Għaliex il-blu tal-metilen jintuża bħala kontrokulurazzjoni fil-kulurazzjoni reżistenti għall-aċidu

Tekniku jeżamina smir tal-isputum wara s-sekwenza sħiħa tal-kulurazzjoni. Baċilli ħomor jispikkaw fuq sfond blu, u r-rapport jinħareġ bħala baċilli reżistenti għall-aċidu osservati. L-għada, pjastra differenti turi kamp blu uniformi mingħajr baċilli ħomor, u tiġi rrappurtata bħala negattiva għat-tuberkulożi. Wieħed minn dawn ir-rapporti jsostni aktar milli tappoġġa l-pjastra, u mhuwiex l-ewwel wieħed.

Il-konfużjoni hija kunċettwali. It-tekniku qies iż-żebgħa blu bħala parti mill-kimika tas-sejbien, bħallikieku l-blu tal-metilen għen biex jinstabu l-mikobatterji. Ma għenx. Sa meta l-blu tal-metilen imiss il-pjastra, it-test ikun diġà spiċċa. Iż-żebgħa tagħti kulur biss lill-isfond biex ir-riżultat ikun jista' jinqara. Dan l-artiklu jispjega l-għan tal-blu tal-metilen fil-kulurazzjoni reżistenti għall-aċidu, għaliex huwa blu aktar milli xi kulur ieħor, u x'tista' tikkonkludi mill-aħmar fuq il-blu.

It-tweġiba fil-qosor

Il-kulurazzjoni reżistenti għall-aċidu hija test differenzjali mibni fuq tliet ideat. Il-fuksina karbolika, iż-żebgħa primarja, tiddaħħal bil-forza f'kull ċellola, inklużi l-mikobatterji b'kisja xama'. L-aċidu-alkoħol, l-aġent tad-dekolorazzjoni, ineħħi ż-żebgħa ħamra miċ-ċelloli ordinarji iżda ma jirnexxilux joħroġha minn dawk reżistenti għall-aċidu. Il-blu tal-metilen, iż-żebgħa ta' kontrokulurazzjoni, imbagħad jagħti kulur lil dak kollu li l-aġent tad-dekolorazzjoni neħħielu ż-żebgħa, sabiex iċ-ċelloli mhux reżistenti għall-aċidu, iċ-ċelloli tal-ospitant, u l-fdalijiet jidhru blu filwaqt li l-baċilli reżistenti għall-aċidu jibqgħu ħomor. Il-kontrokulurazzjoni tipprovdi kuntrast. Ma għandha ebda sehem fil-kimika li tagħmel ċellola reżistenti għall-aċidu.

X'jagħmel kull pass

Id-dijagramma hawn taħt turi t-tqassim tar-rwoli. Aqraha mix-xellug għal-lemin bħala proċedura, u aqra l-istrixxa t'isfel bħala tfakkira li kull familja ta' kulurazzjonijiet twieġeb mistoqsija differenti.

Il-penetrazzjoni tiġi l-ewwel. Il-mikobatterji jirreżistu ż-żebgħat milwiema ordinarji għax il-kisja tagħhom hija idrofobika b'mod mhux tas-soltu, għalhekk il-protokoll iġiegħel iż-żebgħa tidħol. Fil-metodu Ziehl-Neelsen, it-tisħin sakemm joħroġ il-fwar idaħħal il-fuksina karbolika li fiha l-fenol minn ġol-ħajt xama'. Fil-metodu kiesaħ Kinyoun, is-sħana tinbidel ma' formulazzjoni ħafna aktar qawwija taż-żebgħa primarja, u xi verżjonijiet modifikati mingħajr tisħin iżidu surfattanti. Il-protokolli tal-kulurazzjoni reżistenti għall-aċidu tal-American Society for Microbiology jiddokumentaw iż-żewġ formulazzjonijiet ħdejn xulxin, u d-differenza fil-konċentrazzjoni hija notevoli: madwar 0.3 g ta' fuksina bażika għal kull 100 mL fil-metodu bit-tisħin meta mqabbla ma' madwar 4 g fil-metodu kiesaħ.

Id-differenzjazzjoni tiġi t-tieni. L-aċidu-alkoħol, komunement 3 mL ta' aċidu idrokloriku kkonċentrat f'97 mL ta' etanol ta' 95 fil-mija, jaħsel iż-żebgħa ħamra minn kull ċellola li l-ħajt tagħha ma joffri ebda reżistenza speċjali. Iċ-ċelloli b'kisja lipidika mikobatterika intatta jżommu ż-żebgħa. Dan huwa l-pass li fuqu jiddependi l-metodu kollu, u l-pass l-aktar sensittiv għat-teknika, kif diskuss aktar 'l isfel.

Il-kuntrast jiġi l-aħħar. Il-pjastra issa fiha ċelloli ħomor reżistenti għall-aċidu fuq sfond kważi bla kulur ta' ċelloli li tilfu ż-żebgħa. Il-blu tal-metilen f'konċentrazzjoni ta' 0.3 fil-mija w/v jerġa' jagħmel dak l-isfond viżibbli b'kulur kemm jista' jkun differenti mill-aħmar. Il-kontrokulurazzjoni hija qasira, tipikament 20 sa 30 sekonda fil-metodu bit-tisħin u sa ftit minuti f'xi varjanti tal-metodu kiesaħ, u l-ħin jiddependi mill-protokoll aktar milli minn proprjetà taż-żebgħa nnifisha.

Għaliex din iż-żebgħa, u għaliex blu

Il-blu tal-metilen huwa żebgħa bażika katjonika, li jfisser li l-jone kkulurit tiegħu għandu ċarġ pożittiv u jeħel mal-uċuħ b'ċarġ negattiv tal-batterji dekolorizzati, taċ-ċelloli tal-ospitant, u tal-fdalijiet. Il-Mikrobijoloġija ta' OpenStax tiddeskrivi din il-loġika taċ-ċarġ bħala l-prinċipju ġenerali wara ż-żebgħat bażiċi. Iżda l-blu tal-metilen mhuwiex kimikament uniku f'dan il-kuntest. Il-vjola tal-kristall u s-safranina huma wkoll żebgħat bażiċi. L-għażla hija ottika, mhux kimika.

Il-baċilli ħomor jeħtieġu sfond b'lewn kontrastanti, u l-blu jikkuntrasta mal-aħmar bl-aktar mod utli għall-mikroskopija b'kamp imdawwal. Is-safranina ma tkunx kontrokulurazzjoni tajba għax il-kulur finali tagħha, roża-aħmar, huwa qrib wisq tal-fuksina karbolika miżmuma, u jxejjen proprju d-distinzjoni li ħolqot il-proċedura. Il-vjola tal-kristall jagħti sfond vjola skur li jikkompeti mal-baċilli ħomor irqaq għall-attenzjoni. L-aktar evidenza qawwija li l-funzjoni hija l-kuntrast aktar milli l-kimika hija s-sostituzzjoni: żebgħat ħodor ta' kontrokulurazzjoni bħall-aħdar tal-malakite u l-aħdar brillanti jintużaw f'xi protokolli veterinarji u modifikati u t-test xorta jaħdem, għax kwalunkwe lewn ċarament differenti jagħmel l-istess xogħol.

Minn dan joħorġu żewġ konsegwenzi prattiċi. L-ewwel, ir-riċetta standard ma tispeċifika ebda aġġustament tal-pH; tħawwadx din is-soluzzjoni milwiema sempliċi ta' 0.3 fil-mija ma' formulazzjonijiet alkalini bħall-blu tal-metilen ta' Loeffler, li jappartjenu għal kunċett differenti ta' kulurazzjoni. It-tieni, l-eċċess jagħmel ħsara. Il-letteratura tal-istoloġija twissi speċifikament li sfond blu dens wisq jista' jaħbi baċilli skarsi, għalhekk jekk iżżomm il-pjastra mgħarrqa biż-żebgħa għal aktar żmien milli jippermetti l-protokoll, titlef il-faċilità tal-qari mingħajr ma tikseb xejn.

Il-kimika tal-ħajt li tagħmel it-test possibbli

Ir-raġuni għaliex l-aċidu-alkoħol jiddistingwi bejn iċ-ċelloli tinsab fil-kisja mikobatterika. Il-qalba strutturali tagħha hija l-kumpless mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikan marbut ma' arabinogalaktan li t-truf ta' barra tiegħu jġorru aċidi mikoliċi b'katini twal ħafna, u jifforma mikomembrana ta' barra rikka fil-lipidi b'permeabbiltà baxxa b'mod mhux tas-soltu. Ir-reviżjoni tal-membrana ta' barra mikobatterika tiddeskrivi din l-arkitettura fid-dettall. Il-barriera taħdem fiż-żewġ direzzjonijiet. Tirreżisti d-dħul taż-żebgħa, u għalhekk il-penetrazzjoni teħtieġ is-sħana jew żebgħa primarja aktar qawwija, u tirreżisti l-estrazzjoni taż-żebgħa, u għalhekk l-aċidu-alkoħol ma jirnexxilux ineħħi l-fuksina karbolika ladarba tkun ġewwa. Il-batterji ordinarji ma għandhomx din il-kisja u jitilfu ż-żebgħa. Għalhekk, ir-reżistenza għall-aċidu tinftiehem l-aħjar bħala fenomenu ta' barriera lipidika, mhux bħala rabta kimika tal-fuksina mal-aċidu mikoliku.

Din il-kimika tispjega wkoll problema komuni: il-mikobatterji jieħdu l-kulur ħażin u b'mod imprevedibbli bil-metodu ta' Gram, u xi drabi jidhru bħala forom pallidi b'dehra ta' żibeġ jew bħala forom bla kulur qishom fantażmi. Il-ħajt idrofobiku tagħhom jillimita l-penetrazzjoni tal-vjola tal-kristall. Il-kulurazzjoni reżistenti għall-aċidu mhijiex kulurazzjoni ta' Gram modifikata. Hija prinċipju differenzjali differenti mibni fuq proprjetà differenti tal-ħajt, kif juri t-tqabbil bejn il-kulurazzjoni sempliċi u l-kulurazzjoni ta' Gram għaż-żewġ metodi l-oħra.

Tliet metodi, tliet mistoqsijiet

Għall-familja usa' ta' metodi batteriċi b'żebgħa waħda, ara l-atlas tal-kulurazzjoni għall-mikroskopija.

X'ma jistax jipprova l-aħmar fuq il-blu

Baċilli ħomor ifissru li l-organiżmi żammew il-fuksina karbolika minkejja l-aċidu-alkoħol. Din is-sejba hija konsistenti ma' Mycobacterium tuberculosis, iżda l-gwida tas-CDC għad-dijanjosi tat-tuberkulożi tinnota espliċitament li mikobatterji oħra huma wkoll reżistenti għall-aċidu, għalhekk l-identifikazzjoni tal-ispeċi teħtieġ kultura u testijiet tal-aċidi nuklejċi, mhux kulur.

L-iżbalji fit-teknika jikkonċentraw madwar iż-żewġ ħasiliet. Dekolorazzjoni insuffiċjenti tħalli l-materjal tal-isfond aħmar u tista' twassal għal qari pożittiv falz. Dekolorazzjoni eċċessiva tneħħi ż-żebgħa primarja miżmuma b'mod dgħajjef u tikkontribwixxi għal riżultati negattivi foloz. Kontrokulurazzjoni applikata b'mod eċċessiv taħbi baċilli skarsi fil-blu. Smirs ħoxnin, reaġenti preċipitati, u ilma tat-tlaħliħ ikkontaminat iżidu l-artefatti tagħhom stess.

Is-sensittività hija limitata mill-għadd ta' organiżmi, tkun kemm tkun tajba t-teknika. Il-mikroskopija konvenzjonali tal-smir teħtieġ madwar 5,000 sa 10,000 baċillu għal kull millilitru ta' sputum, u reviżjonijiet eqdem tal-evidenza mis-CDC poġġew is-sensittività tal-smir madwar 45 sa 80 fil-mija fost każijiet pulmonari kkonfermati bil-kultura. Għalhekk, smir negattiv qatt ma jeskludi t-tuberkulożi. Il-gwida attwali tas-CDC żżomm il-kultura flimkien ma' kull smir u tirrakkomanda test ta' amplifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi fuq mill-inqas kampjun respiratorju wieħed meta tkun qed tiġi kkunsidrata t-tuberkulożi pulmonari u r-riżultat ikun ibiddel il-ġestjoni tal-każ.

Ix-xogħol prattiku għandu jsegwi protokolli awtorizzati

Deskrizzjonijiet għat-tagħlim, inkluż dan l-artiklu, ma jawtorizzawx xogħol kliniku. Għall-prattika fil-laboratorju, segwi l-proċedura operattiva standard validata tal-laboratorju, allinjata mad-dokumenti attwali tas-CDC, tal-APHL, jew tas-CLSI; ir-referenza tas-CDC għall-kulurazzjoni reżistenti għall-aċidu miżmuma fl-arkivju Stacks tiegħu turi kif dawn il-proċeduri jispeċifikaw ir-reaġenti u l-qari tar-riżultati. Ix-xogħol b'kampjuni tat-tuberkulożi jeħtieġ konteniment: l-smirs jitħejjew f'kabinett tas-sigurtà bijoloġika għax it-tħejjija tiġġenera aerosols u titjir, u l-gwida tas-CDC għas-sigurtà fil-laboratorju tiddikjara li anke smirs iffissati bis-sħana jistgħu jkun fihom baċilli tat-tuberkulożi vijabbli u xorta jridu jiġu mmaniġġjati bħala kkontaminati. L-entrata fil-Librerija tal-Immaġnijiet tas-Saħħa Pubblika tas-CDC għal smir bil-fuksina karbolika u l-blu tal-metilen eżaminat għal M. leprae hija tfakkira utli tal-firxa tal-metodu lil hinn mit-tuberkulożi: l-istess kuntrast aħmar fuq blu jintuża kull fejn jiġu mfittxija organiżmi reżistenti għall-aċidu, u qari negattiv bir-reqqa huwa fih innifsu riżultat li ta' min jirreġistra.

Il-qari tal-pjastra lesta

Il-kontrokulurazzjoni turi l-valur tagħha waqt l-iskrinjar. Mikroskopista li jiskennja b'ingrandiment baxx l-ewwel juża l-isfond blu biex jiġġudika l-kwalità tal-smir: distribuzzjoni uniformi taċ-ċelloli, ċelloli tal-ospitant intatti għall-iffukar, u ebda preċipitat abbundanti. Il-forom ħomor suspettużi mbagħad jiġbdu l-għajn proprju għax xejn aktar fuq il-pjastra ma huwa aħmar. Il-konferma ssir bl-immersjoni fiż-żejt, fejn il-baċilli veri juru l-forom mistennija ta' vireg irqaq, xi drabi kemxejn mgħawġa jew b'dehra ta' żibeġ, aktar milli fdalijiet uniformi taż-żebgħa.

Il-kulurazzjoni tal-isfond tistabbilixxi wkoll il-vokabularju tar-rapport. Pjastra b'baċilli ħomor tiġi rrappurtata bħala baċilli reżistenti għall-aċidu osservati, spiss bi grad semikwantitattiv skont l-iskala tal-laboratorju. Pjastra mingħajr organiżmi ħomor tiġi rrappurtata bħala ebda baċilli reżistenti għall-aċidu osservati, qatt bħala negattiva għat-tuberkulożi. Id-distinzjoni hija importanti għax il-kamp blu jipprova li l-kulurazzjoni ħadmet, li ċ-ċelloli ħadu l-kontrokulurazzjoni u li l-ottika kienet adegwata, filwaqt li ma jgħid xejn dwar organiżmi taħt il-limitu tas-sejbien. Kamp blu vojt huwa riżultat validu dwar il-pjastra, mhux verdett dwar il-pazjent.

Żomm f'moħħok it-tqassim tar-rwoli u r-rapporti jsiru ċari. Il-fuksina karbolika tikxef organiżmi potenzjali. L-aċidu-alkoħol iwettaq it-test. Il-blu tal-metilen jagħmel biss it-tweġiba leġġibbli: l-aħmar żamm iż-żebgħa minkejja l-aċidu, il-blu tilifha. Kull ħaġa oħra, l-ispeċi, l-għadd ta' organiżmi, u t-tifsira klinika, tiġi minn xogħol lil hinn mill-pjastra.