मिथिलीन ब्लूच्या यीस्ट चाचण्या: जिवंत पेशींची मोजणी विरुद्ध श्वसनाचा वेळ मोजणे

प्रयोगशाळेच्या टेबलावर दोन नळ्या आहेत. दोन्ही निळ्या आहेत. एका चाचणीत सूक्ष्मदर्शकाखाली दिसणाऱ्या निळ्या पेशी म्हणजे मृत यीस्ट. दुसऱ्या चाचणीत निळी नळी रंगहीन होणे म्हणजे यीस्ट जिवंत आहे आणि श्वसन करत आहे. रंगद्रव्य तेच, पण अर्थ परस्परविरुद्ध. या दोन चाचण्यांची गल्लत झाली तर प्रत्येक निष्कर्ष उलटा होतो.

हा फरकच या संपूर्ण लेखाचा केंद्रबिंदू आहे. मिथिलीन ब्लू हे ऑक्सिडीकरण-अपचयन रंगद्रव्य आहे: ऑक्सिडीकरण झालेल्या अवस्थेत ते निळे असते, तर अपचयन झाल्यावर ते रंगहीन ल्युकोमिथिलीन ब्लू बनते. जीवक्षमता मोजताना या रसायनशास्त्राचा वापर सूक्ष्मदर्शकाखाली अल्पकाळातील स्थिती पाहण्यासाठी होतो. श्वसनाच्या प्रयोगात त्याचाच वापर संपूर्ण मिश्रणातील अभिक्रियेचा वेळ मोजण्यासाठी होतो. प्रत्येक चाचणीला स्वतंत्र कार्यपद्धती, स्वतंत्र नियंत्रणे आणि स्वतंत्र चिकित्सक दृष्टी आवश्यक आहे.

जीवक्षमतेची मोजणी: अल्पकाळ अभिरंजन करा, लगेच निरीक्षण करा

मद्यनिर्मितीत वापरली जाणारी कार्यपद्धती ही याची सर्वाधिक प्रमाणित आवृत्ती आहे. 2% सोडियम सायट्रेटमध्ये 0.01% w/v मिथिलीन ब्लू तयार करा, ते यीस्टच्या निलंबनात 1:1 प्रमाणात मिसळा आणि ठरवलेल्या अल्प कालावधीनंतर मिश्रण तपासा. प्रकाशित पद्धतींतील कालावधी Brewing Science Institute च्या हस्तपुस्तिकेतील 1 ते 2 मिनिटांपासून संशोधन कार्यपद्धतींतील सुमारे 5 मिनिटांपर्यंत बदलतो; OIV च्या वाइन सूक्ष्मजीवशास्त्र पद्धतीनुसार तपासणी 10 मिनिटांच्या आत करणे आवश्यक आहे. मोजणीच्या मिश्रणात रंगद्रव्याची अंतिम सांद्रता सुमारे 0.005% होते. सुधारित Neubauer मोजणी कक्षात मिश्रण भरा आणि सुमारे 400x वर्धनावर गडद निळ्या पेशी अजीवक्षम व रंग न लागलेल्या पेशी जीवक्षम म्हणून वर्गीकृत करा. OIV पद्धतीत फिकट निळ्या पेशी जिवंत मानल्या जातात; यातूनच खाली चर्चिलेल्या व्यक्तिनिष्ठतेच्या समस्येची कल्पना येते.

पेशींची सांद्रता कक्षाच्या भूमितीवरून मिळते. मध्यभागातील पूर्ण 1 mm बाजूचा चौकोन मोजल्यास, प्रति mL पेशींची संख्या म्हणजे N गुणिले विरलन गुणांक गुणिले 10^4; येथे N म्हणजे त्या क्षेत्रातील मोजलेली संख्या, जसे ASBC च्या यीस्ट पद्धतींमध्ये दिले आहे. जीवक्षमता मोजणे अधिक सोपे आहे: रंग न लागलेल्या पेशींची संख्या भागिले एकूण पेशींची संख्या, गुणिले 100. FEMS च्या मद्यनिर्मितीतील तुलना अभ्यासानुसार आणि OIV च्या पद्धतीनुसार, जीवक्षमतेचा अंदाज घेण्यासाठी सुमारे 400 पेशी मोजा. सीमारेषांवरील पेशी मोजण्याचा एकच नियम सातत्याने वापरा; उदाहरणार्थ, जाळीच्या खालच्या व डाव्या रेषांवरील पेशी समाविष्ट करा आणि वरच्या व उजव्या रेषांवरील पेशी वगळा.

मोजणी सुरू करण्यापूर्वी कळ्यांसाठी नियम ठरवणे आवश्यक आहे. प्रचलित नियमानुसार, कळी मातृपेशीच्या आकाराच्या सुमारे निम्मी झाल्यावर ती स्वतंत्र पेशी म्हणून मोजली जाते; त्यापेक्षा लहान असल्यास मातृपेशीसोबत मोजली जाते. कोणताही नियम निवडला तरी तो प्रत्येक चौकोनाला लागू करा आणि कार्यपत्रकावर लिहा, जेणेकरून पुढची व्यक्तीही तोच नियम वापरेल.

मोजणी कार्यपत्रक (हे छापा)

हे कार्यपत्रक या लेखासाठी स्वतंत्रपणे तयार केलेले साधन आहे. ते वहीत उतरवा किंवा प्रत्येक नमुन्यासाठी एक प्रत छापा.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, यात N ही निश्चित केलेल्या कक्षक्षेत्रातील मोजणी आहे. येथे unstained म्हणजे रंग न लागलेल्या पेशी, dark blue म्हणजे गडद निळ्या पेशी आणि dilution factor म्हणजे विरलन गुणांक. निकालाच्या शेजारी अभिरंजन कालावधी नोंदवा, कारण वेळ नमूद नसलेली जीवक्षमतेची संख्या पुनरुत्पादित करता येत नाही.

जीवक्षमतेच्या आकड्यांत बदल का होतात

वेळ हा पहिला हस्तक्षेप आहे आणि त्याचा परिणाम दोन्ही दिशांनी होतो. चयापचयदृष्ट्या सक्रिय पेशी रंगद्रव्याचे अपचयन करतात, त्यामुळे लवकर निरीक्षण केल्यास जिवंत पेशींनी अपचयन पूर्ण केलेले नसू शकते आणि त्या चुकून मृत ठरू शकतात. पण दीर्घकाळ रंगद्रव्याच्या संपर्कात राहणे स्वतःच विषारी ठरते आणि खरोखर नुकसान झालेल्या निळ्या पेशी निर्माण करते, ज्यामुळे मृत्युदर्शक अभिरंजनाचा चुकीचा निष्कर्ष निघतो. म्हणून प्रयोगशाळेतील अध्यापन कार्यपद्धतीत 5 मिनिटांच्या आत वर्गीकरण करण्यास सांगितले आहे, जसे विस्कॉन्सिनच्या यीस्ट अध्यापन कार्यपद्धतीत नमूद केले आहे. योग्य निष्कर्ष असा की मिथिलीन ब्लूवर आधारित वर्गीकरण वेळेवर अवलंबून असते; म्हणून एक अल्प कालावधी ठरवा आणि मालिकेतील प्रत्येक नमुन्यासाठी तोच कायम ठेवा.

कमी जीवक्षमता असलेल्या नमुन्यांमध्ये दुसरा पूर्वग्रह असतो. प्रमाणित पद्धतीत इशारा दिला आहे की सुमारे 80% पेक्षा कमी जीवक्षमता असताना मिथिलीन ब्लू खऱ्या जीवक्षमतेपेक्षा जास्त अंदाज देऊ शकते, कारण रंगद्रव्याचे अपचयन करणाऱ्या पेशींमध्ये प्रजननक्षमता टिकून असेलच असे नाही. जीवक्षमता मोठ्या प्रमाणात घटलेली असताना अशीच अविश्वसनीयता मद्यनिर्मितीविषयक साहित्यातही वर्णन केली आहे. मिथिलीन ब्लूला जलद, ढोबळ अंदाजाचे साधन माना आणि कमी जीवक्षमतेशी संबंधित महत्त्वाच्या निर्णयांची, जसे यीस्ट संवर्धन पुन्हा किण्वनासाठी वापरणे, प्लेट मोजणी किंवा पूरक अभिरंजनाद्वारे पुष्टी करा.

नमुना-माध्यमाचे परिणाम तिसऱ्या क्रमांकावर येतात. OIV पद्धत सुमारे pH 4.6 वर केली जाते आणि तिच्यात असा इशारा आहे की प्रबळ बफरिंग असलेले कमी pH चे नमुने रंगद्रव्याला योग्य प्रकारे कार्य करू देत नाहीत. तसेच 100 g/L पेक्षा जास्त साखर असताना ही चाचणी न करण्याचा सल्ला दिला आहे, कारण अशा वेळी पेशी दिशाभूल करणाऱ्या फिकट निळ्या दिसतात. अभिरंजनाच्या pH ची प्रायोगिक तुलना केली असता तपासलेल्या श्रेणीत संवेदनशीलतेत लक्षणीय बदल आढळले; हे pH वर अवलंबून असलेल्या मिथिलीन ब्लू पद्धतीच्या अभ्यासाशी सुसंगत आहे. अवशेष हा स्वतंत्र सापळा आहे: अशुद्ध धान्य-मिश्रणातील रंग लागलेले कण मृत पेशींसारखे दिसतात आणि निरीक्षकांमधील फरक वाढवतात.

हा फरक केवळ अनुभवाधारित नाही; त्याचे मोजमाप केलेले आहे. FEMS च्या यीस्ट तुलना अभ्यासात नोंदवलेल्या सहा महिन्यांच्या मद्यनिर्मिती चाचणीत, मिथिलीन ब्लूच्या दुहेरी मोजमापांचे सरासरी प्रमाण विचलन 6.1% होते, तर ऑक्सोनॉल प्रवाह पेशीमितीसाठी ते 0.2% होते. एकाच नमुन्यावर दोन निरीक्षकांच्या निकालांत 13 टक्के-बिंदूंपर्यंत फरक होता. जीवक्षमता पद्धतींच्या 2023 मधील परिमाणात्मक तुलनेत प्रतिदीप्ती सूक्ष्मदर्शन आणि प्रवाह पेशीमिती लक्षणीयरीत्या अधिक अचूक आढळली; त्याच वेळी कामगिरी प्रजाती आणि नमुना-माध्यमावर अवलंबून असल्याचेही दिसले. Painting आणि Kirsop (PMID 24430080) यांनी दिलेले पारंपरिक पद्धतीचे वर्णन आजही संदर्भबिंदू आहे, तर यीस्टची जीवक्षमता आणि जैवक्रियाशीलता तपासण्याच्या चाचण्यांचा व्यापक आढावा (PMID 25154541) मिथिलीन ब्लूला निर्णायक चाचणीऐवजी पूरक चाचण्यांमध्ये स्थान देतो. ट्रायपन ब्लू हा येथे आपोआप अधिक चांगला पर्याय ठरत नाही: तो पेशीपटलाची अखंडता नष्ट झाल्याचे दर्शवतो, तर मिथिलीन ब्लू रंगद्रव्याचे ग्रहण आणि अपचयन क्रिया दर्शवतो. त्यामुळे ताणाखालील पेशींचे या दोन रंगद्रव्यांनुसार वेगवेगळे वर्गीकरण होऊ शकते.

श्वसनाचा प्रयोग: निळा रंग नाहीसा होण्याचा वेळ मोजा

दुसऱ्या चाचणीत सूक्ष्मदर्शक वापरलाच जात नाही. यीस्ट, ग्लुकोज आणि विरल मिथिलीन ब्लू बंद नळीत घेतले जातात आणि निळा रंग नाहीसा होण्यास किती वेळ लागतो ते घड्याळाने मोजले जाते. पेशी चयापचय करताना अपचायक समतुल्ये निर्माण करतात, जी निळ्या रंगद्रव्याचे रंगहीन रूपात परिवर्तन करतात; त्याच वेळी विरघळलेला ऑक्सिजन त्याचे पुन्हा ऑक्सिडीकरण करतो. पेशींनी ऑक्सिजन कमी केल्यावर एकूण परिणामात अपचयन वरचढ ठरते आणि नळीतील रंग नाहीसा होतो. त्यामुळे अंतिम बिंदू श्वसन, रंगद्रव्याची सांद्रता आणि ऑक्सिजनची उपलब्धता यांतील समतोल दर्शवतो. त्याची नोंद मिथिलीन ब्लूचे अपचयन किंवा रंग नाहीसा होण्याचा वेळ अशी करावी, आण्विक ऑक्सिजन वापराचा थेट दर म्हणून नव्हे.

वेळ सोयीस्कर श्रेणीत मिळावा म्हणून जीवक्षमता चाचणीपेक्षा खूप अधिक विरल रंगद्रव्य वापरा. AQA च्या A स्तरावरील आवश्यक प्रात्यक्षिकांच्या हस्तपुस्तिकेत याचे चांगले प्रमाणीकरण केले आहे: सुमारे 30 C पर्यंत गरम केलेल्या पाण्यात प्रति 100 mL मागे 1 g ग्लुकोज, वापरण्याच्या लगेच आधी घातलेले 5 g वाळवलेले यीस्ट आणि 1% मूळ द्रावणाचे 0.1 mL घेऊन एकूण आयतन 100 mL होईपर्यंत विरल करून तयार केलेले सुमारे 0.001% कार्यकारी रंगद्रव्य द्रावण. 2 mL यीस्ट-ग्लुकोज निलंबनात 2 mL कार्यकारी रंगद्रव्य द्रावण मिसळा, चाचणीच्या तापमानाशी समतोल होऊ द्या, एकदाच 10 सेकंद हलवा, वेळमापक सुरू करा आणि पुन्हा हलवू नका. हलवल्याने ऑक्सिजन पुन्हा मिसळतो आणि नळी पुन्हा निळी होते; हा कार्यपद्धतीमुळे निर्माण होणारा सर्वात मोठा कृत्रिम परिणाम आहे. AQA नुसार हे मिश्रण साधारणपणे 35 C वर सुमारे 5 मिनिटांच्या आत रंगहीन व्हायला हवे. चाचण्यांतील सरासरी वेळ 20 C वर 275 s, 35 C वर 128 s आणि 45 C वर 145 s होती. ही एका प्रयोगरचनेतील उदाहरणे आहेत, सार्वत्रिक निकष नाहीत. नियंत्रित परिस्थितीत अपचयनाचा दर आणि चयापचयदृष्ट्या सक्रिय यीस्ट यांतील परिमाणात्मक संबंधाला अपचयनावरील विशिष्ट अभ्यासांचा आधार आहे; यात PMID 25773544 म्हणून नोंदवलेले संशोधन आणि Yeast (2014) मधील क्रियायंत्रणेचा अभ्यास समाविष्ट आहे.

कालक्रम प्रात्यक्षिक (स्वतंत्रपणे तयार केलेले साधन)

खालील तक्ता या लेखासाठी तयार केलेले स्वतंत्र प्रात्यक्षिक आहे. यात वर वर्णन केलेली AQA-शैलीची प्रयोगरचना वापरली आहे: 2 mL यीस्ट-ग्लुकोज मिश्रण आणि सुमारे 0.001% चे 2 mL कार्यकारी रंगद्रव्य द्रावण, एकदा 10 सेकंद हलवणे आणि त्यानंतर न हलवता उबवणे. नोंदी या विद्यार्थी गटाने नोंदवाव्यात अशा स्वरूपातील उदाहरणात्मक निरीक्षणे आहेत. दर निर्देशांक म्हणजे 1 भागिले रंग पूर्ण नाहीसा होण्याचा सेकंदांतील वेळ. याच नळ्यांवर प्रयोग करा आणि या नोंदींच्या जागी मोजलेली मूल्ये लिहा.

A, B आणि C नळ्यांसाठी तापमानाच्या तुलनेत दर निर्देशांकाचा आलेख काढा. वक्र आधी वर जातो आणि नंतर सपाट होतो किंवा खाली येतो; हा एंझाइम-आधारित अपेक्षित नमुना आहे, सरळ रेषा नव्हे. D, E आणि F नळ्या त्या वक्रावरील डेटा बिंदू नाहीत. ती अशी नियंत्रणे आहेत ज्यांमुळे वक्राचा अर्थ लावता येतो.

प्रत्येक चाचणीला अर्थ देणारी नियंत्रणे

श्वसनाच्या प्रत्येक प्रयोगासोबत तीन नमुने आवश्यक आहेत. उकळलेले किंवा मारलेले यीस्ट, ग्लुकोज आणि रंगद्रव्य यांचे मिश्रण निळेच राहिले पाहिजे; यामुळे जलद अपचयन जिवंत पेशींच्या चयापचयावर अवलंबून असल्याचे सिद्ध होते. अतिरिक्त ग्लुकोज न घालता जिवंत यीस्ट आणि रंगद्रव्य वापरणे हे क्रियाधार नियंत्रण आहे. मात्र तरीही रंग हळूहळू नाहीसा होण्याची अपेक्षा ठेवा, कारण यीस्ट स्वतःचे अंतर्गत साठे वापरते. यीस्टशिवाय ग्लुकोज आणि रंगद्रव्य यांचे मिश्रण हा रासायनिक रिक्त नमुना आहे. तो आवश्यक आहे, कारण क्षारीय परिस्थितीत ग्लुकोज कोणत्याही पेशी नसतानाही मिथिलीन ब्लूचे अपचयन करू शकतो.

जीवक्षमतेच्या मोजणीला वेगळ्या प्रकारचे नियंत्रण लागते: कार्यपद्धतीतील सातत्य. रंगद्रव्याचे तेच मूळ द्रावण, तेच मिश्रण प्रमाण, तोच अभिरंजन कालावधी, तेच कक्षक्षेत्र आणि कळ्या व सीमारेषांसाठी तेच नियम वापरा; शक्य असल्यास नमुन्याची ओळख न जाणता मोजणी करा. दोन निरीक्षकांच्या निकालांत दहा टक्के-बिंदूंचा फरक पडल्यास कार्यपत्रकातून सहसा कारण समजते: वेगळी वेळ, निळेपणासाठी वेगळा निकष किंवा कळ्यांसाठी वेगळे नियम. अभिरंजित पेशी तयार करण्याची आणि पाहण्याची तंत्रे जीवाणूंच्या साध्या अभिरंजन पद्धतींशी संबंधित आहेत, तर विविध नमुन्यांत हे रंगद्रव्य काय दर्शवते याचा व्यापक आढावा सूक्ष्मदर्शकीय अभिरंजन नकाशासंग्रहात दिला आहे. निळ्या रंगाची कोणतीही तीव्रता परिमाणात्मक पद्धतीने वाचण्यामागील भौतिकशास्त्र समजण्यासाठी, परिस्थितींची नोंद असलेला शोषण संदर्भ स्पष्ट करतो की प्रत्येक गुणांकासोबत त्याचा विद्रावक, pH आणि सांद्रतेच्या अटी का नमूद कराव्या लागतात.

प्रश्नानुसार चाचणी निवडा. आत्ता किती पेशी जिवंत आहेत हा मोजणीचा प्रश्न आहे; त्याचे उत्तर सूक्ष्मदर्शक आणि कार्यपत्रकाच्या साहाय्याने मिळते. हे संवर्धन किती सक्रियपणे श्वसन करत आहे हा गतिकीचा प्रश्न आहे; त्याचे उत्तर स्टॉपवॉच आणि नियंत्रित नळ्यांच्या साहाय्याने मिळते. मिथिलीन ब्लू दोन्हींसाठी उपयोगी आहे, पण एकाच नळीत एकाच वेळी कधीही नाही.