Il-koloranti alkalin ta’ Loeffler u polikromu tal-blu tal-metilen spjegati

Tliet fliexken jistgħu jkunu ħdejn xulxin fuq bank tat-tbajja’, kull wieħed b’tikketta li tindika xi varjant tal-blu tal-metilen. Wieħed jgħid blu tal-metilen fl-ilma 1%. Ieħor jgħid blu tal-metilen alkalin ta’ Loeffler. It-tielet jgħid blu tal-metilen polikromu. Ħaddiem mgħaġġel jaqbad dak li jkun l-eqreb. Imbagħad il-frottis jitbajja’ b’mod dgħajjef wisq, jew ikun blu uniformi wisq, jew jieħu sfumaturi vjola mhux mistennija, u t-tort tar-riżultat jingħata lill-kampjun.

Din hija problema tal-formulazzjoni, mhux tal-kampjun. It-tliet soluzzjonijiet fihom koloranti relatati iżda jirrappreżentaw kunċetti differenti tat-tbajja’. Waħda hija kolorant katjoniku sempliċi b’pH kważi newtrali. Oħra hija l-istess kolorant magħmul aktar qawwi permezz ta’ alkali. It-tielet m’għadhiex kolorant wieħed, iżda taħlita ossidata apposta. Jekk tuża l-ħażina, il-prinċipju tat-tbajja’ jinbidel waqt li tkun qed taħdem.

It-tweġiba fil-qosor

Il-blu tal-metilen sempliċi fl-ilma huwa l-punt tat-tluq: madwar 1% kolorant fl-ilma, kolorant katjoniku sempliċi għall-morfoloġija batterika u l-mikroskopija ġenerali. Il-blu tal-metilen alkalin ta’ Loeffler iżid ammont żgħir u mkejjel ta’ alkali dilwit ma’ soluzzjoni stokk alkoħolika dilwita fl-ilma, li jgħolli l-pH u jsaħħaħ ir-rabta tal-kolorant katjoniku mal-istrutturi aċidużi tal-batterji. Il-blu tal-metilen polikromu huwa blu tal-metilen li tħalla jimmatura apposta permezz ta’ ossidazzjoni f’ambjent alkalin, għalhekk il-flixkun fih taħlita ta’ omologi demetilati (azure A, azure B, azure C), tijonina u vjola tal-metilen flimkien ma’ blu tal-metilen residwu, u dik it-taħlita tbajja’ strutturi differenti b’ilwien differenti.

Jekk tiftakar sentenza waħda biss: l-alkalinizzazzjoni tbiddel l-intensità tat-tbajja’, filwaqt li l-polikromizzazzjoni tbiddel il-kuluri tat-tbajja’.

Il-blu tal-metilen ordinarju fl-ilma: il-punt ta’ referenza

L-aktar formulazzjoni sempliċi hija blu tal-metilen maħlul fl-ilma, normalment f’1% w/v, mingħajr alkali u mingħajr ossidazzjoni. L-ispeċi kkulurita hija l-katjon tal-metiltijoninju b’kontrojon tal-klorur, kolorant tal-fenotijażina żgħir u ċatt deskritt fir-rekord ta’ PubChem dwar il-blu tal-metilen bħala klorur tal-metiltijoninju. Bħala katjon, jintrabat mal-qafas tal-fosfat tal-aċidi nuklejċi u mal-gruppi aċidużi fuq il-ħitan taċ-ċelloli batteriċi, u jagħti liċ-ċelloli kulur blu fuq sfond ċar.

Il-vantaġġ tiegħu huwa l-prevedibbiltà. In-nuklei u l-batterji jidhru blu. Il-kuntrast huwa modest. Organiżmi li bilkemm jidhru jistgħu jitbajgħu dgħajjef, u din hija preċiżament il-limitazzjoni li Loeffler ried isolvi. Għall-familja usa’ ta’ koloranti batteriċi sempliċi li din is-soluzzjoni tappartjeni għaliha, ara ħarsa ġenerali lejn it-tbajja’ sempliċi tal-batterji. L-eżattezza fl-identifikazzjoni għadha importanti hawnhekk: il-blu tal-metil huwa molekula kompletament differenti, kif jispjega l-artiklu dwar il-blu tal-metil imqabbel mal-blu tal-metilen, għalhekk tfittxija f’katalgu bbażata biss fuq l-isem tal-kulur tista’ twassal għall-klassi ħażina ta’ kolorant.

Il-blu tal-metilen alkalin ta’ Loeffler: l-istess kolorant, b’azzjoni aktar qawwija

Ir-riċetta klassika ta’ Loeffler tgħaqqad soluzzjoni stokk alkoħolika tal-blu tal-metilen ma’ alkali dilwit fl-ilma. Il-verżjonijiet fil-kotba tat-tagħlim jitolbu 0.3 g ta’ kolorant fi 30 mL ta’ etanol 95% flimkien ma’ 100 mL ta’ idrossidu tal-potassju 0.01% fl-ilma (jew, b’mod ekwivalenti, 30 mL ta’ blu tal-metilen alkoħoliku saturat, 100 mL ta’ ilma distillat u 1 mL ta’ KOH 1%), biex tinkiseb soluzzjoni għall-użu b’madwar 0.3% kolorant u b’pH ċarament alkalin. Il-verżjonijiet kummerċjali jsegwu l-istess prinċipju, u l-katalgu tal-koloranti għall-mikrobijoloġija ta’ Thermo Fisher jelenka l-blu tal-metilen alkalin ta’ Loeffler flimkien mal-varjanti polikromi u fl-ilma bħala prodotti separati fil-katalgu, b’użi maħsuba differenti.

L-alkali huwa l-element attiv ewlieni. Iż-żieda fil-pH tneħħi l-protoni mill-gruppi karbossiliċi u tal-fosfat fil-kampjun, u żżid id-densità tas-siti negattivi, filwaqt li s-soluzzjoni stokk bl-etanol iżżomm il-kolorant maħlul kompletament sabiex jasal f’dawk is-siti f’forma monomerika. Ir-riżultat huwa tbajja’ tal-batterji aktar mgħaġġla u intensa minn dik miksuba b’kolorant newtrali fl-ilma, bil-baċilli u l-kokki familjari ta’ kulur blu skur ta’ frottis batterjoloġiku ta’ rutina. Il-ħin tat-tbajja’ huwa tipikament minn minuta sa tliet minuti, segwit minn tlaħliħa bl-ilma.

L-applikazzjoni klassika hija Corynebacterium diphtheriae mkabbar fuq mezz tas-serum ta’ Loeffler: baċilli rqaq, ħafna drabi b’forma ta’ mazza, bi granuli metakromatiċi Babes-Ernst ta’ polifosfat maħżun li jitbajgħu b’mod qawwi. L-abbinament tal-mezz u l-kolorant huwa storiku, bit-tnejn attribwiti lill-istess batterjologu, u l-kuntrast tal-granuli huwa l-benefiċċju dijanjostiku. Lil hinn mix-xogħol fuq id-difterja, il-kolorant jintuża bħala kolorant batterjoloġiku ġenerali għal frottis minn kulturi, għall-morfoloġija ta’ Neisseria fi frottis kliniċi, u kull fejn it-tbajja’ ta’ Gram mhix meħtieġa iżda l-blu sempliċi fl-ilma jkun dgħajjef wisq. Huwa kolorant monokromu. Kull ħaġa aċiduża tieħu xi sfumatura ta’ blu. Meta protokoll jitlob differenzjazzjoni bil-kulur, l-alkali waħdu ma jistax jipprovdiha.

Twissija prattika waħda: is-soluzzjonijiet ta’ koloranti alkalini jiddeterjoraw u jiffurmaw preċipitat waqt il-ħażna u bl-assorbiment tad-diossidu tal-karbonju. Il-laboratorji jew jippreparaw volumi żgħar jew jixtru s-soluzzjoni mill-katalgu u jirrispettaw il-perjodu ta’ validità tagħha, minflok jibqgħu jużaw flixkun qadim li issa jħalli sediment fuq kull ħġieġa tal-mikroskopju.

Il-blu tal-metilen polikromu: isem wieħed, diversi koloranti

Il-blu tal-metilen polikromu jibda mill-istess kolorant iżda jissuġġettah għal ossidazzjoni kkontrollata f’ambjent alkalin, storikament imsejħa maturazzjoni jew polikromizzazzjoni. Il-maturazzjoni alkalina, it-tisħin bil-karbonat, jew l-ossidazzjoni b’aġenti bħad-dikromat ineħħu l-gruppi metiliċi mis-sostitwenti dimetilamino pass pass. Il-prodott huwa taħlita: blu tal-metilen residwu flimkien ma’ azure B (grupp metiliku wieħed imneħħi), azure A u azure C (demetilazzjoni ulterjuri), tijonina (kompletament demetilata), u prodotti sekondarji ossidattivi tal-familja tal-vjola tal-metilen. Kull komponent għandu l-lewn u l-affinità tiegħu għat-tessuti, għalhekk it-taħlita tbajja’ b’mod metakromatiku: in-nuklei, il-granuli, il-muċini u l-qarquċa jieħdu sfumaturi distinti minn blu sa aħmar-vjola.

Din il-kimika hija l-istess kimika wara l-koloranti famużi tad-demm. Ir-riċerkaturi tal-bidu sabu li l-blu tal-metilen alkalinizzat kien ibajja’ n-nuklei tal-parassiti tal-malarja bi sfumaturi vjola, iżda s-soluzzjonijiet maturati tagħhom fl-ilma ma kinux stabbli u kienu jiffurmaw preċipitat fi ftit jiem. Ir-reviżjoni dwar kif ġie vvintat il-kolorant vjola tad-demm tiddeskrivi kif Malachowski u Romanowsky sfruttaw dan l-effett indipendentement fl-1891, kif ġie introdott il-metanol biex jistabbilizza l-preċipitat tal-kolorant u jiffissa l-frottis mingħajr sħana, u kif Giemsa aktar tard standardizza t-taħlita abbażi ta’ azure B imkejjel flimkien mal-eosina, bi stabbilizzazzjoni bil-gliċerol. Il-koloranti moderni tat-tip Giemsa ġejjin direttament mill-blu tal-metilen polikromu flimkien mal-eosina, il-kombinazzjoni li tipproduċi l-effett Romanowsky. Għal dettalji dwar l-abbinament mal-eosina u l-komponent azure B, ara il-koloranti tat-tip Romanowsky u l-interazzjoni bejn azure B u l-eosina.

Minħabba li huwa taħlita, il-blu tal-metilen polikromu huwa min-natura tiegħu l-inqas standardizzat mit-tlieta. Il-bilanċ eżatt tal-ilwien tiegħu jiddependi mill-metodu u l-firxa tal-ossidazzjoni, u għalhekk il-fornituri tal-istoloġija jbigħuh bħala prodott distint bit-testijiet tal-prestazzjoni tiegħu stess, mhux bħala soluzzjoni ta’ Loeffler li tħalliet tixjieħ. L-użi tipiċi jinkludu t-turija metakromatika tal-granuli taċ-ċelloli mast, tal-muċini u tal-qarquċa, id-dettall taċ-ċelloli tal-plażma, u Helicobacter pylori f’sezzjonijiet tat-tessuti permezz ta’ metodi polikromi tat-tip Goodpasture. Huwa l-għażla t-tajba meta l-mistoqsija tkun dwar differenzjazzjoni bil-kulur, u l-għażla l-ħażina meta l-protokoll jistenna siluwett batteriku monokromu ċar.

Tqabbil tal-formulazzjoni u l-għan

Aqra t-tabella bħala proċedura għat-teħid ta’ deċiżjoni. Jekk il-kampjun jitbajja’ b’mod dgħajjef wisq, ibdel il-kunċett tal-pH u agħżel il-kolorant ta’ Loeffler. Jekk kollox jitbajja’ iżda xejn ma jiddistingwi ruħu, ibdel il-kunċett tal-kolorant u agħżel il-polikromu. Jekk frottis b’Loeffler juri l-granuli b’mod mill-isbaħ iżda s-superviżur jistaqsi għaliex in-nuklei u ċ-ċitoplażma għandhom l-istess blu, it-tweġiba hija li l-ebda kolorant alkalin monokromu ma jista’ jagħmel dak ix-xogħol. Dik il-mistoqsija tappartjeni għall-familja polikroma u għad-derivattivi tagħha għat-tbajja’ tad-demm.

Kif tevita l-konfużjonijiet komuni

Żewġ żbalji jispjegaw il-biċċa l-kbira tal-konfużjoni. L-ewwel huwa li wieħed iqis il-kolorant ta’ Loeffler bħala interkambjabbli mal-blu tal-metilen sempliċi għax it-tnejn jidhru blu fil-flixkun. Huma differenti fil-pH u fl-intensità, u jekk tuża kolorant newtrali minflok Loeffler fejn dan ikun speċifikat, titlef preċiżament il-kuntrast tal-granuli li fuqu nbena l-protokoll. It-tieni huwa li wieħed iqis kwalunkwe blu alkalin qadim jew li tħalla jixjieħ b’mod aċċidentali bħala polikromu. Il-maturazzjoni mhux ikkontrollata tipproduċi taħlita mhux magħrufa b’qawwa mhux magħrufa, filwaqt li s-soluzzjonijiet polikromi veri jiġu ppreparati permezz ta’ metodi definiti ta’ ossidazzjoni u, fil-linja tal-koloranti tad-demm, jiġu kkombinati ma’ eosina mkejla. L-istorja toffri tagħlima hawnhekk: is-soluzzjonijiet maturati fl-ilma u mhux stabbli tas-snin 1890 ġew sostitwiti b’formulazzjonijiet stabbilizzati fil-metanol preċiżament għax it-taħlitiet mhux ikkontrollati ma setgħux jiġu riprodotti, tagħlima ta’ min jiftakar qabel ibajja’ ħġieġa dijanjostika b’kolorant minn flixkun ta’ età inċerta.

L-eżattezza fl-ismijiet tagħlaq iċ-ċirku. Ikkonferma l-prodott tal-katalgu (fl-ilma jew ta’ Loeffler jew polikromu), il-kontenut tal-kolorant u l-applikazzjoni maħsuba fuq it-tikketta, minflok tiddeduċihom mill-kulur. It-tliet formulazzjonijiet għandhom oriġini komuni fil-kromoforu. Ma għandhomx l-istess għan.