झेब्राफिश संशोधनातील मिथिलीन ब्लू: संगोपनातील पूरक पदार्थ आणि प्रयोगातील गोंधळ निर्माण करणारा घटक

झेब्राफिशच्या अंड्यांचे पाणी अनेकदा फिकट निळे असते, आणि त्यामागचे कारण क्वचितच कोणी नोंदवते. हा रंगद्रव्य पदार्थ मिथिलीन ब्लू असतो; बुरशी रोखण्यासाठी तो घातला जातो आणि बहुतेक कार्यपद्धतींमध्ये त्याला पार्श्वभूमीचा भाग मानले जाते. येथे पार्श्वभूमी ही संकल्पना चुकीची आहे. त्यापेक्षा योग्य संकल्पना म्हणजे नोंद न केलेला प्रायोगिक घटक: उपचार दिलेल्या पात्रांत उपस्थित पण नियंत्रण गटात अनुपस्थित असलेला, वापरलेल्या सांद्रतांवर औषधशास्त्रीयदृष्ट्या सक्रिय असलेला आणि प्रयोगात मोजल्या जाणाऱ्या अंतिम निर्देशांकांमध्येच बदल घडवू शकणारा पदार्थ.

पुढील संपूर्ण चर्चा या फरकावर आधारलेली आहे. नियमित बुरशीप्रतिबंधक संगोपन हा एक प्रश्न आहे. हा पूरक पदार्थ तुमच्या चाचणीच्या दृष्टीने निष्प्रभावी आहे का, हा वेगळा प्रश्न आहे. झेब्राफिशवरील अलीकडील संशोधनसाहित्य पहिल्या प्रश्नाचे आश्वासक, तर दुसऱ्या प्रश्नाचे अस्वस्थ करणारे उत्तर देते.

मार्गदर्शक तत्त्वे प्रत्यक्षात काय सांगतात

एकच सार्वत्रिक मानक नाही, आणि हा समस्येचाच एक भाग आहे. Canadian Council on Animal Care च्या मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार बुरशीची वाढ कमी करण्यासाठी अंडी आणि अळ्यांच्या वाहतूक द्रावणात 0.5 mg/L, किंवा 0.00005%, वापरण्यास परवानगी आहे. प्रयोगशाळेतील प्राण्यांबाबतच्या युरोपीय मार्गदर्शक तत्त्वांमध्ये भ्रूण ठेवण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या माध्यमात अनेकदा हेच 0.00005% असल्याचे वर्णन आहे. Cold Spring Harbor च्या E3 कृतीत याच्या दुप्पट प्रमाण, म्हणजे 1 mg/L किंवा 0.0001%, घटक म्हणून दिले आहे. याउलट एक ठळक वगळलेली बाब दिसते: OECD च्या माशांच्या भ्रूणावरील विषारीपणा चाचणीच्या मार्गदर्शक तत्त्वांत पुनर्घटित विरलीकरण पाणी आणि चाचणीतील रसायन नमूद आहे, पण 2013 च्या आवृत्तीत किंवा नंतरच्या सुधारित आवृत्तीत मिथिलीन ब्लूची शिफारस नाही. त्यामुळे एक प्रयोगशाळा झेब्राफिश भ्रूणांना आयुष्याच्या पहिल्या काही तासांपासून मिथिलीन ब्लू असलेल्या निळ्या पाण्यात वाढवते, तर दुसरी नियामक भ्रूण चाचणी स्वच्छ, रंगहीन पाण्यात करते; तरीही दोन्ही आपल्या माध्यमाला नेहमीचे माध्यम म्हणतात. प्रयोगशाळांमधील निष्कर्षांची तुलना करणाऱ्या किंवा पूर्वीच्या नियंत्रण गटांचा डेटा एकत्र करणाऱ्या कोणालाही ही विसंगती स्वीकारावी लागते.

सांद्रतांचा संदर्भ द्यायचा तर, 0.00005% म्हणजे सुमारे 1.56 micromolar आणि 0.0001% म्हणजे सुमारे 3.13 micromolar. ही प्रमाणे कमी आहेत, आणि परिणाम घडवण्यासाठी ती फारच कमी आहेत असे मानण्याचा मोह होऊ शकतो. पुढील अभ्यास नेमक्या याच सांद्रतांवर नेमके हेच गृहीतक तपासतात.

प्रयोगशाळेऐवजी मासे पाळण्याच्या अनुभवातून आलेल्या वाचकांना हाच रेणू वेगळ्या संदर्भात भेटतो; त्याची चर्चा मिथिलीन ब्लूविषयी मत्स्यालय मार्गदर्शकात केली आहे. रसायनशास्त्र तेच आहे; हा रंगद्रव्य पदार्थ पेशींमधून इलेक्ट्रॉन कसे वाहून नेतो यावरील चर्चा, ऑक्सिडीकरण-अपचयन क्रियेत सक्रिय असलेले हे संयुग चयापचयावरील संशोधनलेखांत वारंवार का दिसते, हे स्पष्ट करते. पुढील चर्चा विशेषतः मिथिलीन ब्लू असलेल्या झेब्राफिशच्या अंड्यांच्या पाण्याबद्दल आहे.

चयापचय: विकासाच्या टप्प्यानुसार परिणामाची दिशा बदलते

सर्वाधिक माहिती देणाऱ्या अभ्यासात सामान्यपणे विकसित होणाऱ्या झेब्राफिशना आयुष्याच्या पहिल्या दिवसापासून फलनानंतरच्या 5 दिवसांपर्यंत या पदार्थाच्या संपर्कात ठेवले आणि प्रत्येक टप्प्यावर ऑक्सिडेटिव्ह चयापचय मोजला; याचे वर्णन भ्रूणांच्या चयापचय प्रयोगांच्या प्रकाशित अहवालात आहे. परिणामांची दिशा उलटत असल्याने हा नमुना काळजीपूर्वक मांडणे महत्त्वाचे आहे.

फलनानंतर 1 दिवसाने, संगोपनासाठी वापरल्या जाणाऱ्या दोन्ही सांद्रतांवर पदार्थाच्या संपर्कात असलेल्या भ्रूणांचा मूलभूत ऑक्सिजन वापर वाढला. 2 दिवसांनी, अळ्यांच्या पृष्ठभागीय थरातील माइटोकॉन्ड्रियाच्या झिल्लीचे विभव 0.00005%, 0.0001% आणि 0.0003% या सर्व संपर्क-सांद्रतांवर वाढले होते. 4 ते 5 दिवसांपर्यंत, अंड्यातून बाहेर पडल्यानंतर, परिणामाची दिशा उलटली होती: ऑक्सिडेटिव्ह ऊर्जाव्यय कमी झाला, मग संपर्क फलनापासून सातत्याने असो किंवा फक्त दिवस 3 ते दिवस 4 या कालावधीपुरता अल्पकालीन असो. त्याचबरोबर, माइटोकॉन्ड्रियातील श्वसन संकुलांच्या उपघटकांसाठीचे ट्रान्सक्रिप्ट्स 1 आणि 4 या दोन्ही दिवसांना कमी झाले; स्टेरॉइडनिर्मिती आणि ग्लुकोनिओजेनेसिसशी संबंधित ट्रान्सक्रिप्ट्सही कमी झाले.

आणखी दोन निरीक्षणे हे चित्र अधिक स्पष्ट करतात. संगोपनातील अधिक सांद्रतेवर अंड्यातून बाहेर पडणे किंचित लवकर झाले: 2 दिवसांनी संपर्कात असलेले भ्रूण पुढे होते, तर दिवस 3 पर्यंत नियंत्रण गटाने त्यांना गाठले. तसेच ताण-प्रतिसाद अक्ष स्वतः अबाधित असल्याचे दिसले: 5 दिवसांच्या अळ्यांना घोंघावणाऱ्या पाण्याचा ताण दिल्यावर दोन्ही गटांत संपूर्ण शरीरातील कॉर्टिसोल नेहमीप्रमाणे वाढले. त्यामुळे या प्रमाणांवर रंगद्रव्य सर्वसाधारण विकासात्मक विष म्हणून काम करत नाही आणि प्रत्येक शरीरक्रियात्मक प्रतिसादही कमी करत नाही. ते विकासाच्या टप्प्यानुसार ऊर्जा चयापचय बदलते—अंड्यातून बाहेर पडण्याआधी वाढवते आणि नंतर कमी करते.

वर्तन: दोन अभ्यासांचे निष्कर्ष वेगळे का आहेत आणि दोन्ही बरोबर कसे असू शकतात

संपर्काच्या प्रायोगिक रचना शेजारी ठेवून पाहेपर्यंत वर्तनविषयक संशोधनसाहित्य परस्परविरोधी वाटते. एका विकासात्मक आणि वर्तनविषयक सुरक्षितता अभ्यासात भ्रूणांना फलनानंतर सुमारे 6 तासांपासून 10 micromolar पर्यंतच्या सांद्रतांच्या संपर्कात ठेवले, दिवस 4 पर्यंत द्रावणे दररोज बदलली, नंतर दिवस 5 आणि 6 साठी अळ्या रंगद्रव्यरहित माध्यमात हलवल्या आणि दिवस 6 ला प्रकाश-अंधार चाचणीत हालचाल तपासली. निष्कर्ष: मृत्युदर, अंड्यातून बाहेर पडणे किंवा आकाररचनेवर लक्षणीय परिणाम नव्हता आणि उपचाराचा हालचालीवर परिणाम नव्हता. लेखकांनी त्यांच्या परिस्थितीत 10 micromolar ही कमाल मर्यादा म्हणून सुचवणे योग्य होते.

दुसऱ्या गटातील काही लेखक चयापचय अभ्यासातही सहभागी होते. या गटाने प्रत्यक्ष संगोपनात जसा संपर्क असतो तशीच रचना वापरली: फलनानंतर 2 ते 3 तासांपासून रंगद्रव्य उपस्थित होते, दररोज माध्यमाचा काही भाग बदलला जात होता आणि संपर्क चालू असताना किंवा नुकताच संपल्यानंतर वर्तन मोजले गेले. त्याच नियमित सांद्रतांवर, 24-तासांच्या चाचणीत अळ्यांची हालचाल कमी झाली; हा परिणाम विविध वंशरेषा आणि प्रयोगशाळांमध्ये पुन्हा दिसला. वर्तनातील गोंधळ निर्माण करणाऱ्या परिणामांच्या अभ्यासाने या परिणामाचा संबंध सेरोटोनिनच्या मूलभूत संकेतक्रियेशी जोडला, जो रंगद्रव्याच्या ज्ञात मोनोअमाइन ऑक्सिडेज प्रतिबंधाशी सुसंगत होता. सर्वाधिक लक्षवेधी बाब म्हणजे, मिथिलीन ब्लू असलेल्या भ्रूण माध्यमाने SSRI फ्लुओक्सेटीनला अपेक्षित असलेला हालचालींचा प्रतिसाद झाकला. त्यामुळे निळ्या पाण्यात केलेल्या छाननी चाचणीत औषधाचा असा परिणाम न दिसण्याची शक्यता असते, जो रंगहीन पाण्यात दिसला असता.

येथे प्रत्यक्ष विरोधाभास नाही. एका चाचणीत संयुग काढून टाकल्यानंतर दोन दिवसांनी त्याच्या परिणामाचा शोधता येण्याजोगा अवशेष नसू शकतो, आणि तरी दुसऱ्या चाचणीत ते उपस्थित असताना सक्रिय असू शकते. व्यावहारिक अर्थ असा की परिणाम न आढळणे हे सांद्रतेची कमाल मर्यादा ठरवण्याला आधार देते, निष्प्रभावीपणाच्या दाव्याला नाही; तर परिणाम आढळलेला अभ्यास महत्त्वाची जोखीम दाखवतो: मोजमापाच्या कालावधीत सक्रिय संपर्क, तोही बहुतेक प्रयोगशाळा वापरत असलेल्या नेमक्या रचनेत.

ऑक्सिडीकरण-अपचयन चाचणीत ऑक्सिडीकरण-अपचयन करणारे रंगद्रव्य

आणखी एका सापळ्यासाठी स्वतंत्र परिच्छेद आवश्यक आहे, कारण तो प्राण्याऐवजी मोजमापाची पद्धतच बिघडवतो. Alamar Blue ऊर्जाव्यय चाचणी स्वतः ऑक्सिडीकरण-अपचयन रसायनशास्त्रावर आधारित आहे: रेझाझ्युरिनचे अपचयन होऊन प्रतिदीप्त रेझोरुफिन तयार होते. मिथिलीन ब्लूही ऑक्सिडीकरण-अपचयन क्रियेत सहभागी होते. पेशीविरहित नियंत्रण नमुन्यांमध्ये, संगोपनाच्या दोन्ही सांद्रतांनी 24 तासांनंतर Alamar Blue ची प्रतिदीप्ती किंचित पण लक्षणीयरीत्या कमी केली. प्राण्यांवरील प्रयोगांत संपर्कात असलेले भ्रूण चाचणीपूर्वी रंगद्रव्यरहित माध्यमात किमान तीन वेळा धुतले होते, आणि अंड्यातून बाहेर पडलेल्या अळ्यांमधील जैविक परिणाम पेशीविरहित हस्तक्षेपापेक्षा अधिक होता. त्यामुळे दोन्ही गोष्टी खऱ्या आहेत: धुतलेल्या प्राण्यांमध्ये खरा चयापचय परिणाम टिकतो आणि न धुतलेले रंगद्रव्य त्यावर थेट रासायनिक कृत्रिम परिणामाची भर घालते. नियंत्रण नमुन्यांनी हे दोन्ही वेगळे केले पाहिजेत; अन्यथा दोन्हीपैकी कोणत्याही आकड्याला अर्थ राहत नाही. रंगद्रव्याधारित चाचण्यांचे निष्कर्ष समजून घेण्याविषयीचे सर्वसाधारण मार्गदर्शन येथे विशेष महत्त्वाचे ठरते.

विकासाच्या टप्प्यांची कालरेषा

या लेखासाठी तयार केलेली मूळ संदर्भसामग्री. वेगळे नमूद केले नसल्यास, सांद्रता संगोपनातील दोन मानक मूल्ये आहेत: 0.00005% आणि 0.0001%.

लक्षात ठेवण्याचा नमुना असा आहे: चयापचयाच्या अंतिम निर्देशांकांत सुरुवातीला वाढ आणि नंतर घट; वर्तनावरील परिणाम संपर्कादरम्यान उपस्थित, पण पदार्थ बाहेर टाकल्यानंतर ते तपासणाऱ्या एका चाचणीत शोधता न येणारे.

नियंत्रण गटांच्या रचनेची तपासणीसूची

ही दुसरी मूळ संदर्भसामग्री आहे. मिथिलीन ब्लू वापरणाऱ्या झेब्राफिश कार्यपद्धती एखाद्या प्रयोगाचा भाग असतील तेव्हा ती वापरा.

1. रंगद्रव्याची नोंद पाणी म्हणून नव्हे, तर अभिकर्मक म्हणून करा. सांद्रता टक्केवारी आणि micromolar या दोन्ही स्वरूपांत नोंदवा; फलनानंतर किती तासांनी किंवा दिवसांनी संपर्क सुरू आणि बंद केला, माध्यम बदलण्याचे वेळापत्रक आणि प्रत्येक मोजमापापूर्वी रंगद्रव्य काढून टाकण्यासाठी दिलेला कालावधी नमूद करा.
2. प्रश्नानुसार नियंत्रण गट जुळवा. चाचणीतील रसायनाच्या अभ्यासासाठी रंगद्रव्यरहित नियंत्रण गट आवश्यक आहेत; संगोपनाच्या अभ्यासासाठी रंगद्रव्यरहित आणि रंगद्रव्य असलेले असे गट आवश्यक आहेत, तसेच बुरशीप्रतिबंधक परिणाम नोंदवणे गरजेचे आहे, कारण उद्धृत केलेल्या दोन्ही अभ्यासांपैकी कोणत्याही अभ्यासाने बुरशीप्रतिबंधक परिणामकारकता मोजली नव्हती.
3. ऑक्सिडीकरण-अपचयन चाचण्यांपूर्वी धुवा, नंतर पडताळणी करा. रंगद्रव्यरहित माध्यमात किमान तीन वेळा धुवा आणि सोबत पेशीविरहित रंगद्रव्य-अधिक-अभिकर्मक नियंत्रण नमुना चालवा, कारण रंगद्रव्य Alamar Blue चा संकेत थेट कमी करते.
4. वर्तन आणि मोनोअमाइनशी संबंधित अंतिम निर्देशांक उच्च जोखमीचे माना. हालचाल, दचकण्याचा प्रतिसाद, चिंतासदृश वर्तन, अवसादरोधक आणि MAO-प्रतिबंधक अभ्यासांनी मोजमापादरम्यान रंगद्रव्य टाळावे किंवा प्रत्येक अंतिम निर्देशांकासाठी त्याचा निष्प्रभावीपणा दाखवावा; एक ते दोन दिवसांच्या रंगद्रव्य काढून टाकण्याच्या कालावधीने हालचालीवरील एक परिणाम दूर झाला, पण इतर प्रायोगिक पद्धतींसाठी हे सिद्ध झालेले नाही.
5. प्रत्येक टप्प्यावर चयापचय आणि माइटोकॉन्ड्रियाशी संबंधित अंतिम निर्देशांक उच्च जोखमीचे माना. ऑक्सिजन वापर, ऊर्जाव्यय, झिल्लीचे विभव आणि श्वसन साखळीचे ट्रान्सक्रिप्ट्स संगोपनाच्या सांद्रतांवर बदलतात; अंड्यातून बाहेर पडण्याआधी आणि नंतर त्यांच्या बदलाच्या दिशा विरुद्ध असतात.
6. एका प्रायोगिक रचनेतील निष्प्रभावीपणा दुसऱ्या रचनेला लागू मानू नका. रंगद्रव्य काढून टाकल्यानंतर परिणाम न आढळणे हे चालू संपर्काला लागू होत नाही; आकाररचनेवर परिणाम न आढळणे हे चयापचय किंवा औषधाच्या परस्परक्रियेला लागू होत नाही; एका वंशरेषेतील, तापमानातील किंवा चाचणी कालावधीतील निष्कर्ष इतरांना लागू होत नाहीत.
7. तुम्ही कोणती मार्गदर्शक तत्त्वे पाळली आणि त्यांना कोणता पर्याय आहे, हे सांगा. CCAC, युरोपीय किंवा Cold Spring Harbor सांद्रता स्पष्टपणे नमूद करा आणि OECD भ्रूण चाचणीत रंगद्रव्य वगळलेले आहे हे नोंदवा, जेणेकरून वाचकाला तुमच्या प्राण्यांचे प्रयोगातील स्थान समजू शकेल.

यापैकी काहीही अंडी जिवंत ठेवण्यासाठी रंगद्रव्य वापरण्याविरुद्ध नाही. हे संगोपनातील निवड न तपासता डेटामध्ये शिरू देण्याविरुद्ध आहे. पात्रातील निळा रंग हा औषधशास्त्रीय क्रिया असलेला रेणू आहे, आणि विकृत होण्याची सर्वाधिक शक्यता असलेले प्रयोग म्हणजे नेमक्या त्या मोठ्या संख्येतील नमुने तपासणाऱ्या चयापचय आणि मज्जावर्तनविषयक छाननी चाचण्या, ज्यांसाठी आता लहान वयातील झेब्राफिशना प्राधान्य दिले जाते. त्याची नोंद करा, त्यासाठी नियंत्रण ठेवा, मोजमापापूर्वी तो धुऊन काढा आणि तो नकळत सहभागी होत असू शकणाऱ्या चाचणीची तपासणी करा.