DNA आणि RNA रंजनासाठी मेथिलीन ब्लू: जेल आणि पडद्यांवरील उपयोग

एक विद्यार्थी अगरोज जेलवर विद्युत् अपघटन चालवतो, त्याला मेथिलीन ब्लूने रंगवतो, आणि जिथे ठळक पट्टा अपेक्षित होता तिथे त्याला काहीच दिसत नाही. शेजारच्या कार्यस्थळी, एक पोस्टडॉक संशोधक त्याच निळ्या द्रावणाने Northern पडदा रंगवतो आणि तीन मिनिटांत स्पष्ट रायबोसोमल पट्टे मिळवतो. विद्यार्थी जेलचा प्रयोग अयशस्वी झाल्याचा निष्कर्ष काढतो. पण जेलचा प्रयोग अयशस्वी झालेला नसतो. दोन्ही कामे वेगळी होती, आणि एकच रंगद्रव्य त्यांच्यासाठी वेगवेगळी संवेदनशीलता, वेगवेगळी पार्श्वभूमी आणि पुढील प्रक्रियेसाठी वेगवेगळे नियम घेऊन काम करते.

मेथिलीन ब्लूने DNA रंजन आणि मेथिलीन ब्लूने RNA रंजन यांमागील रसायनक्रिया समान असली तरी उद्देश समान नसतो. जेलमध्ये, सच्छिद्र माध्यमात किती न्यूक्लिक आम्ल आहे हे रंगद्रव्य दाखवते. पडद्यावर, स्थानांतरण यशस्वी झाले का आणि लेनमध्ये समान प्रमाणात नमुने भरले होते का हे ते दाखवते. हा फरक स्पष्ट झाल्यावर कार्यपद्धती, शोधमर्यादा आणि सुसंगततेच्या मर्यादा समजतात.

थोडक्यात उत्तर

मेथिलीन ब्लू हे सपाट संरचनेचे धनायनिक रंगद्रव्य आहे. फॉस्फेटकडे असलेले विद्युत् स्थैतिक आकर्षण, क्षारक-जोड्यांमध्ये अंतःस्थापन आणि लहान खाचेशी संलग्नता यांच्या संयोगातून ते न्यूक्लिक आम्लांना असहसंयुजी आणि उत्क्रमणीय रीतीने बांधते. ही उत्क्रमणीयताच महत्त्वाची आहे. दृश्यमान प्रकाशात पट्ट्यांचे रंजन करून त्यांची नोंद करता येते; त्यानंतर क्लोनिंग, संकरण किंवा पुन्हा प्रोब लावण्यासाठी रंग काढता किंवा नमुना शुद्ध करता येतो.

द्विसूत्री DNA च्या मेथिलीन ब्लू अगरोज जेल रंजनासाठी प्रमाणित जलद पद्धतीत पाण्यातील 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) द्रावण वापरले जाते. सुमारे 15 minutes रंजन आणि त्यानंतर सुमारे 15 minutes पाण्याने रंग काढून, पांढऱ्या प्रकाशाच्या पेटीवर जेल पाहिले जाते. पडद्यांसाठीच्या पारंपरिक Northern ब्लॉट पद्धतीत pH 5.2 च्या जवळ असलेल्या सोडियम अॅसिटेटमध्ये 0.02 ते 0.04 percent रंगद्रव्य वापरले जाते. स्थानांतरण आणि स्थिरीकरणानंतर काही मिनिटे रंजन केले जाते; मग पाण्याने धुऊन संकरणापूर्वी रंग पूर्णपणे काढला जातो. संवेदनशीलता मर्यादित असते: चांगल्या परिस्थितीत प्रत्येक जेल पट्ट्यासाठी दहापट ते शेकडो नॅनोग्रॅम, तर सावध अंदाज देणाऱ्या मार्गदर्शकांमध्ये 0.5 ते 1 microgram नमूद केलेले असते. हे प्रमाण एथिडियम ब्रोमाइड आणि SYBR रंगद्रव्यांच्या तुलनेत अनेक परिमाणक्रमांनी जास्त आहे. पडद्यांवर एका विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्टसाठी उपयुक्त अशी एकच शोधमर्यादा नसते, कारण रंगद्रव्य मुख्यतः विपुल प्रमाणातील रायबोसोमल RNA आणि भरलेल्या एकूण पदार्थाचे दर्शन घडवते. यांपैकी कोणत्याही पद्धतीत किरकोळ विक्रीतील पूरक उत्पादनाचे द्रावण पर्याय म्हणून वापरू नका. प्रमाणित पद्धतींमध्ये विश्लेषणात्मक दर्जाचे रंगद्रव्य, निश्चित संघटनाचे बफर आणि RNA असताना RNase-मुक्त हाताळणी गृहीत धरलेली असते.

बंधन कसे होते, आणि ते कुठे दिशाभूल करते

उपयुक्त स्पष्टीकरणाचे तीन भाग आहेत. प्रथम, धनभारित वलय-प्रणाली ऋणभारित फॉस्फेट साखळी-आधाराकडे आकर्षित होते. कमी क्षार-सांद्रतेत हा विद्युत् स्थैतिक घटक प्रमुख असल्याचे वर्णपटशास्त्रीय अभ्यास दर्शवतात. त्याच वेळी, प्रतिमाननिर्मिती आणि रेणुगतिकीच्या अभ्यासांमध्ये द्विसूत्री DNA साठी अंतःस्थापन आणि लहान खाचेत बंधन हे स्थिर प्रकार आढळतात; याचा सारांश मेथिलीन ब्लूच्या DNA बंधनावरील वर्णपटशास्त्रीय अभ्यासात दिलेला आहे. दुसरे म्हणजे, GC कडे काही प्रमाणात प्राधान्य दिसते. मेथिलीन ब्लूच्या अंतःस्थापन-प्राधान्यावरील अभ्यासात प्रतिमाननिर्मितीत CpG आणि GpC टप्प्यांना प्राधान्य दिसते, तर प्रयोगांमध्ये GC-समृद्ध द्विसूत्रांशी प्राधान्याने संलग्नता नोंदवली जाते; तरी AT द्विसूत्रेही रंगद्रव्याला बांधतात. नियमित रंजन हे अनुक्रम-विशिष्ट नसते. तिसरे म्हणजे, एकसूत्री DNA आणि RNA यांचे बंधन मुख्यतः विद्युत् स्थैतिक परस्परक्रिया आणि उपलब्ध क्षारक व द्विसूत्री भागांसोबतच्या स्टॅकिंगमधून होते. त्यामुळे रंजनाची तीव्रता लांबी, अनुक्रम आणि द्वितीयक संरचनेनुसार बदलते.

यातून दोन परिणाम समोर येतात. बंधन असहसंयुजी असल्यामुळे रंगद्रव्य धुतल्यावर निघून जाते. जाणूनबुजून स्थिरीकरण केले नाही तर पॉलीअॅक्रिलामाइडमधील पट्टे लवकर फिकट होतात. नेहमीचे रंजन तात्पुरते असल्यामुळेच कायमस्वरूपी स्थिरीकरणाची स्वतंत्र पद्धत उपलब्ध आहे, जिचे वर्णन PAGE जेलसाठी Soto आणि Draper यांनी केले आहे. रंगद्रव्य प्रकाशसंवेदक असल्यामुळे, ऑक्सिजनच्या उपस्थितीत रंगवलेल्या DNA वर दीर्घकाळ तीव्र प्रकाश पडल्यास ग्वानिनचे ऑक्सिडीकरण होऊ शकते आणि अखेरीस सूत्रांमध्ये खंड पडू शकतात. ही यंत्रणा मेथिलीन ब्लूद्वारे संवेदित ग्वानिन ऑक्सिडीकरणाच्या अभ्यासात सविस्तर दिलेली आहे. पांढऱ्या प्रकाशात थोडा वेळ निरीक्षण केल्याने पारंपरिक एथिडियम ब्रोमाइड कार्यपद्धतीतील सर्वज्ञात UV नुकसान टाळता येते, आणि पुढील वापरासाठी DNA मिळवताना हा फायदा खरोखर उपयोगी पडतो. दृश्यमान प्रकाश तुलनेने सौम्य असतो, पण पूर्णपणे निरुपद्रवी नसतो. DNA चे क्लोनिंग करायचे असल्यास प्रकाशाचा संपर्क कमी वेळापुरता ठेवा. या सावधगिरीमागील व्यापक प्रकाशरसायनशास्त्रासाठी मेथिलीन ब्लूच्या प्रकाशरसायनशास्त्रातील दोन मार्ग पाहा. ऑक्सिडीकृत रूप बंधन का करते आणि अपचयित रूप का करत नाही हे स्पष्ट करणाऱ्या रेडॉक्स जोडी आणि विद्युत् भार-अवस्थांसाठी मेथिलीन ब्लूच्या संरचना आणि गुणधर्मांचे रसायनशास्त्र पाहा.

पहिले काम: जेलच्या आत रंजन

जेल रंजन एका प्रश्नाचे उत्तर देते: या पट्ट्यात डोळ्यांनी दिसण्याइतके न्यूक्लिक आम्ल आहे का? अगरोजमधील द्विसूत्री DNA हा सर्वांत चांगला अभ्यासलेला प्रकार आहे. Flores आणि सहकाऱ्यांच्या मूळ मेथिलीन ब्लू जेल पद्धतीने 1 percent अगरोजवर 0.02 percent जलद कार्यपद्धती प्रमाणित केली आणि त्यानंतर DNA यशस्वीपणे मिळवून त्याचे क्लोनिंग करता येते हे दाखवले. पुरवठादाराची हीच कार्यपद्धती IBI Scientific च्या मेथिलीन ब्लू उत्पादन पानावर दिलेली आहे. त्यावर 0.04 percent पडदा पद्धत आणि जलद जेल पद्धत शेजारीशेजारी नमूद आहेत.

प्रत्यक्ष कार्यपद्धती:

1. नेहमीप्रमाणे जेल चालवा. बदललेल्या पद्धतीसाठी स्थानांतरण किंवा विभेदन प्रमाणित केलेले नसेल तर विद्युत् अपघटनादरम्यान नव्हे, तर त्यानंतर रंजन करा.
2. आसुत पाण्यातील 0.02 percent w/v मेथिलीन ब्लूमध्ये सुमारे 15 minutes बुडवून ठेवा आणि हलकेच हालवा.
3. एकूण सुमारे 15 minutes, पाणी अनेकदा बदलून रंग काढा. माध्यमाची पार्श्वभूमी फिकी होऊन पट्टे स्पष्ट दिसेपर्यंत हे करा.
4. पांढऱ्या प्रकाशाच्या प्रकाशकावर त्वरित छायाचित्र घ्या.

अगरोज आणि पॉलीअॅक्रिलामाइड वेगवेगळ्या प्रकारे वागतात. अगरोजच्या माध्यमात रंगद्रव्य टिकून राहते, त्यामुळे रंग काढण्याचा टप्पा मंद असतो. पातळ पॉलीअॅक्रिलामाइड जेल लवकर रंगतात, पण त्यातील रंगद्रव्यही लवकर निघून जाते. पुढील वापरासाठी पट्टे कापून काढताना हे मदत करते, पण दीर्घकालीन नोंदींसाठी अडचण निर्माण करते. Current Protocols शैलीतील प्रस्थापित PAGE पद्धतींनुसार, पॉलीअॅक्रिलामाइडमधील कृत्रिम ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड्स त्याच 0.02 percent पद्धतीने आणि वारंवार पाण्याने धुवून 20 ते 30 minutes मध्ये शोधता येतात. पुढील वापरासाठी ऑलिगो तयार करताना, विरळ TBE मध्ये जवळपास 0.0002 percent असलेली अतिविरळ द्रावणे अनेक तास वापरल्याचे अहवाल आहेत; मात्र यासाठीचा पुराव्याचा आधार कमी मजबूत आहे.

DNA आणि RNA यांतील फरक महत्त्वाचा असतो. द्विसूत्री DNA मध्ये सर्वांत मजबूत, संरचनेवर आधारित बंधन दिसते. RNA आणि एकसूत्री DNA यांचे रंजन होते, पण ते कमकुवत आणि कमी अंदाजयोग्य असते. फॉर्माल्डिहाइड अगरोज RNA जेलसाठी बहुतेक प्रयोगशाळा जेलमधील निळे रंजन टाळतात आणि प्रथम RNA पडद्यावर स्थानांतरित करतात, त्यानंतर तिथे रंजन करतात. या बदलामुळे जेलमधील कमकुवत संकेताऐवजी पडद्यावर अधिक स्पष्ट संकेत आणि नमुना भरण्याची नोंद मिळते.

दुसरे काम: पडद्यांवर रंजन

पडदा रंजन वेगळ्या प्रश्नाचे उत्तर देते: स्थानांतरण यशस्वी झाले का, आणि लेन परस्पर तुलना करण्याजोग्या आहेत का? Herrin आणि Schmidt यांचे उत्क्रमणीय Northern ब्लॉट रंजन हा याचा पारंपरिक उपयोग आहे. मूळ पद्धतीत pH 5.0 असलेल्या 50 mM सोडियम अॅसिटेटमध्ये 0.04 percent रंगद्रव्याने 2 ते 3 minutes रंजन करून पाण्याने धुतले जाते. संकरणापूर्वी SSPE मधील विरळ SDS ने हे रंगद्रव्य काढता येते.

मोठ्या प्रमाणावर वापरली जाणारी आधुनिक पद्धत पुढीलप्रमाणे आहे:

1. RNA किंवा विकृतित DNA नायलॉन किंवा नायट्रोसेल्युलोजवर स्थानांतरित करा. रंजनादरम्यान नमुना निघून जाऊ नये म्हणून नंतर UV क्रॉसलिंकिंग किंवा उष्णतेने स्थिरीकरण करा.
2. ऐच्छिक, पण नेहमी केले जाणारे: पडदा 5 percent अॅसिटिक आम्लात सुमारे 15 minutes भिजवा.
3. pH 5.2 च्या जवळ असलेल्या 0.3 ते 0.5 M सोडियम अॅसिटेटमधील 0.02 ते 0.04 percent मेथिलीन ब्लूने 5 ते 10 minutes रंजन करा.
4. पाण्याने धुवा आणि 5 ते 15 minutes रंग काढा, नोंद घ्या, आणि संकरणापूर्वी उरलेले रंगद्रव्य काढून टाका.

Northern कामात धनभारित नायलॉनचा सर्वाधिक वापर होतो. अॅसिटिक आम्ल आणि अॅसिटेटची हीच कार्यपद्धती नायट्रोसेल्युलोजवरही चालते. स्थानांतरणाची खात्री करण्यासाठी, 28S आणि 18S पट्ट्यांची तुलना करण्यासाठी (किंवा जिवाणूंच्या RNA साठी 23S आणि 16S), लॅडर आणि मानकांच्या जागा चिन्हांकित करण्यासाठी, तसेच एकूण RNA सामान्यीकरणाची ढोबळ नोंद ठेवण्यासाठी प्रतिमा वापरली जाते. नमुना भरण्याची पडताळणी करण्यासाठी प्रकाशित Northern पद्धती रंगवलेल्या रायबोसोमल पट्ट्यांचे परिमाणन करतात. यात सामान्यीकरणासाठी मेथिलीन ब्लूने रंगवलेले रायबोसोमल पट्टे वापरणाऱ्या दुग्धशास्त्रीय संशोधनाचाही समावेश आहे. Southern पडदेही त्याच प्रकारे पाहता येतात; मात्र Northern मध्ये नमुना भरणे आणि स्थानांतरण तपासण्यासाठी या रंगद्रव्याचा वापर अधिक प्रस्थापित आहे. तसेच Southern DNA चे स्थानांतरणापूर्वी विकृतीकरण केले जाते, त्यामुळे जेलसाठीची संवेदनशीलतेची आकडेवारी येथे लागू होत नाही.

शोधमर्यादा आणि पार्श्वभूमी: निळे रंगद्रव्य कुठे कमी पडते

खालील तुलना जाणूनबुजून अंदाजाधारित ठेवली आहे. रंगद्रव्याची कामगिरी जेलची टक्केवारी, पट्ट्याची रुंदी, प्रकाशीय साधने आणि रंग काढण्याच्या प्रक्रियेतील काटेकोरपणा यांवर अवलंबून असते. प्रत्येक आकडा निश्चित तपशील म्हणून नव्हे, तर परिमाणक्रमाचा अंदाज म्हणून घ्या.

मर्यादित संकेत वापरण्याजोगा आहे की नाही हे पार्श्वभूमीचे नियंत्रण ठरवते. मुक्त रंगद्रव्याचा रंग तीव्र असतो, त्यामुळे बांधलेले रंगद्रव्य न काढता न बांधलेले रंगद्रव्य काढल्याने विरोधाभास मिळतो. अधिक सांद्र रंगद्रव्याने क्वचितच संवेदनशीलता वाढते. मुख्यतः रंग काढण्यासाठी लागणारा वेळ वाढतो. वापरणार असलेल्या नेमक्या जेल, पडदा आणि कॅमेऱ्यावर विरलन-मालिका तपासा आणि एकात्मिक घनता भरलेल्या प्रमाणाच्या प्रमाणात राहते तोच पट्टा वापरा. मेथिलीन ब्लू नमुना भरण्याच्या अर्धपरिमाणात्मक सामान्यीकरणासाठी उपयुक्त आहे. मात्र हा विस्तृत गतिशील श्रेणी असलेला परिमाणात्मक परीक्षण प्रकार नाही, कारण पडद्याची क्षमता, स्थानांतरण कार्यक्षमता, संपृक्तता आणि रंग काढण्याचे प्रमाण लेननुसार बदलते.

सुसंगततेच्या मर्यादा: रंजनानंतर काय टिकते

निळ्या रंजनानंतर क्लोनिंग करता येते हे दाखवले गेले आहे. Flores आणि सहकाऱ्यांनी रंगवलेले अगरोज पट्टे कापून काढले, त्यांतून DNA मिळवला, त्याचे लिगेशन आणि ट्रान्सफॉर्मेशन केले, आणि UV सह एथिडियम ब्रोमाइड वापरल्यानंतरच्या तुलनेत अधिक चांगले क्लोनिंग नोंदवले. याचे संभाव्य कारण प्रकाशामुळे होणारे कमी नुकसान हे आहे, रंगद्रव्याचा स्वतःचा काही फायदा नव्हे. पांढऱ्या प्रकाशाचा संपर्क कमी वेळापुरता ठेवा आणि मिळवलेल्या DNA चे नेहमीच्या जेल निष्कर्षण पद्धतीने शुद्धीकरण करा.

PCR आणि अनुक्रमणासाठी पुरावा कमी आहे. उरलेले रंगद्रव्य न्यूक्लिक आम्लांना बांधते, त्यामुळे एन्झाइम-आधारित टप्प्यांपूर्वी रंग काढा आणि शुद्धीकरण करा. निळ्या जेलमधून योग्य प्रकारे शुद्ध केलेला DNA काम करेल अशी अपेक्षा आहे; मात्र थेट पुढे नेलेल्या अवशिष्ट रंगद्रव्याची विविध पॉलिमरेज आणि अनुक्रमण रसायनक्रियांमधील सहनक्षमता नीट परिमाणित केलेली नाही. ती गृहीत धरू नका.

क्रम काटेकोरपणे पाळल्यास ब्लॉट संकरण सुसंगत असते: स्थानांतरण, स्थिरीकरण, रंजन, नोंद घेणे, रंग काढणे, संकरण. हाच Herrin आणि Schmidt यांचा आराखडा आहे. स्थानांतरणापूर्वी रंजन करणे किंवा रंग काढण्याचा टप्पा वगळणे ही वेगळी पद्धत ठरते आणि तिचे स्वतंत्र प्रमाणीकरण आवश्यक असते. रंगद्रव्य काढल्यानंतर नेहमीप्रमाणे प्रोब काढणे आणि पुन्हा प्रोब लावणे करता येते. याच रंगद्रव्य-कुटुंबाने पेशींच्या पातळीवर रंजन करण्यासाठी, तसेच स्थिरीकृत पटलांसाठीचे तर्क जिवंत पेशींच्या पद्धतींना का लागू होत नाहीत हे समजून घेण्यासाठी सूक्ष्मदर्शकीय रंजनाचा अॅटलस पाहा.

कायमस्वरूपी स्थिरीकरणाची पद्धत टाळल्यास, पुढील वापरासाठीच्या अगरोजमधील आणि निळ्या रंजनाने शोधलेल्या PAGE ऑलिगोंमधील पट्टे कापून काढता येतात. उत्क्रमणीय बंधन करणाऱ्या रंगद्रव्यासाठी रंग काढल्यानंतर इलेक्ट्रोएल्यूशन करणे रासायनिकदृष्ट्या शक्य वाटते, पण मेथिलीन ब्लूसाठी विशिष्ट असलेली नियंत्रित प्राप्तीची आकडेवारी कमी आहे. एल्यूशननंतर क्षार काढा किंवा अवक्षेपण करा.

वारंवार दिसणाऱ्या अडचणी

जेलमधील फिकट पट्टे सहसा वर्णमितीय रंजनासाठी वस्तुमान अपुरे असल्याचे दर्शवतात, विशेषतः लहान एकसूत्री किंवा RNA लक्ष्यांसाठी. अधिक नमुना भरा, ताजे रंगद्रव्य वापरा, सांद्रता वाढवण्यापूर्वी रंजनाचा वेळ वाढवा आणि रंग काढणे लवकर थांबवा. कोणताही विरोधाभास नसलेला पूर्ण निळा जेल सहसा अतिरंजन किंवा पाणी पुरेशा वेळा न बदलल्याचे दर्शवतो. PAGE पट्टे फिकट होणे ही अपेक्षित रसायनक्रिया आहे, रंजन अयशस्वी झाल्याचे चिन्ह नाही. लगेच छायाचित्र घ्या. पडद्यावरील असमान पार्श्वभूमी घड्या, बुडबुडे, बोटांचे ठसे, असमान हालचाल किंवा ठिकठिकाणी वेगवेगळे स्थानांतरण यांकडे निर्देश करते. संकरण नियंत्रणाशिवाय याचा अर्थ असमान नमुना भरणे असा लावू नका. पसरट आणि कमकुवत रायबोसोमल पट्ट्यांची रचना विघटन दर्शवू शकते; पण तिचे कारण अपूर्ण स्थानांतरण, अत्यल्प एकूण RNA (सामान्यतः लेनमध्ये काही ते दहांच्या पटीत मायक्रोग्रॅम असतात) किंवा अतिप्रमाणात रंग काढणे हेही असू शकते. रंगद्रव्य विपुल प्रमाणातील रायबोसोमल RNA दाखवते. ते एखादा विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्ट दाखवत नाही. ते काम प्रोबचे असते.

अतिशयोक्त दावे न करता सुरक्षितता आणि हाताळणी

मेथिलीन ब्लूची हाताळणी एथिडियम ब्रोमाइडपेक्षा सोपी असली तरी ते निरुपद्रवी नाही. MilliporeSigma च्या सध्याच्या सुरक्षा माहितीपत्रकात या रंगद्रव्याचे वर्गीकरण तीव्र तोंडावाटे विषारीपणा Category 4, गिळल्यास हानिकारक, असे केलेले आहे. Sigma-Aldrich च्या मेथिलीन ब्लू SDS नुसार त्याची विल्हेवाट मान्यताप्राप्त कचरा व्यवस्थापन मार्गाने लावावी. एथिडियम ब्रोमाइडसाठी जनुकविषारीपणाविषयी अधिक तीव्र इशारे आहेत, ज्यांत त्याच्या Sigma-Aldrich एथिडियम ब्रोमाइड SDS मधील जननपेशींवरील संशयित परिणामांचाही समावेश आहे. Thermo Fisher च्या न्यूक्लिक आम्ल रंजन मार्गदर्शकात नमूद केल्याप्रमाणे, त्याचे जेल आणि द्रावणे सामान्यतः धोकादायक रासायनिक कचरा म्हणून वेगळी ठेवली जातात. दोन्हीसाठी SDS आणि संस्थेचे नियम पाळा. कोरडे रंगद्रव्य घट्ट बंद करून कोरडे ठेवा, कार्यपद्धती परवानगी देते तेव्हाच वापरातील रंजन द्रावण पुन्हा वापरा, रंगवलेले पडदे फिल्टर कागदांच्या मध्ये कोरडे साठवा आणि पट्टे विसरणाने पसरून जाण्यापूर्वी जेलची छायाचित्रे घ्या.

प्रयोगशाळेतील हे सूत्र लक्षात ठेवा. जेलमध्ये जास्त नमुना भरल्यावर पांढऱ्या प्रकाशात तो दिसतो का हे तपासले जाते. प्रोबने संवेदनशील काम करण्यापूर्वी पडद्यांवर स्थानांतरण आणि नमुना भरणे तपासले जाते. एकच रंगद्रव्य दोन्ही कामांसाठी उपयोगी पडते—मर्यादित संवेदनशीलता, उत्क्रमणीय बंधन आणि प्रक्रियांचा काटेकोर क्रम यांसह.