Blu tal-metilen ġdid u l-kolorazzjoni tar-retikuloċiti: kolorant separat u metodu fuq ċelloli ħajjin

Student iħejji għadd tar-retikuloċiti, jordna blu tal-metilen, iħalltu mad-demm, u kważi ma jara xejn. Sieħbu fil-klassi juża flixkun bit-tikketta blu tal-metilen ġdid u jikseb filamenti blu ċari ġewwa parti miċ-ċelloli ħomor. L-ewwel student jassumi li t-tieni flixkun huwa aktar frisk jew aktar ikkonċentrat. La huwa wieħed u lanqas l-ieħor. Fih molekula differenti.

Dan huwa l-iżball kunċettwali wara l-biċċa l-kbira tal-konfużjoni f'dan il-qasam. L-isem jagħti x'jifhem li l-blu tal-metilen ġdid huwa lott imtejjeb ta' blu tal-metilen. Il-kimika turi mod ieħor. Il-blu tal-metilen ġdid N huwa kolorant separat tal-fenotijażina bin-numru tiegħu stess tal-Colour Index, bil-mudell ta' sostituzzjoni tiegħu stess, u bir-rwol standardizzat tiegħu stess fl-ematoloġija. Ladarba din id-distinzjoni tkun ċara, il-bqija tal-metodu (għaliex iċ-ċelloli jridu jkunu ħajjin meta jiġu kkolorati, x'jgħodd bħala retikuloċita, fejn jidħlu l-korpi ta' Heinz, u meta jidħol il-blu brillanti tal-kresil) isir faċli biex jinftiehem.

It-tweġiba fil-qosor

Il-blu tal-metilen ġdid N, ir-reaġent tal-ematoloġija, ġeneralment jiġi identifikat bħala Basic Blue 24 fir-rekord ta' PubChem għall-blu tal-metilen ġdid, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, bil-formula C18H22ClN3S. Il-blu tal-metilen ordinarju huwa klorur tal-metiltioninju, Basic Blue 9, fir-rekord tiegħu ta' PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, bil-formula C16H18ClN3S. Strutturalment, il-blu tal-metilen ġdid għandu żewġ gruppi tal-metil fuq iċ-ċirku u ktajjen laterali tal-etilamino fejn il-blu tal-metilen għandu gruppi tad-dimetilamino. Dik id-differenza tbiddel l-imġiba fil-kolorazzjoni. It-testi tal-ematoloġija jiddeskrivu l-blu tal-metilen ordinarju bħala kolorant relattivament dgħajjef għar-retikuloċiti u l-blu tal-metilen ġdid bħala wieħed li jagħti kulur aktar intens u aktar uniformi, paragun miġbur fil-qosor f'is-suġġett ta' ScienceDirect dwar il-blu tal-metilen ġdid.

Iva, il-blu tal-metilen ġdid huwa kolorant supravitali. Il-kolorazzjoni supravitali tfisser il-kolorazzjoni ta' ċelloli ħajjin wara li jitneħħew mill-ġisem u qabel il-fissazzjoni, kif definit f'ir-reviżjoni tal-NCBI dwar il-prinċipji tal-kolorazzjoni supravitali. Kemm il-blu tal-metilen ġdid kif ukoll il-blu brillanti tal-kresil jagħmlu parti minn din il-kategorija, u l-istandard tas-CLSI għar-retikuloċiti jkopri espliċitament il-blu tal-metilen ġdid bħala kolorant supravitali. L-istudenti kultant iqiegħdu dan fl-istess kategorija bħall-kolorazzjoni ta' Romanowsky ta' strixxi ffissati. Dak il-mudell mentali ma jaħdimx hawnhekk. Jekk l-ewwel tagħmel il-fissazzjoni, il-metodu ma jibqax jaħdem.

Għall-qarrejja li qed isegwu ismijiet ta' koloranti simili, il-blu tal-metil kontra l-blu tal-metilen ikopri konfużjoni differenti u akbar bejn kolorant anjoniku tat-triarilmetan u l-familja katjonika tal-fenotijażina. Il-ħarsa ġenerali lejn il-kolorazzjoni fil-laboratorju tqiegħed ix-xogħol supravitali fost il-metodi ta' strixxi ffissati, u l-gwida dwar il-morfoloġija taċ-ċelloli tad-demm turi fejn tidħol il-valutazzjoni tar-retikuloċiti fl-għadd differenzjali usa'.

Twissija waħda dwar il-katalgi: teżisti forma separata tal-blu tal-metilen ġdid bħala melħ doppju tal-klorur taż-żingu taħt CAS 6586-05-6. Għalhekk, taqsima tal-metodi għandha ssemmi l-forma tal-melħ u l-fornitur, mhux biss l-isem komuni.

X'tagħmel tassew il-kolorazzjoni supravitali

Retikuloċita hija ċellola ħamra żagħżugħa li tilfet in-nukleu tagħha iżda għad fiha RNA ribosomali residwu. Fi preparazzjoni mxarrba mhux ikkolorata, dak l-RNA ma jidhirx. Il-kolorant supravitali jidħol fiċ-ċellola ħajja u jippreċipita jew jaggrega dak l-RNA fi granuli u filamenti blu, il-materjal retikulofilamentuż li jidher taħt immersjoni fiż-żejt. Għalhekk, in-netwerk huwa prodott tal-kolorazzjoni, mhux skeletru ffurmat minn qabel li qed jistenna l-kulur. Huwa għalhekk li l-varjabbli tal-protokoll (il-konċentrazzjoni tal-kolorant, il-buffer, il-proporzjon tad-demm mal-kolorant, it-temperatura, il-ħin) huma importanti daqs l-isem tal-kolorant.

Il-konsegwenza prattika hija ordni stretta tal-operazzjonijiet: l-ewwel ħallat demm antikoagulat mal-kolorant, inkuba, imbagħad ħejji strixxi u eżaminahom mingħajr fissazzjoni u mingħajr kolorazzjoni ta' kuntrast. Il-fissazzjoni qabel il-kolorazzjoni, jew kolorazzjoni ta' kuntrast li tgħatti filamenti ħfief, teqred l-informazzjoni li fuqha jiddependi l-għadd.

Protokoll prattiku għar-retikuloċiti bil-blu tal-metilen ġdid

Ma hemmx formulazzjoni universali waħda, għalhekk irrapporta dik li ntużat. Tliet varjanti dokumentati juru l-firxa.

Il-proċedura klassika tat-tip Brecher tuża madwar 0.5 fil-mija blu tal-metilen ġdid b'ossalат tal-potassju, imħallat f'volumi ndaqs ma' demm bl-EDTA mħallat sew, u inkubat għal madwar 10 sa 15-il minuta f'temperatura ambjentali. Wara taħlit mill-ġdid bil-mod, jitħejjew strixxi rqaq f'forma ta' feles, jitnixxfu fl-arja, u jiġu eżaminati mingħajr fissazzjoni taħt l-oġġettiv ta' immersjoni fiż-żejt 100x. Il-proċedura tal-NCBI għall-għadd tar-retikuloċiti tiddeskrivi dan il-fluss tax-xogħol u l-qafas tal-għadd użat miegħu.

Il-varjant ta' Dacie u Lewis juża 1.0 fil-mija blu tal-metilen ġdid f'soluzzjoni salina biċ-ċitrat, imħallat ma' 2 sa 4 volumi ta' demm u miżmum f'37 C għal 15 sa 20 minuta qabel ma jitħejjew l-istrixxi. Implimentazzjoni reċenti ta' armonizzazzjoni għall-proċedura CLSI H44 użat soluzzjoni aktar dilwita ta' 0.1 fil-mija f'soluzzjoni salina b'buffer tal-fosfat f'pH 7.4, b'inkubazzjoni f'20 C għal 10 minuti u mingħajr fissazzjoni, kif irrappurtat f'l-istudju tal-2026 dwar l-armonizzazzjoni tal-NMB.

Ir-regoli tal-għadd huma komuni għall-varjanti kollha. Għodd ċellola bħala retikuloċita meta jkun fiha mill-inqas żewġ granuli distinti kkolorati blu jew segmenti ta' filamenti, u b'hekk jiġi eskluż depożitu iżolat tal-kolorant. Għodd mill-inqas 1,000 ċellola ħamra fix-xogħol ta' rutina u rrapporta r-retikuloċiti bħala perċentwal. F'perċentwali baxxi, l-istatistika titlob aktar ċelloli. Reviżjoni tal-metodoloġija CLSI H44 tinnota li, qrib 1 fil-mija retikuloċiti, huma meħtieġa madwar 4,400 ċellola biex il-varjazzjoni fl-għadd titnaqqas għal 5 fil-mija, f'ir-reviżjoni ta' CLSI H44 fuq De Gruyter. Diska okulari ta' Miller tagħmel għadd kbir prattiku. Iffiltra l-kolorant jew ippreparah frisk, għax il-preċipitat jixbah inklużjonijiet granulari.

Korpi ta' Heinz fl-istess preparazzjoni

L-istess strixxa supravitali tista' turi wkoll korpi ta' Heinz, li huma aggregati ta' emoglobina ossidata u żnaturata aktar milli RNA residwu. Fi preparazzjonijiet bil-blu tal-metilen ġdid jidhru bħala korpi tondi, spiss wieħed biss u qrib il-membrana, ikkolorati blu aktar ċar mill-materjal retikulofilamentuż. Ma jinżammux tajjeb matul il-fissazzjoni u l-kolorazzjoni ta' kuntrast, għalhekk eżamina l-istrixxa mhux iffissata. Protokoll reċenti li uża 20 mikrolitru ta' demm bl-EDTA ma' 20 mikrolitru ta' 1 fil-mija blu tal-metilen ġdid u 15-il minuta ta' inkubazzjoni kkwantifika ċ-ċelloli pożittivi għall-korpi ta' Heinz fost 250 eritroċita, f'l-istudju fuq PMC li jirrapporta dik il-proċedura.

Żewġ distinzjonijiet jipprevjenu interpretazzjonijiet żbaljati. L-ewwel, il-vjola tal-metil u l-vjola tal-kristall jikkoloraw il-korpi ta' Heinz b'mod aktar intens mill-blu tal-metilen ġdid, kif innutat f'is-suġġett ta' ScienceDirect dwar il-korpi ta' Heinz. Il-blu tal-metilen ġdid huwa l-għażla konvenjenti meta r-retikuloċiti u l-korpi ta' Heinz jiġu vvalutati flimkien, mhux l-aktar kolorant qawwi ddedikat għall-korpi ta' Heinz. It-tieni, l-inklużjonijiet ta' HbH fl-istat ta' ġarr tal-alfa-talassemija jipproduċu bosta tikek fini mifruxa maċ-ċellola wara l-kolorazzjoni supravitali, filwaqt li l-korpi klassiċi ta' Heinz huma inqas numerużi, akbar, u spiss assoċjati mal-membrana. Id-depożitu tal-kolorant huwa t-tielet imitazzjoni: jinsab barra l-pjan fokali taċ-ċelloli u jvarja minn kamp għal ieħor.

Il-blu brillanti tal-kresil kontra l-blu tal-metilen ġdid

Iż-żewġ koloranti huma koloranti supravitali għar-retikuloċiti, iżda l-istandardizzazzjoni tiffavorixxi wieħed minnhom. Il-metodu CLSI H44-A2 għar-retikuloċiti, żviluppat flimkien mal-Kunsill Internazzjonali għall-Istandardizzazzjoni fl-Ematoloġija u elenkat fuq il-paġna tal-istandard CLSI H44, jindika l-kolorazzjoni tad-demm bl-EDTA bil-blu tal-metilen ġdid bħala l-metodu komparattiv manwali. It-tagħlim klassiku tal-ematoloġija jaqbel dwar id-dehra: il-blu tal-metilen ġdid jagħti kolorazzjoni tal-filamenti aktar intensa u aktar uniformi, filwaqt li l-blu brillanti tal-kresil ivarja aktar bejn il-lottijiet u l-kampjuni.

Dak l-istatus jeħtieġ kwalifika. Il-linja gwida tal-ICSH għall-evalwazzjoni tal-analizzaturi taċċetta l-mikroskopija manwali bil-blu tal-metilen ġdid bħala approċċ ta' paragun ta' referenza iżda ssejħilha suġġettiva u relattivament impreċiża, bi proċeduri ta' referenza taċ-ċitometrija tal-fluss preferuti fejn ikunu disponibbli. Paragun tal-2022 ta' 100 kampjun sab devjazzjoni sistematika aktar baxxa mill-analizzatur tiegħu bil-blu brillanti tal-kresil milli bil-blu tal-metilen ġdid, irrappurtata f'il-paragun tal-metodi ta' kolorazzjoni fuq PMC. Is-sommarju li jista' jiġi sostnut għall-istudenti huwa dan: uża l-blu tal-metilen ġdid bħala l-komparatur manwali standardizzat, ivverifika kwalunkwe metodu lokali bil-blu brillanti tal-kresil billi tqabblu miegħu jew ma' metodu awtomatizzat, u stenna aktar dispersjoni fil-mikroskopija manwali fiż-żewġ każijiet. Il-letteratura aktar antika dwar l-istandardizzazzjoni kienet ukoll favur Azure B purifikat bħala alternattiva kimikament aktar pura minħabba li l-lottijiet kummerċjali tal-koloranti kienu jvarjaw, f'l-istudju ta' Marshall dwar Azure B, li jispjega għaliex il-grad tar-reaġent għadu jidher fid-diskussjonijiet dwar il-metodi.

Kif tevita l-iżbalji komuni

Erba' żbalji huma responsabbli għall-biċċa l-kbira tal-preparazzjonijiet li jfallu. L-ordni ta' blu tal-metilen ordinarju minflok blu tal-metilen ġdid N tipproduċi kolorazzjoni dgħajfa minħabba l-kimika, mhux minħabba t-teknika. Il-fissazzjoni jew il-kolorazzjoni ta' kuntrast qabel l-eżami tneħħi s-sinjal supravitali. L-għadd tal-preċipitat tal-kolorant bħala granuli jgħolli r-riżultat, ħaġa li tiġi evitata bir-regola taż-żewġ granuli u b'kolorant iffiltrat. L-għadd ta' ftit wisq ċelloli f'perċentwali baxxi ta' retikuloċiti jipproduċi numru li jidher preċiż iżda li għandu limiti ta' kunfidenza wesgħin. Kull żball għandu l-istess sinjal karatteristiku: il-mikroskopista jwaħħal fil-mikroskopju għal dak li kien diġà ġie ddeterminat fil-pass tar-reaġent.