Il-blu tal-metilen u l-ossidu nitriku: NOS, cGMP, u s-sinjalar vaskulari

Il-mistoqsija tidher sempliċi: il-blu tal-metilen jinibixxi l-ossidu nitriku? Fil-laboratorju, it-tweġiba tinqasam f’erba’ mistoqsijiet separati, u kull waħda għandha test sperimentali differenti. It-taħlit tagħhom huwa r-raġuni ewlenija għaliex il-kitba dwar il-blu tal-metilen u l-ossidu nitriku tidher ċerta iżda vaga.

Aħseb fis-sinjal tal-ossidu nitriku bħala katina b’erba’ ħoloq. Ġene jiġi traskritt biex issir is-sintażi tal-ossidu nitriku. L-enzima tikkonverti l-arġinina f’ossidu nitriku. Il-gass jinfirex lejn il-mira tiegħu qabel ma jirreaġixxi ma’ xi ħaġa oħra. Iċ-ċiklażi solubbli tal-gwanilat tinduna bih u tagħmel GMP ċikliku. Ġew ippubblikati effetti tal-blu tal-metilen f’kull ħolqa, iżda l-evidenza ġejja minn preparazzjonijiet differenti, konċentrazzjonijiet differenti, u iżoformi differenti. Riżultat f’ħolqa waħda ma jipprovax azzjoni f’oħra.

Il-katina kanonika, fi kliem ċar

Fil-ħajt ta’ vina jew arterja, is-sekwenza standard timxi hekk. Stimolu jaġixxi fuq ċellula endoteljali. Is-sintażi endoteljali tal-ossidu nitriku, imsejħa eNOS jew NOS3, tagħmel polz żgħir ta’ ossidu nitriku. Il-gass jinfirex fiċ-ċellula tal-muskolu lixx fil-qrib, jintrabat mal-eme li fih ħadid ridott taċ-ċiklażi solubbli tal-gwanilat, u jaċċellera l-konverżjoni ta’ GTP għal GMP ċikliku. Il-GMP ċikliku jattiva l-proteina kinażi G, jinbidel il-mod kif jiġi mmaniġġjat il-kalċju, u l-muskolu jirrilassa.

Hemm katina oħra li tajjeb tinżamm separata. Waqt infezzjoni jew esponiment għaċ-ċitokini, iċ-ċelluli jittraskrivu enzima differenti, is-sintażi induċibbli tal-ossidu nitriku jew iNOS, magħrufa wkoll bħala NOS2. Din tipproduċi flussi ta’ ossidu nitriku akbar u li jdumu aktar minn dawk ta’ eNOS. It-tielet iżoforma, NOS newronali jew nNOS, tappartjeni għal kuntest ieħor. Meta artiklu jsemmi s-sintażi tal-ossidu nitriku mingħajr ma jispeċifika l-iżoforma, ieqaf u ċċekkja liema waħda tkejlet. Il-ħarsa ġenerali lejn kif il-blu tal-metilen jittrasferixxi l-elettroni tagħmel l-istess punt dwar il-miri redox b’mod ġenerali: it-trasferiment ma jagħmel xejn waħdu, u s-sieħeb f’kull tarf jiddetermina r-riżultat.

Il-GMP ċikliku mkejjel huwa wkoll kejl integrat, mhux analiżi diretta tal-enzima. Il-livell tiegħu jirrifletti s-sinteżi miċ-ċiklażi nieqsa t-tkissir mill-fosfodijesterażijiet, speċjalment PDE5 fil-muskolu lixx vaskulari. Għalhekk, tnaqqis fil-GMP ċikliku jfisser li inqas sinjal wasal għand id-ditekter. Waħdu ma jidentifikax il-ħolqa li falliet.

Ħolqa 1: tiġi prodotta inqas enzima iNOS

F’makrofaġi tal-ġrieden stimulati bil-lipopolysaccharide batteriku, bl-interferon gamma, jew bit-tnejn, il-blu tal-metilen ipprevjena ż-żieda mistennija fil-proteina iNOS u trażżan b’mod qawwi l-RNA messaġġier ta’ iNOS fl-esperimenti tat-traskrizzjoni fil-makrofaġi. Il-parti li tagħti l-aktar informazzjoni hija dak li ma nbidilx. Id-degradazzjoni tal-inibitur I kappa B alpha, il-fosforilazzjoni ta’ NF kappa B u STAT1, u l-moviment ta’ dawn il-fatturi lejn in-nukleu baqgħu fil-biċċa l-kbira intatti. Dak li naqas kien ir-rabta tagħhom mad-DNA, kif ikkonfermat mill-immunopreċipitazzjoni tal-kromatina li wriet inqas okkupazzjoni fil-promotur ta’ iNOS.

Dan huwa effett regolatorju fuq il-ġene li jseħħ qabel il-bidla fl-abbundanza tal-enzima, mhux imblukkar akut ta’ enzima diġà eżistenti. Jappartjeni għas-sinjalar infjammatorju, fejn il-fatturi tat-traskrizzjoni jridu jintrabtu ma’ promotur qabel ma tidher il-proteina. Ma jgħid xejn dirett dwar eNOS kostituttiva f’vina jew arterja fi stat ta’ mistrieħ, u għandu jiġi deskritt f’dawn it-termini.

Ħolqa 2: l-enzima NOS eżistenti taħdem aktar bil-mod

Studju fil-firien ittestja livell differenti. Firien irġiel konxji ngħataw lipopolysaccharide ġol-vina, imbagħad tliet sigħat wara ngħataw jew soluzzjoni salina jew blu tal-metilen b’3 mg per kg ġol-vina. L-attività tas-sintażi tal-ossidu nitriku fl-ipotalamu bażali medjali tkejlet permezz tal-konverżjoni ta’ arġinina mmarkata f’ċitrullina fl-istudju tal-attività ta’ NOS fl-ipotalamu. L-istress flimkien mas-soluzzjoni salina biss induċa xi attività indipendenti mill-kalċju, u l-lipopolysaccharide għolliha għal madwar għaxar darbiet il-livell tal-kontroll. Il-blu tal-metilen elimina ż-żewġ komponenti indotti. L-attività kostituttiva dipendenti fuq il-kalċju ma nbidlitx f’dak it-tessut b’dik id-doża u f’dak il-punt taż-żmien.

Aqra dak ir-riżultat eżatt kif inkiteb: trażżin tal-attività mkejla tat-tip iNOS f’dawk il-kundizzjonijiet. Mhuwiex kejl tal-espressjoni tal-ġene, u mhuwiex prova ta’ selettività permanenti għal iNOS aktar milli għal eNOS jew nNOS. Ix-xogħol b’enzimi ppurifikati jsaħħaħ din il-kawtela. F’analiżijiet diretti tas-sintażi ppurifikata tal-ossidu nitriku, il-blu tal-metilen imblokka kompletament il-formazzjoni taċ-ċitrullina b’30 micromolar, b’konċentrazzjoni għal nofs inibizzjoni qrib 5.3 micromolar mingħajr dismutażi tas-superossidu u 9.2 micromolar magħha, kif irrappurtat fit-tqabbil bejn NOS ippurifikata u ċ-ċiklażi tal-gwanilat. Studju separat ta’ nNOS ippurifikata indika l-involviment tal-ossidazzjoni tal-eme marbut mal-enzima. Il-lezzjoni prattika hija li l-inibizzjoni diretta ta’ NOS hija reali f’sistemi iżolati, iżda r-riżultat tal-ipotalamu ma jistax jiġi estiż għal stqarrija ġenerali li l-blu tal-metilen ma jaffettwa ebda NOS kostituttiva, kull fejn tkun.

Ħolqa 3: l-ossidu nitriku jintilef qabel ma jasal

L-aktar dimostrazzjoni ċara li xi ħaġa oħra għajr l-imblukkar tal-enzima tista’ tispjega tnaqqis fil-GMP ċikliku ġejja minn ċelluli tal-muskolu lixx tal-arterja pulmonari tal-fenek imkabbra f’kultura. Id-disinn qabeż kompletament NOS endoġena billi żied direttament donaturi tal-ossidu nitriku, imbagħad staqsa jekk il-blu tal-metilen kienx għadu jrażżan ir-rispons tal-GMP ċikliku fl-istudju tas-superossidu fil-muskolu lixx vaskulari.

Ġew ittestjati tliet donaturi minn 1 sa 100 micromolar: S nitroso L cysteine, nitroprusside tas-sodju, u analogu stabbli deaminat imsejjaħ MPANO. Kollha għollew il-GMP ċikliku għal bejn madwar 1.5 darba u 12-il darba l-livell inizjali. Il-blu tal-metilen b’10 micromolar inibixxa l-ewwel tnejn b’51 sa 100 fil-mija u ħalla r-rispons għal MPANO mhux mibdul. Kieku l-blu tal-metilen kien sempliċement jimblokka s-sit katalitiku taċ-ċiklażi, dik is-selettività bejn id-donaturi kienet tkun diffiċli biex tiġi spjegata, għax it-tlieta jaġixxu fuq l-istess enzima aktar ’l isfel fil-katina.

Imbagħad tliet kontrolli rabtu l-mekkaniżmu mas-superossidu. L-ewwel, il-ġenerazzjoni ta’ superossidu barra ċ-ċelluli permezz ta’ xanthine flimkien ma’ xanthine oxidase rriproduċiet l-istess mudell: CYSNO u nitroprusside ġew imblukkati, filwaqt li MPANO ma ġiex affettwat. It-tieni, il-blu tal-metilen ikkawża produzzjoni ta’ superossidu miċ-ċelluli tal-muskolu lixx li kienet tiddependi fuq id-doża u l-ħin, imkejla permezz tar-riduzzjoni taċ-ċitokromu c. It-tielet, id-dismutażi tas-superossidu pprevjeniet kompletament l-inibizzjoni filwaqt li l-katalażi ma għamlitx hekk, u dan jindika s-superossidu aktar milli l-perossidu tal-idroġenu bħala l-ispeċi kimika li kkawżat direttament l-effett f’dik il-preparazzjoni.

Il-verżjoni tal-esperiment b’kultura konġunta ta’ min isemmiha għax tindika fejn iseħħ l-effett. Ċelluli endoteljali fuq ħġieġiet li jgħattu l-kampjun ġew ikkultivati għal żmien qasir flimkien ma’ ċelluli tal-muskolu lixx, sabiex il-fattur endoteljali rilaxxat fil-kundizzjonijiet bażali għolla l-GMP ċikliku tal-muskolu lixx għal tliet sa tmien darbiet il-livell inizjali. It-trattament minn qabel ta’ kwalunkwe wieħed miż-żewġ kompartimenti bil-blu tal-metilen naqqas dak is-sinjal, u d-dismutażi tas-superossidu rriversjat parzjalment l-effett tat-trattament minn qabel taċ-ċelluli endoteljali. Fi kliem ieħor, il-blu tal-metilen mhux bilfors irid jaġixxi ġewwa ċ-ċellula tal-muskolu lixx li tidentifika s-sinjal. Jista’ jnaqqas is-sinjal billi jneħħi l-messaġġier waqt it-tranżitu. Il-gwida għall-qari tar-riċerka dwar il-blu tal-metilen tittratta dan bħala regola ġenerali: semmi l-kompartiment fejn seħħ l-intervent qabel ma ssemmi mira molekulari.

Ikun żbaljat li dan jissejjaħ inibizzjoni ta’ NOS. Ma kien meħtieġ ebda pass tas-sintażi biex id-donaturi jaħdmu, u madankollu s-sinjal xorta naqas.

Ħolqa 4: id-ditekter innifsu jirrispondi inqas

Jeżistu effetti diretti fuq iċ-ċiklażi solubbli tal-gwanilat, iżda l-konċentrazzjonijiet huma importanti. Fit-tqabbil tal-enzimi ppurifikati ċċitat hawn fuq, iċ-ċiklażi stimulata bl-ossidu nitriku kellha bżonn madwar 60 micromolar ta’ blu tal-metilen għal nofs inibizzjoni, meta mqabbla ma’ nofs inibizzjoni ta’ NOS qrib 5 sa 9 micromolar, u anki 1 millimolar ipproduċa biss imblukkar massimu parzjali. Din hija differenza ta’ madwar sitt sa ħdax-il darba. Għalhekk, esperiment fiċ-ċelluli b’konċentrazzjoni baxxa fil-medda micromolar li jnaqqas il-GMP ċikliku ma jistax jiġi deskritt bħala inibizzjoni selettiva taċ-ċiklażi abbażi tal-valur tal-GMP ċikliku biss.

Studju redox aktar tard żied it-tieni twissija: il-blu tal-metilen iddiżattiva ċ-ċiklażi attivata bl-ossidu nitriku permezz ta’ mekkaniżmu distint mill-ossidazzjoni sempliċi tal-ħadid tal-eme bl-arja. Għalhekk, il-funzjoni tad-ditekter tista’ tiġi mfixkla, iżda l-kimika għadha mhix stabbilita, u d-differenza fil-konċentrazzjonijiet tfisser li l-effetti tas-superossidu u ta’ NOS jistħoqqilhom jiġu esklużi l-ewwel meta l-esponiment ikun għal konċentrazzjonijiet baxxi fil-medda micromolar. Hawnhekk ukoll għandu jidħol il-kontroll tal-fosfodijesterażi. Sakemm it-tkissir ma jkunx tkejjel jew ġie mblukkat, akkumulazzjoni mnaqqsa ta’ GMP ċikliku hija konsistenti ma’ inqas sinteżi, degradazzjoni aktar mgħaġġla, jew it-tnejn.

Għaliex dan ma jistax jitnaqqas għal stqarrija waħda dwar il-pressjoni tad-demm

Kull ħolqa ġiet stabbilita f’sistema differenti. It-traskrizzjoni fil-makrofaġi mhijiex l-attività tal-enzima fl-ipotalamu. L-attività fl-ipotalamu wara lipopolysaccharide mhijiex it-ton endoteljali waqt il-mistrieħ. Fattur endoteljali rilaxxat fil-kundizzjonijiet bażali f’kultura konġunta mhuwiex vażodilatazzjoni stimulata minn agonist. Ċelluli tal-arterja pulmonari kkultivati b’10 micromolar ta’ blu tal-metilen mhumiex ċirkolazzjoni umana. Li dawn jinġabru fi stqarrija bħal li l-blu tal-metilen jgħolli l-pressjoni tad-demm billi jimblokka l-ossidu nitriku jwarrab proprju d-distinzjonijiet li l-kontrolli tfasslu biex jippreservaw.

Tliet verifiki jżommu l-ispjegazzjoni preċiża. L-ewwel, semmi l-iżoforma: eNOS għat-ton vaskulari waqt il-mistrieħ, iNOS għall-fluss infjammatorju indott, nNOS għal kuntesti newronali u għal xi kuntesti ta’ enzimi ppurifikati. It-tieni, semmi kif jitwassal is-sinjal tal-ossidu nitriku: sinteżi endoġena, rilaxx endoteljali bażali, jew donatur speċifiku bħal CYSNO, nitroprusside, jew MPANO, peress li d-donatur stabbli rreżista l-blu tal-metilen filwaqt li dawk labili ma rreżistewhx. It-tielet, semmi l-konċentrazzjoni u r-riversjar tal-effett: ir-riversjar permezz tad-dismutażi tas-superossidu jindika l-involviment tas-superossidu, in-nuqqas ta’ effett tal-katalażi huwa evidenza kontra l-involviment tal-perossidu tal-idroġenu f’dik il-preparazzjoni, l-imitazzjoni permezz ta’ xanthine oxidase turi li dan il-mekkaniżmu huwa biżżejjed biex jipproduċi l-effett, u l-analiżijiet ta’ enzimi ppurifikati jisseparaw l-effetti diretti fuq il-kataliżi mit-telf waqt it-tranżitu.

Il-konklużjoni fil-qosor hija din. Il-blu tal-metilen ikun deskritt aħjar bħala aġent li jfixkel f’diversi siti s-sinjalar mill-ossidu nitriku għall-GMP ċikliku milli bħala imblokkatur selettiv taċ-ċiklażi. Skont il-preparazzjoni u l-konċentrazzjoni, jista’ jnaqqas ir-rabta tal-fatturi tat-traskrizzjoni ta’ iNOS, jinibixxi direttament l-enzimi NOS, inaqqas id-disponibbiltà tal-ossidu nitriku permezz tal-ġenerazzjoni tas-superossidu, u jfixkel il-funzjoni taċ-ċiklażi attivata bl-ossidu nitriku. Ir-rwol tas-sinjalar tal-GMP ċikliku fl-istudji vaskulari u t-tqabbil tad-donaturi tal-ossidu nitriku użati fl-analiżijiet taċ-ċelluli jittrattaw kull wieħed waħda minn dawk il-fergħat f’aktar dettall, u l-metodi użati biex jisseparaw l-effetti redox mill-effetti fuq l-enzimi jispjegaw għaliex id-dismutażi tas-superossidu flimkien mal-katalażi u kontroll b’donatur stabbli jidhru tant spiss f’din il-letteratura.

Valur baxx ta’ GMP ċikliku wara l-blu tal-metilen jidentifika katina miksura. Il-kontrolli biss jgħidu liema ħolqa nkisret.