L-Artikolu
Il-blu tal-metilen bħala indikatur anaerobiku u tal-ossiġenu: x’tipprova l-bidla fil-kulur
Teknika tissiġilla vażett anaerobiku, tiċċekkja l-istrixxa indikatriċi tal-blu tal-metilen minn ġol-għatu, u tara dak li trid tara. L-istrixxa nbidlet minn blu għal bajda. Tirreġistra l-proċess bħala anaerobiku u tkompli bix-xogħol. Jumejn wara, fuq pjanċa waħda ma jikber xejn, filwaqt li tubu ssiġillat b’brodu fl-istess vażett juri sinjali ta’ espożizzjoni għall-ossiġenu. L-istrixxa kienet qed tgħid il-verità. It-teknika kienet għamlitilha l-mistoqsija żbaljata.
Il-konfużjoni hija bejn kunċetti. Indikatur anaerobiku tal-blu tal-metilen huwa kunċett marbut mar-redox, mhux mal-isterilità u lanqas mal-validazzjoni ta’ sistema sħiħa. Ladarba din id-distinzjoni tkun ċara, l-istrixxa ssir strument preċiż u onest b’kompitu limitat.
Il-kunċett: par redox riversibbli
Il-blu tal-metilen maħlul jeżisti f’żewġ stati. Il-forma ossidata hija l-katjon blu magħruf. Il-forma ridotta, imsejħa lewko-blu tal-metilen, hija bla kulur. Qrib pH newtrali, in-nofs reazzjoni ssimplifikata hija katjon blu wieħed flimkien ma’ proton wieħed u żewġ elettroni, li jagħtu molekula lewko waħda bla kulur. Il-potenzjal formali huwa qrib plus 11 millivolts meta mqabbel mal-elettrodu standard tal-idroġenu f’pH 7, u dan iqiegħdu f’firxa li ħafna sistemi riduċenti jistgħu jilħqu u li l-ossiġenu jista’ jaqleb lura.
Ir-riduzzjoni teħtieġ potenzjal redox lokali baxx. It-tneħħija tal-ossiġenu waħedha mhux dejjem tkun biżżejjed. Riċerka bikrija dwar l-anaerobjożi sabet li l-blu tal-metilen f’ilma sempliċi mingħajr ossiġenu kien iżomm il-kulur tiegħu sakemm ma tkunx preżenti sustanza riduċenti, u li taħlitiet ta’ brodu tad-destrosju b’madwar 0.01 fil-mija żebgħa kienu jitilfu l-kulur faċilment f’37 C, filwaqt li l-istess taħlita miżmuma f’4 C baqgħet blu għal jum, kif irrappurtat f’esperimenti fuq tessut frisk u kundizzjonijiet ta’ kultivazzjoni anaerobika. It-temperatura, il-pH, il-glukożju, l-askorbat, it-tijoglikollat u l-attività riduċenti tal-mikrobi kollha jiddeterminaw jekk l-elettroni jkunux disponibbli.
L-ossidazzjoni mill-ġdid teħtieġ biss l-ossiġenu. Meta l-arja tilħaq il-forma lewko, din tinbidel lura għal blu. Indikaturi moderni ddisinjati apposta jisfruttaw eżattament dan iċ-ċiklu: żebgħa flimkien ma’ aġent riduċenti u matriċi stabilizzanti, bla kulur meta l-ossiġenu jkun baxx u blu mill-ġdid meta jkunu esposti għall-arja, kif intwera f’indikatur ibridu tal-ossiġenu bil-blu tal-metilen ibbażat fuq żebgħa, aġent riduċenti, surfattant u tafal. Dak il-prototip uża żebgħa ta’ 0.01 millimolari b’askorbat jew glukożju ta’ 2.0 millimolari f’pH 11, sar bla kulur qrib 0.5 fil-mija ossiġenu skont il-volum, u ddistingwa bejn inqas minn 0.1 fil-mija u aktar minn 0.5 fil-mija ossiġenu fil-kamra tat-test tiegħu.
Għalhekk il-prinċipju operattiv huwa sempliċi. Blu jfisser li ż-żona tal-indikatur hija ossidata. Bla kulur jfisser li ż-żona tal-indikatur laħqet kundizzjonijiet riduċenti b’livell baxx ta’ ossiġenu. Il-bidla hija riversibbli, lokali u kimika. Waħedha ma tgħid xejn dwar il-mikrobi.
Kif taħdem strixxa indikatriċi tal-blu tal-metilen f’vażett anaerobiku
Strixxa indikatriċi tal-blu tal-metilen għal vażett anaerobiku hija żona żgħira ta’ reazzjoni mqiegħda fl-atmosfera tal-vażett fejn tista’ tidher mingħajr ma jinfetaħ ir-reċipjent. Il-formati kummerċjali jvarjaw: strixxi tal-karta, pilloli li jinħallu jew jixxarrbu waqt it-tħejjija, u karti ibridi aktar ġodda. Xi wħud jeħtieġu qatra waħda ta’ ilma distillat biex jattivaw iż-żona tar-reazzjoni. Oħrajn huma apparati f’format niexef li jridu jibqgħu niexfa. Għandhom jiġu segwiti l-istruzzjonijiet tal-prodott speċifiku, għax l-idratazzjoni, it-tqegħid u l-ħin tal-qari huma parti mill-kimika.
Fil-prattika, il-qari maħsub huwa binarju. Blu jfisser li fl-istrixxa għad hemm ossiġenu jew kundizzjonijiet li mhumiex riduċenti biżżejjed. Abjad jew bla kulur jfisser li fl-istrixxa ġew stabbiliti kundizzjonijiet redox anaerobiċi. Xi karti kummerċjali jżidu pigment aħmar fl-isfond, għalhekk il-punt finali ridott tagħhom jidher roża minflok abjad. Kun af liema punt finali jwiegħed il-prodott tiegħek qabel tiġġudikah.
Il-ħin ivarja skont is-sistema. F’sistema waħda tat-tip GasPak, il-kulur beda jisparixxi fi żmien madwar siegħa u sparixxa għalkollox fi ftit sigħat, filwaqt li tqabbil ikkontrollat fit-temperatura tal-kamra kien jeħtieġ aktar minn sitt sigħat għall-blu tal-metilen. F’dak ix-xogħol, il-potenzjal redox tal-mezzi tal-kultura laħaq madwar minus 100 millivolts fi żmien 60 sa 100 minuta, ferm qabel ma ż-żebgħa temmet il-bidla tagħha, u kien ferm taħt minus 200 millivolts sa meta l-istrixxa saret kompletament bla kulur. L-indikatur jirreaġixxi aktar bil-mod mill-bidla fl-atmosfera. Strixxa blu wara siegħa ma tipprovax li s-sistema falliet, u strixxa bajda wara sitt sigħat tiddeskrivi l-istrixxa f’dak il-ħin.
It-tqegħid huwa importanti għall-istess raġuni. Żomm l-istrixxa fl-ispazju tal-gass fuq il-kontenut, tidher minn ġol-għatu, ’il bogħod mill-uċuħ tal-agar u mill-mezzi tal-kultura. Hija tindika l-ambjent immedjat tagħha. Poġġiha ċatta ma’ ħajt kiesaħ, għattiha bil-pjanċi, jew ħalli l-kondensat ixarrabha, u tindika dak il-mikroambjent minflok il-vażett.
X’turi l-istrixxa u x’ma turix
Aħseb fl-indikatur tal-blu tal-metilen fil-vażett anaerobiku bħala sensur wieħed f’post wieħed. Dan jistabbilixxi l-kundizzjonijiet lokali tar-redox u tal-ossiġenu fiż-żona tar-reazzjoni tiegħu stess, li huma ġeneralment rappreżentattivi tal-ispazju tal-gass fuq il-kontenut jekk it-taħlit u l-ilħuq tal-ekwilibriju jkunu adegwati. Kull ħaġa lil hinn minn dan hija inferenza, u l-inferenza teħtieġ evidenza separata.
Strixxa bla kulur ma tistabbilixxix l-isterilità. L-isterilità hija n-nuqqas ta’ organiżmi vijabbli, ippruvat permezz ta’ sterilizzazzjoni vvalidata u kontrolli għall-validazzjoni tal-kulturi. Vażett jista’ jkun kompletament anaerobiku u xorta kkontaminat, jew kompletament sterili u xorta aerobiku.
Ma tivvalidax kull parti tas-sistema tal-kultura. Ossiġenu maħlul ġewwa tubu ssiġillat, ossiġenu maqbud fl-agar fil-fond, gradjenti f’vażett mimli żżejjed, u tnixxija li tinfetaħ wara l-qari kollha jaħarbu minn strixxa waħda. Esperimenti dwar id-distribuzzjoni spazjali wrew żoni blu u bla kulur maġenb xulxin fl-istess reċipjent, fejn il-penetrazzjoni tal-ossiġenu u l-attività riduċenti kienu jibbilanċjaw b’mod differenti. Punt wieħed ma jistax jiċċertifika volum.
Ma tipprovax anaerobjożi mingħajr interruzzjoni. Strixxa li tinqara darba waqt it-tħejjija ma tgħid xejn dwar l-għoxrin siegħa. Xogħol reċenti dwar il-kwalità f’kundizzjonijiet anaerobiċi jwissi li l-indikaturi kimiċi jiddeskrivu l-atmosfera fil-mument meta jinqraw u jistgħu jidhru sodisfaċenti minkejja livell baxx ta’ ossiġenu residwu. Dokumentazzjoni kontinwa jew f’punti ta’ kontroll, mhux ħarsa waħda lejn il-punt finali, hija dak li jorbot l-istrixxa mal-inkubazzjoni.
Għall-kimika relatata wara l-bidla fil-kulur, ara kif il-blu tal-metilen jiċċikla bejn stati ossidati u ridotti. Biex tara b’mod aktar ġenerali kif l-ossiġenu jinfluwenza l-immaniġġjar tal-kampjuni, ara l-kontroll tal-ossiġenu fix-xogħol tal-mikroskopija u tal-kulturi.
Dijagramma biex iżżomm ħdejn il-vażett
Il-figura hawn taħt tiġbor l-artiklu f’referenza waħda għall-bank tal-laboratorju. Tliet stati tal-istess strixxa, iż-żewġ direzzjonijiet tar-reazzjoni, u l-konfini bejn l-evidenza mill-indikatur u l-validazzjoni tas-sistema.
| Osservazzjoni | Interpretazzjoni leġittima | Il-pass li jmiss meħtieġ |
|---|---|---|
| L-istrixxa blu wara l-ħin speċifikat għall-prodott | L-anaerobjożi mhijiex ivverifikata fl-istrixxa | Iċċekkja s-siġill, l-attivazzjoni u l-kapaċità tal-qartas, il-katalizzatur fejn japplika, l-idratazzjoni u d-data ta’ skadenza tal-istrixxa; tinterpretax il-kulturi s’issa |
| L-istrixxa titlef il-kulur tul diversi sigħat u mbagħad tibqa’ bla kulur | Ġew stabbiliti kundizzjonijiet riduċenti fl-istrixxa f’dak il-ħin | Irreġistra l-ħin u l-kulur; żomm punti ta’ kontroll waqt l-inkubazzjoni |
| L-istrixxa bla kulur qabel il-ftuħ, blu wara l-ftuħ | Ossidazzjoni mill-ġdid mistennija mal-espożizzjoni għall-arja | Żomm il-qari ta’ qabel il-ftuħ bħala l-punt finali; tikklassifikax il-proċess bħala fallut b’mod retrospettiv |
| L-istrixxa bla kulur iżda tubu jidher ossidat | Qari lokali biss | Evalwa t-tubu abbażi tal-evidenza tiegħu stess; iċċekkja l-gradjenti, l-ossiġenu maħlul u l-arranġament tal-kontenut |
| Kwalunkwe kulur tal-istrixxa bi tkabbir jew mingħajr tkabbir | Ebda konklużjoni dwar l-isterilità jew il-vijabbiltà | Uża kontrolli separati tal-isterilità u tal-vijabbiltà |
Tipi ta’ ħsarat li jżommu l-istrixxa blu, jew jagħtu serħan il-moħħ falz
Il-biċċa l-kbira tal-ħsarat jaqgħu f’ħames gruppi. Kull wieħed għandu sinjal distint.
Vażett jew borża li jnixxu jibqgħu jdaħħlu l-ossiġenu fiż-żona tar-reazzjoni. L-istrixxa tibqa’ blu jew terġa’ ssir blu wara li tkun tilfet il-kulur. Iċċekkja l-għatu, il-gasket, il-klampi u l-uċuħ tas-siġillar qabel twaħħal fil-kimika.
Ġeneratur tal-gass eżawrit jew attivat ħażin ma jneħħix l-ossiġenu. F’sistemi eqdem attivati bl-ilma, in-nuqqas ta’ kondensazzjoni wara madwar 10 sa 15-il minuta u n-nuqqas ta’ tisħin tal-għatu wara madwar 20 sa 40 minuta kienu twissijiet bikrija għal dik is-sistema. Qartas żgħir wisq f’vażett mgħobbi żżejjed ifalli bl-istess mod.
Katalizzatur avvelenat japplika biss għal sistemi eqdem tal-idroġenu flimkien mal-palladju, fejn il-palladju jgħaqqad l-idroġenu u l-ossiġenu biex jifforma l-ilma. L-umdità u s-sulfid tal-idroġenu jiddegradawh. Ħafna qratas attwali ma jużaw l-ebda palladju, għalhekk tapplikax din is-soluzzjoni fejn mhijiex rilevanti.
Strixxa degradata jew immaniġġjata ħażin tfalli mingħajr sinjal ovvju. Iż-żebgħa u l-aġent riduċenti jitilfu r-riversibbiltà waqt il-ħażna, u din hija waħda mir-raġunijiet għaliex ġew żviluppati formulazzjonijiet ibridi biex jirreżistu t-telf tal-kulur minħabba d-dawl u t-telf tal-funzjoni waqt il-ħażna. Warrab stokk skadut, stokk b’kulur inizjali mhux normali, u strixxi mxarrba meta għandhom ikunu niexfa jew li tħallew niexfa meta għandhom jixxarrbu.
Gradjent jew dewmien iqarraq b’min jaqra, mhux bil-kimika. Spazju tal-gass imħallat ħażin, tubi ssiġillati b’ossiġenu maħlul, u mezzi semisolidi kull wieħed iżommu l-kundizzjonijiet tagħhom stess għal aktar żmien milli tissuġġerixxi l-istrixxa. L-istrixxi tar-reżażurina jgħaddu minn roża għal bla kulur u spiss jiġu kkummerċjalizzati bħala aktar mgħaġġla, iżda l-limiti tagħhom huma speċifiċi għall-formulazzjoni tagħhom stess u ma japplikawx għall-blu tal-metilen.
Kontrolli u protokoll ta’ qari li ta’ min jikkopja
Żewġ kontrolli rħas jaqbdu l-biċċa l-kbira tal-qari żbaljat. Żomm strixxa ġdida bħala kontroll tal-arja fl-arja tal-kamra waqt il-proċess. Strixxa tal-blu tal-metilen li taħdem tibqa’ blu hemmhekk. Xi indikaturi ppakkjati jibdew ċari u jsiru blu mal-ftuħ, u dan fih innifsu huwa kontroll tal-funzjoni. U perjodikament poġġi strixxa ġdida f’sistema anaerobika vvalidata qabel. Għandha tilħaq il-punt finali ridott ivvalidat fi żmien il-ħin speċifikat għall-prodott. Jekk xi wieħed mill-kontrolli ma jaħdimx kif mistenni, ibdel il-lott qabel tafda l-qari tal-vażett.
Il-protokoll tal-qari joħroġ mill-mekkaniżmu. Poġġi l-istrixxa fejn tkun tidher fl-ispazju tal-gass fuq il-kontenut mingħajr ma tiftaħ il-vażett, billi ssegwi l-istruzzjonijiet tal-prodott dwar il-kuntatt mal-ħajt u t-tixrib. Irreġistra l-kulur inizjali, il-ħin meta ġie ssiġillat il-vażett, u l-kulur fil-punt ta’ kontroll speċifikat għall-prodott. Fejn ir-reċipjent jippermetti, irreġistra li l-indikatur baqa’ ridott f’punti ta’ kontroll definiti waqt l-inkubazzjoni. Irreġistra l-kulur finali immedjatament qabel il-ftuħ. Dak il-kulur ta’ qabel il-ftuħ huwa l-punt finali għal dak il-proċess. Wara l-ftuħ, stenna li jerġa’ jsir blu u tħallix dik il-bidla tbiddel ir-rekord ta’ dak li ġara.
Jekk l-istrixxa tibqa’ blu wara l-ħin speċifikat tagħha, qies l-anaerobjożi bħala mhux ivverifikata. Iċċekkja l-katina fl-ordni: is-siġill, il-qartas, il-katalizzatur jekk hemm, l-idratazzjoni u d-data ta’ skadenza tal-indikatur, imbagħad il-funzjoni tal-indikatur meta mqabbla mal-kontroll tal-arja. It-tkabbir jew in-nuqqas ta’ tkabbir għandu jiġi interpretat biss meta l-atmosfera tkun ivverifikata, billi jintużaw sistema ta’ kultivazzjoni anaerobika u kontrolli tal-organiżmi adattati għall-applikazzjoni.
L-istrixxa jistħoqqilha l-aħħar kelma fil-qasam tagħha stess. Blu jew bla kulur, twieġeb mistoqsija waħda dwar post wieħed f’ħin wieħed. Agħmlilha dik il-mistoqsija fil-ħinijiet ippjanati, b’kontrolli maġenbha, u twieġeb b’mod affidabbli. Staqsiha dwar l-isterilità, dwar kull tubu, jew dwar l-inkubazzjoni kollha minn ħarsa waħda, u l-ebda kimika tal-indikatur ma tista’ ssalva l-interpretazzjoni.