu.

Iż-żbigħ sempliċi għandu postu proprju għax jagħmel dikjarazzjonijiet limitati. Huwa rapidu, jittollera varjazzjonijiet żgħar fil-proċedura, u huwa biżżejjed meta l-mistoqsija tkun dwar il-morfoloġija: hemm xi ħaġa, u x’forma għandha. Meta l-mistoqsija tkun dwar il-klassifikazzjoni, wettaq it-test differenzjali. Il-ħġieġa blu turik kif jidhru ċ-ċelluli. Il-ħġieġa vjola jew roża turik kif iġibu ruħhom il-ħitan tagħhom. L-ebda waħda mill-ħġieġ, waħedha, ma tgħidlek l-ispeċi.