G6PD प्रयोगशाळा चाचण्यांमध्ये मिथिलीन ब्लू: हा रंगद्रव्य नेमके काय करतो

उष्मायनानंतर एक विद्यार्थी दोन नळ्यांचे निरीक्षण करतो. एका नळीत अपेक्षित रंग दिसू लागला आहे. दुसऱ्या नळीत तसे झालेले नाही. दुसऱ्या रुग्णात ग्लुकोज-6-फॉस्फेट डिहायड्रोजनेजची कमतरता आहे, असा निष्कर्ष विद्यार्थी काढतो. तो निष्कर्ष योग्य असू शकतो, पण त्या तर्कात ही चाचणी ज्या संकल्पनेवर चालते तीच राहून जाते. नळीतील कोणतीही गोष्ट विकराचे थेट मापन करत नाही. मिथिलीन ब्लूला मध्यस्थ म्हणून वापरून, विकर काय निर्माण करतो याचे मापन केले जाते.

ही अप्रत्यक्ष पद्धत समजल्यावर प्रक्रिया, नियंत्रण नमुने आणि चुकीच्या निकालांची लांबलचक यादी या गोष्टी मनमानी वाटेनाशा होतात.

थोडक्यात उत्तर

G6PD चाचणीमध्ये मिथिलीन ब्लू हा रेडॉक्स निर्देशक असतो. G6PD विकर NADPH निर्माण करतो आणि NADPH-आधारित प्रणाली निळ्या मिथिलीन ब्लूचे अपचयन करून त्याचे रंगहीन ल्युको रूप तयार करतात किंवा इलेक्ट्रॉनच्या वहनासाठी त्याचा वापर करतात. विकराची क्रियाशीलता सामान्य असल्यास अपचयन कार्यक्षमतेने होते. क्रियाशीलता कमी असल्यास अपचयन संथ किंवा अपूर्ण होते. चाचणीतील संपूर्ण संकेत हाच असतो.

दोन ऐतिहासिक पद्धतींमध्ये हेच रंगद्रव्य वापरले जाते, पण अंतिम निर्देशक वेगळे असतात. त्यांच्यातील फरक लक्षात ठेवल्यास बहुतेक गोंधळ दूर होतो.

दोन चाचण्या, एक रंगद्रव्य, वेगवेगळे अंतिम निर्देशक

पहिली म्हणजे थेट मिथिलीन ब्लू अपचयन चाचणी. सॅस आणि सहकाऱ्यांनी तिचे वर्णन केले आणि नंतर गिब्स यांनी तिचे मूल्यमापन केले. येथे अंतिम निर्देशक हे रंगद्रव्य स्वतःच असते: ऑक्सिडीकृत निळ्या मिथिलीन ब्लूचे अपचयन होऊन ते रंगहीन ल्युकोमिथिलीन ब्लूकडे बदलते आणि या बदलाचा वेग NADPH निर्माण करण्याची क्षमता दर्शवतो. प्राथमिक तपासणीवरील मूळ शोधनिबंधाची नोंद PubMed वर सॅस आणि सहकारी (1966) यांच्या नावाखाली आहे.

दुसरी म्हणजे ब्रूअर मेथेमोग्लोबिन अपचयन चाचणी. सोडियम नायट्राइट प्रथम हिमोग्लोबिनचे ऑक्सिडीकरण करून तपकिरी मेथेमोग्लोबिन तयार करतो. त्यानंतर मिथिलीन ब्लू इलेक्ट्रॉन हस्तांतरणाचा मध्यस्थ म्हणून काम करतो: अपचयित मिथिलीन ब्लू मेथेमोग्लोबिनला अपचयन समतुल्य देतो आणि त्याचे पुन्हा लाल हिमोग्लोबिनमध्ये रूपांतर करतो. त्यामुळे दिसणारा अंतिम निर्देशक तपकिरी विरुद्ध लाल असा असतो, निळा विरुद्ध रंगहीन असा नाही. मूळ पद्धत जागतिक आरोग्य संघटनेच्या बुलेटिनमध्ये (ब्रूअर आणि सहकारी, 1960) प्रकाशित झाली होती.

ब्रूअर चाचणीला रंगद्रव्याचे रंगहीनीकरण करणारी चाचणी म्हणणे रासायनिकदृष्ट्या अचूक नाही. रंगद्रव्य चक्राकार बदलांमधून जाते; रंग बदलतो तो हिमोग्लोबिनचा. खालील आकृतीत दोन्ही मार्ग दाखवले आहेत.

मूलभूत अभिक्रिया

G6PD पेंटोज फॉस्फेट मार्गातील पहिल्या ऑक्सिडीकरण टप्प्याचे उत्प्रेरण करतो:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

परिपक्व लाल रक्तपेशी NADPH साठी या मार्गावर मोठ्या प्रमाणात अवलंबून असतात, याचा आढावा लुझॅटो आणि सहकाऱ्यांनी Blood मध्ये (2020) घेतला आहे. NADPH ग्लुटाथायोनला अपचयित अवस्थेत ठेवतो आणि पेशीचे ऑक्सिडेटिव्ह हानीपासून संरक्षण करतो. मिथिलीन ब्लू या व्यवस्थेत इलेक्ट्रॉन स्वीकारक म्हणून सहभागी होतो. पुरेशा G6PD मुळे पुरेसा NADPH मिळतो, त्यामुळे अपचयन कार्यक्षमतेने होते. G6PD कमी असल्यास ही साखळी पहिल्याच दुव्यावर तुटते.

रंगद्रव्याकडे इंजिन म्हणून नव्हे, तर इंधनमापक म्हणून पाहा. ते NADPH च्या पुरवठ्याची माहिती देते. हा पुरवठा किंवा चाचणीतून दिसणारा संकेत बदलणारा इतर कोणताही घटक, जनुकात कोणताही बदल नसतानाही मापकाचा काटा हलवू शकतो.

ब्रूअर प्रकारची प्रक्रिया कशी केली जाते

अभिकर्मकांची मिश्रणे गेल्या अनेक दशकांत बदलत आली आहेत. त्यामुळे शिकवण्यासाठी दिलेले वर्णन म्हणजे वैद्यकीय चाचणीची कार्यपद्धती समजू नये. प्रत्येक प्रयोगशाळा स्वतःच्या वैधता पडताळलेल्या प्रमाणित कार्यपद्धतीचे पालन करते. ही सूचना लक्षात घेऊन, पारंपरिक नळी-आधारित मांडणी पुढीलप्रमाणे असते. या प्रकाशित अंमलबजावणीत तीन नळ्या आणि 3 तासांचे उष्मायन असलेल्या स्वरूपाचे दस्तऐवजीकरण केले आहे:

1. रुग्णाच्या नमुन्याची नळी: संपूर्ण रक्तासोबत ग्लुकोज, सोडियम नायट्राइट आणि मिथिलीन ब्लू. नायट्राइट मेथेमोग्लोबिन तयार करतो, ग्लुकोज लाल रक्तपेशींच्या चयापचयाला आधार देतो आणि रंगद्रव्य NADPH-आधारित इलेक्ट्रॉन वाहकाचे काम करते.
2. ऑक्सिडीकृत नियंत्रण नमुना: रक्तासोबत नायट्राइट आणि ग्लुकोज, पण मिथिलीन ब्लू नाही. यात तपकिरी मेथेमोग्लोबिनचा अंतिम रंग दिसतो, जो कमतरतेचा नमुना दर्शवतो.
3. हिमोग्लोबिन नियंत्रण नमुना: रक्तासोबत पाणी. यात लाल हिमोग्लोबिनचा अंतिम रंग दिसतो, जो सामान्य नमुना दर्शवतो.
4. सर्व नळ्यांचे सुमारे 37 C तापमानावर, हलके मिसळत, साधारणपणे 3 तास उष्मायन करा.
5. पेशींचे विघटन होण्यासाठी आणि रंगांची तुलना स्पष्टपणे करता येण्यासाठी प्रत्येक नळीतील थोडासा अंश आसुत पाण्यात घालून विरल करा.
6. रुग्णाच्या नमुन्याच्या नळीची दोन्ही नियंत्रण नमुन्यांशी तुलना करा. रंग पुन्हा लाल होण्याकडे झुकल्यास लक्षणीय अपचयन क्षमता सूचित होते. रंग तपकिरीच राहिल्यास लक्षणीय कमतरता सूचित होते.

एका ऐतिहासिक मिश्रणात सुमारे 1 mL रक्तासोबत सुमारे 180 mM सोडियम नायट्राइट, 280 mM डेक्स्ट्रोज आणि 0.4 mM मिथिलीन ब्लू अशी अभिकर्मके वापरली होती. हे आकडे प्रकाशित साहित्यातील उदाहरण म्हणून घ्या, सार्वत्रिक मानक म्हणून नव्हे.

निकालाचा अर्थ लावणे

गुणात्मक प्राथमिक तपासणी सामान्य क्रियाशीलतेच्या सुमारे 30 ते 40 टक्के पातळीभोवती सर्वाधिक चांगला भेद करू शकते, याची चर्चा G6PD शोधण्यातील उणिवांवरील या Malaria Journal आढाव्यात केली आहे. त्यामुळे प्राथमिक तपासणीचा निकाल सामान्य असल्याचा अर्थ चाचणीत तीव्र कमतरता आढळली नाही एवढाच असतो. त्यातून क्रियाशीलता पूर्णपणे सामान्य असल्याचे प्रमाणित होत नाही.

प्राथमिक तपासणी दिशाभूल का करते

हीमोलायसिसनंतर रेटिक्युलोसाइट्सची वाढ हे खोटा सामान्य निकाल मिळण्याचे नेहमीचे कारण आहे. जुन्या पेशींपेक्षा तरुण लाल रक्तपेशी आणि रेटिक्युलोसाइट्समध्ये G6PD जास्त असतो. हीमोलायसिसच्या तीव्र प्रसंगात सर्वांत जुन्या आणि सर्वाधिक कमतरता असलेल्या पेशी आधीच नष्ट झालेल्या असू शकतात. त्यामुळे उरलेल्या तरुण पेशींच्या समूहाची क्रियाशीलता चाचणीत सामान्य दिसते. हीच जैविक प्रक्रिया केवळ रंगद्रव्याधारित प्राथमिक तपासण्यांनाच नव्हे, तर परिमाणात्मक चाचण्यांनाही दिशाभूल करते.

अलीकडे झालेले रक्तसंक्रमण कमतरता लपवते, कारण दात्याच्या लाल रक्तपेशी नमुन्यात स्वतःचा विकर आणतात. अविश्वसनीय विकर निकालांच्या कारणांमध्ये Mayo Clinic Laboratories रक्तसंक्रमणाचा उल्लेख करते, तसेच रेटिक्युलोसाइट्सची वाढ आणि श्वेत रक्तपेशींमुळे होणारा हस्तक्षेप यांचाही उल्लेख करते.

विषमयुग्मजी स्त्रिया हे सर्वांत अवघड प्रकरण आहे. X-गुणसूत्राच्या यादृच्छिक निष्क्रियतेमुळे सामान्य आणि कमतरता असलेल्या लाल रक्तपेशींचे मिश्रण तयार होते. त्यामुळे एकूण क्रियाशीलता तीव्र कमतरतेपासून वरकरणी सामान्य दिसणाऱ्या पातळीपर्यंत कुठेही असू शकते. गुणात्मक प्राथमिक तपासण्यांत मध्यम लक्षणरूपे अनेकदा निसटतात. G6PD चाचण्यांवरील WHO दस्तऐवजात या मर्यादेची सविस्तर चर्चा आहे.

नमुना किती जुना आहे, साठवणुकीचे तापमान, अंतिम रंगाच्या दृश्य मूल्यमापनातील व्यक्तिनिष्ठता, हेमॅटोक्रिट आणि अभिकर्मकांची गुणवत्ता यांमुळे या जैविक परिणामांव्यतिरिक्त विश्लेषणात आणखी अनिश्चितता येते.

प्राथमिक तपासणी म्हणजे निदान नाही

कमतरता दर्शवणारा, मध्यम किंवा वैद्यकीय निरीक्षणांशी विसंगत असलेला प्राथमिक तपासणीचा निकाल मिळाल्यास परिमाणात्मक G6PD विकर चाचणी आवश्यक असते. WHO तापमान-नियंत्रित परिमाणात्मक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रीला संदर्भ पद्धत मानते. त्या चाचणीत लाल रक्तपेशींचे विघटन करून तयार केलेल्या नमुन्यात ग्लुकोज-6-फॉस्फेट आणि NADP+ घातले जातात. तयार होणाऱ्या NADPH चे मापन 340 nm वरील वाढत्या प्रकाशशोषणातून केले जाते. बदलाचा वेग विकराच्या क्रियाशीलतेच्या समप्रमाणात असतो आणि तो सहसा हिमोग्लोबिनच्या प्रमाणानुसार प्रति ग्रॅम एककांमध्ये व्यक्त केला जातो. सध्याच्या वैद्यकीय प्रयोगशाळांतील पद्धतींचा सारांश G6PD क्रियाशीलतेसाठीच्या Mayo चाचणी सूचीतील नोंदीत दिला आहे.

अर्थ लावताना प्रयोगशाळेने वैधता पडताळलेली संदर्भ मर्यादा वापरली जाते. ही मर्यादा अनेकदा लोकसमूहातील सामान्य क्रियाशीलतेच्या तुलनेत मांडली जाते. कमतरतेची चर्चा सहसा 30 टक्के उंबरठ्याजवळ आणि मध्यम क्रियाशीलतेची चर्चा त्यापेक्षा वर केली जाते. G6PD चाचण्यांसाठी WHO ची लक्ष्य उत्पादन रूपरेषा (2022) ही निदानाची चौकट स्पष्ट करते. अलीकडील हीमोलायसिस किंवा रक्तसंक्रमणामुळे लक्षणरूप ठरवणे अविश्वसनीय होत असल्यास, लाल रक्तपेशींच्या समूहाचा समतोल पुन्हा प्रस्थापित झाल्यानंतर चाचणी पुन्हा करावी. आण्विक चाचणी अतिरिक्त माहिती देऊ शकते, पण ती विकराच्या मापनाची जागा घेत नाही.

जपण्याजोगा फरक

या चाचण्यांमध्ये मिथिलीन ब्लू हा शरीराबाहेर वापरला जाणारा प्रयोगशाळेतील अभिकर्मक असतो. ही बाब आणि रुग्णाला मिथिलीन ब्लू देण्याची सुरक्षितता हे वेगळे विषय आहेत. सुरक्षिततेचा विषय मिथिलीन ब्लूच्या वापरातील निषिद्ध परिस्थितींविषयीच्या मार्गदर्शनात मांडला आहे. जैवरसायनशास्त्र त्यांना जोडते, कारण औषधही NADPH-आधारित अपचयनावर अवलंबून असते. मात्र चाचणी नळीतील रंगद्रव्य म्हणजे रक्तप्रवाहात दिलेली मात्रा नव्हे. वेगळ्या संदर्भात हे रंगद्रव्य अभिरंजक म्हणून कसे वागते हे समजून घेण्यासाठी मिथिलीन ब्लू अभिरंजनाची तत्त्वे पाहा; आणि ते ज्या रासायनिक गटात मोडते त्यासाठी प्रयोगशाळेतील रेडॉक्स रंगद्रव्ये पाहा.

प्राथमिक तपासणी अपचयन क्षमता अबाधित दिसते का, हे विचारते. पुष्टीकरण चाचणी प्रत्यक्षात किती विकर आहे, हे विचारते. रंगद्रव्य पहिल्या प्रश्नाचे उत्तर चांगले देते, मात्र त्याच्याकडून दुसऱ्या प्रश्नाचे उत्तर अपेक्षित नसावे.