मिथिलीन ब्लू आणि दाहाशी संबंधित संकेतप्रक्रिया: इन्फ्लॅमासोम, IL-6 आणि STAT3

समजा, तीन प्रयोगशाळा एकच निळे संयुग दाहरोधी असल्याचे नोंदवतात. एक प्रयोगशाळा मॅक्रोफेजमधून कमी IL-1beta निघत असल्याचे दाखवते. दुसरी त्याच प्रकारच्या पेशींमध्ये iNOS विकर कमी असल्याचे दाखवते. तिसरी रक्तात कमी IL-6 आणि मेंदूत कमी STAT3 सक्रियता असल्याचे दाखवते. या तिन्ही निष्कर्षांना एकाच दाव्यात एकत्र करण्याचा मोह होतो. पण असे एकत्र केल्याने प्रत्यक्ष निष्कर्ष झाकला जातो.

प्रत्येक निष्कर्ष एका वेगळ्या संकेतप्रक्रियेशी संबंधित आहे; तिचा स्वतःचा उद्दीपक, जुळणीचा टप्पा आणि मोजला जाणारा निर्देशक असतो. मिथिलीन ब्लू प्रत्येक प्रक्रियेवर वेगळ्या बिंदूवर परिणाम करते. यांपैकी कोणत्याही परिणामामुळे आरोग्यविषयक निष्पत्ती सुधारते का, हा स्वतंत्र प्रश्न आहे. त्याची चर्चा आमच्या मिथिलीन ब्लू आणि दाह यांवरील आढाव्यात केली आहे. या पानाचा भर संकेतमार्गिकांवरच आहे.

मार्गिका 1: इन्फ्लॅमासोमची जुळणी आणि कॅस्पेस-1

इन्फ्लॅमासोम ही मायलॉइड पेशीच्या आत गरजेनुसार तयार होणारी प्रथिनांची आधाररचना आहे. तिचे घटक म्हणजे एक संवेदक, ASC नावाचे जुळवणारे प्रथिन आणि कॅस्पेस-1 नावाचा कार्यकारी विकर. जुळणी झाल्यानंतर कॅस्पेस-1 हे pro-IL-1beta आणि pro-IL-18 कापून त्यांची स्रवणयोग्य रूपे तयार करते आणि पायरोप्टोसिस सुरू करू शकते; हा दाहकारी पेशीमृत्यूचा एक प्रकार आहे. संवेदकावरून इन्फ्लॅमासोमचा प्रकार ठरतो: NLRP3 स्फटिकांना आणि नायजेरिसिन व ATP यांसारख्या छिद्र निर्माण करणाऱ्या विषद्रव्यांना प्रतिसाद देतो, NLRC4 जीवाणूंच्या फ्लॅजेलिनला प्रतिसाद देतो, AIM2 पेशीद्रवातील दुहेरी साखळीच्या DNA ला प्रतिसाद देतो, तर अपारंपरिक मार्गिका पेशीअंतर्गत लिपोपॉलिसॅकराइडला प्रतिसाद देते.

सक्रियतेसाठी दोन संकेत आवश्यक असतात. पहिला संकेत म्हणजे पूर्वतयारी: टोल-सदृश रिसेप्टरचा लिगँड NLRP3 आणि pro-IL-1beta यांच्या NF-kB वर अवलंबून असलेल्या प्रतिलेखनाला चालना देतो, जेणेकरून आवश्यक घटक उपलब्ध होतात. दुसरा संकेत म्हणजे जुळणी: दुसऱ्या उद्दीपकामुळे ASC चे ऑलिगोमर तयार होऊन ठिपक्यासारखे समूह बनतात, कॅस्पेस-1 कापले जाऊन त्याचा p20 खंड तयार होतो आणि परिपक्व IL-1beta p17 मुक्त होते. माइटोकॉन्ड्रियातील प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रकार आणि स्फटिकांचे ग्रहण हे NLRP3 च्या दुसऱ्या संकेताला हातभार लावणारे ज्ञात घटक आहेत.

इन्फ्लॅमासोमच्या व्यापक अवरोधनावरील 2017 मधील मॅक्रोफेज अभ्यासात दोन्ही संकेतांच्या टप्प्यांवर मिथिलीन ब्लूची चाचणी केली गेली. लिपोपॉलिसॅकराइडने पूर्वतयारी केलेल्या उंदरांच्या अस्थिमज्जेतील मॅक्रोफेजमध्ये नायजेरिसिन, ATP आणि मोनोसोडियम युरेट स्फटिक या प्रत्येकामुळे IL-1beta व कॅस्पेस-1 मुक्त झाले आणि ASC चे ठिपक्यासारखे समूह तयार झाले. 20 ते 200 micromolar मिथिलीन ब्लूमुळे पेशींना न मारता हे तिन्ही परिणाम मात्रेनुसार कमी झाले. NLRC4 साठी फ्लॅजेलिन आणि Salmonella, AIM2 साठी दुहेरी साखळीचा DNA आणि Listeria, तसेच अपारंपरिक मार्गिकेसाठी पेशींमध्ये ट्रान्सफेक्शनद्वारे पोहोचवलेले लिपोपॉलिसॅकराइड किंवा जिवंत E. coli वापरल्यावरही हाच नमुना दिसला. संयुगाने एकट्याने ही मुक्तता सुरू केली नाही आणि नियंत्रण प्लेटांवर कोणताही जीवाणूरोधी परिणाम दिसला नाही. त्यामुळे हा निष्कर्ष यजमानाच्या प्रतिसादाशी संबंधित ठरतो.

मार्गिकेच्या आधीच्या टप्प्यांवर तीन परिणाम मोजले गेले. रोटेनोनमुळे निर्माण झालेले माइटोकॉन्ड्रियातील सुपरऑक्साइड मिथिलीन ब्लूमुळे कमी झाले आणि त्यासोबत रोटेनोनमुळे होणारी IL-1beta ची मुक्तताही कमी झाली. प्रतिदीप्त मण्यांचे ग्रहण कमी झाले; स्फटिकांची ओळख होण्यापूर्वी भक्षणक्रिया कमी झाल्याशी हे सुसंगत होते. दोन NF-kB स्थळे असलेल्या NLRP3 प्रमोटरद्वारे नियंत्रित रिपोर्टरची सक्रियता मिथिलीन ब्लूमुळे कमी झाली, तर ही स्थळे नसलेल्या संक्षिप्त प्रमोटरने प्रतिसाद दिला नाही. पेशीविरहित चाचणी नळीत मिथिलीन ब्लूने पुनःसंयोजित मानवी कॅस्पेस-1 ची सक्रियताही थेट कमी केली. संयुग केवळ पूर्वतयारीच्या टप्प्यावर किंवा केवळ सक्रियतेच्या टप्प्यावर घातले, तरी IL-1beta, IL-18 आणि कॅस्पेस-1 ची मुक्तता कमी झाली. त्यामुळे दोन्ही टप्पे यात सहभागी आहेत.

उंदरांवरील चाचण्यांमध्येही ही निवडकता दिसली. लिपोपॉलिसॅकराइडच्या प्राणघातक मात्रेमुळे नियंत्रण गटातील उंदीर काही तासांत मरण पावले, तर मिथिलीन ब्लूमुळे जगण्याचे प्रमाण सुधारले; उदरपोकळीतील IL-1beta कमी झाले, पण त्याच द्रवातील IL-6 कमी झाले नाही. Listeria मुळे होणाऱ्या उदरावरणदाहाच्या प्रतिमानात उदरपोकळीतील IL-1beta कमी झाले, तर एकूण पेशीसंख्या बदलली नाही. चारही इन्फ्लॅमासोम प्रकारांमध्ये मानवी THP-1 मोनोसाइट्सचे वर्तन उंदरांच्या मॅक्रोफेजसारखे होते. इन्फ्लॅमासोमचा निष्कर्ष IL-1beta आणि IL-18 ची परिपक्वता स्पष्ट करतो, प्रत्येक साइटोकाइनचा परिणाम नव्हे. म्हणूनच मायक्रोग्लिया आणि ॲस्ट्रोसाइटवरील प्रयोगांमध्ये मेंदूतील प्रतिरक्षा पेशींचा आकार हा आधाररचनेच्या जुळणीपेक्षा वेगळ्या प्रश्नाचे उत्तर देतो.

मार्गिका 2: NF-kB आणि STAT1 च्या बंधनाद्वारे iNOS प्रतिलेखन

प्रेरणीय नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेज, म्हणजेच iNOS, विश्रांतीच्या स्थितीत जवळजवळ अनुपस्थित असते आणि गरजेनुसार त्याचे प्रतिलेखन होते. लिपोपॉलिसॅकराइड मुख्यतः IkB-alpha चे विघटन, त्यानंतर NF-kB चे फॉस्फोरिलीकरण आणि केंद्रकातील प्रवेश यांद्वारे या प्रक्रियेला चालना देते. इंटरफेरॉन-गॅमा मुख्यतः जॅनस काइनेजद्वारे STAT1 चे फॉस्फोरिलीकरण आणि त्यानंतर STAT1 चा केंद्रकातील प्रवेश यांद्वारे तिला चालना देतो. त्यानंतर प्रत्येक घटक iNOS प्रमोटरवरील स्वतःच्या स्थळाला बांधतो. विकराची सक्रियता आणि जनुकाचे प्रेरण हे स्वतंत्र नियंत्रणबिंदू आहेत; एखादे औषध यांपैकी एका किंवा दोन्ही बिंदूंवर कार्य करू शकते.

मॅक्रोफेज आणि एंडोटॉक्सिमिया असलेल्या उंदरांमध्ये iNOS प्रेरणावरील 2015 मधील अभ्यासाने हा परिणाम संदेशाच्या पातळीवर असल्याचे दाखवले. RAW 264.7 पेशी आणि उंदरांच्या प्राथमिक मॅक्रोफेजमध्ये लिपोपॉलिसॅकराइड, इंटरफेरॉन-गॅमा किंवा दोन्ही देण्याच्या 30 मिनिटे आधी दिलेल्या 1 micromolar मिथिलीन ब्लूमुळे 8 ते 24 तासांच्या कालावधीत iNOS प्रथिन आणि mRNA कमी झाले. संवर्धन माध्यमातील नायट्राइटही कमी झाले आणि पेशींच्या जिवंत राहण्याच्या क्षमतेत घट झाली नाही. 25 mg per kg लिपोपॉलिसॅकराइड दिलेल्या उंदरांमध्ये एक तास आधी दिलेल्या 5 mg per kg च्या एकाच मात्रेमुळे फुफ्फुस, यकृत आणि हृदयातील iNOS प्रथिन आणि mRNA कमी झाले.

विशेष लक्षवेधी बाब म्हणजे कोणत्या गोष्टी बदलल्या नाहीत. IkB-alpha चे विघटन, NF-kB चे फॉस्फोरिलीकरण, STAT1 चे फॉस्फोरिलीकरण आणि दोन्ही घटकांचे केंद्रकातील संचयन अबाधित राहिले. अडथळा त्यानंतरच्या टप्प्यावर आला: केंद्रकातील अर्कांमध्ये लिपोपॉलिसॅकराइडनंतर NF-kB चे त्याच्या DNA घटकाशी बंधन कमी दिसले आणि इंटरफेरॉन-गॅमानंतर STAT1 चे बंधन कमी दिसले. क्रोमॅटिन इम्युनोप्रेसिपिटेशनने पेशींच्या आत iNOS प्रमोटरवर दोन्ही घटकांची उपस्थिती कमी असल्याची पुष्टी केली. ट्यूमर नेक्रोसिस फॅक्टर अल्फाही कमी झाला; त्याचा प्रमोटरही NF-kB वापरतो. हे घटक सक्रिय झाले आणि केंद्रकात पोहोचले, पण त्यांच्या लक्ष्य DNA शी त्यांचे बंधन कमकुवत झाले.

मार्गिका 1 शी असलेला फरक लक्षात घ्या. येथे घटकाचे DNA शी बंधन महत्त्वाचे आहे, STAT3 ऐवजी STAT1 वापरला जातो आणि ASC चे ठिपक्यासारखे समूह व कॅस्पेस-1 चे खंड यांऐवजी mRNA, प्रथिन आणि नायट्राइट मोजले जातात. आमचा पेशी प्रतिमानांतील मिथिलीन ब्लूच्या लक्ष्यांचा नकाशा प्रतिलेखनाची ही पातळी थेट विकर आणि माइटोकॉन्ड्रियाशी संबंधित मोजमापांपासून वेगळी ठेवतो.

मार्गिका 3: रक्तरसातील IL-6 आणि ऊतींमधील STAT3 सक्रियता

IL-6 हे gp130 रिसेप्टर परिवारामार्फत जॅनस काइनेज ते STAT3 संकेतसाखळीत संकेत पाठवते. फॉस्फोरिलीकरण झालेले STAT3 द्विमेर तयार करते, केंद्रकात प्रवेश करते आणि दाहकारी कार्यक्रमांना चालना देते. त्याच वेळी IL-6 हे स्वतः NF-kB चे लक्ष्य आहे. त्यामुळे दोन्ही मिळून एक प्रतिसादचक्र तयार करतात, ज्याला अनेकदा IL-6 ते STAT3 अक्ष म्हटले जाते. नेहमीच्या मोजमापांमध्ये आधीच्या टप्प्यावर रक्तरसातील IL-6, फॉस्फोरिलीकरण झालेल्या STAT3 चे एकूण STAT3 शी गुणोत्तर आणि पुढील टप्प्यांवरील iNOS व COX2 यांसारखे कार्यकारी विकर यांचा समावेश होतो.

लिपोपॉलिसॅकराइडनंतर IL-6 आणि STAT3 यांवरील 2023 मधील उंदरांच्या अभ्यासात विविध शारीरिक विभागांमध्ये या अक्षाचे मोजमाप केले गेले. नर C57BL/6 उंदरांना तीन दिवस दररोज 1 mg per kg लिपोपॉलिसॅकराइड दिले गेले आणि प्रत्येक मात्रेनंतर 30 मिनिटांनी 5 किंवा 10 mg per kg मिथिलीन ब्लू दिले गेले. तिसऱ्या दिवशी केवळ लिपोपॉलिसॅकराइड दिलेल्या गटाच्या तुलनेत मिथिलीन ब्लूच्या दोन्ही गटांमध्ये रक्तरसातील IL-6 कमी होते, तर मोजलेल्या इतर बहुतेक साइटोकाइन्समध्ये उपचारामुळे बदल झाला नाही. कॉर्टेक्स, हिप्पोकॅम्पस आणि कानाच्या त्वचेत फॉस्फोरिलीकरण झालेल्या STAT3 चे एकूण STAT3 शी गुणोत्तर कमी होते. त्यासोबत Iba-1 मायक्रोग्लियल रंगांकन, iNOS आणि COX2 कमी होते, तसेच वजनातील घट काही प्रमाणात कमी झाली होती.

येथे दोन सावधगिरीचे मुद्दे महत्त्वाचे आहेत. रक्तरसातील कमी IL-6 आणि ऊतींमधील कमी STAT3 फॉस्फोरिलीकरण हे अक्षातील बदलाशी सुसंगत आहेत, पण ते प्राथमिक परिणामबिंदू निश्चित करत नाहीत. कारण आधीच्या टप्प्यावरील साइटोकाइन कमी होणे, रिसेप्टरची संकेतप्रक्रिया कमी होणे किंवा फॉस्फेटेज सक्रियतेत बदल होणे यांपैकी कोणत्याही कारणाने तेच गुणोत्तर दिसू शकते. तसेच तीव्र प्रायोगिक आव्हानाच्या तीन दिवसांत मोजलेले वजन हा संपूर्ण प्राण्याचा निर्देशक आहे; तो लक्षणांचा किंवा रोगशमनाचा गुणांक नाही. संकेतप्रक्रियेचा निष्कर्ष उपचाराचा दावा न बनवता, तो ब्लॉटमधील मोजमापापलीकडचा संदर्भ देतो. माइटोकॉन्ड्रियातील रेडॉक्स प्रक्रियांचे स्वतंत्र रसायनशास्त्र या साइटोकाइनविषयक प्रक्रियेसोबत समांतर चालते आणि ते तिच्यात मिसळू नये.

मार्गिकांची तुलना: हस्तक्षेपबिंदू आणि मोजलेले निर्देशक

ही सारणी एका निष्कर्षावरून दुसरा निष्कर्ष काढण्याच्या तीन अवैध प्रकारांना रोखते. ASC च्या ठिपक्यासारख्या समूहांचा निष्कर्ष STAT3 चा निष्कर्ष सिद्ध करत नाही. STAT1 च्या iNOS प्रमोटरशी बंधनाचा निष्कर्ष STAT3 चा निष्कर्ष सिद्ध करत नाही, जरी दोन्ही प्रथिने STAT परिवारातील असली तरीही. रक्तरसातील IL-6 चा निष्कर्ष इन्फ्लॅमासोमची जुळणी कमी झाल्याचे सिद्ध करत नाही: उदरपोकळीतील प्रयोगात IL-1beta कमी झाले, पण IL-6 कमी झाले नाही. प्रत्येक ओळीसाठी तिचा स्वतःचा उद्दीपक आणि मोजमाप निर्देशक आवश्यक आहे. म्हणूनच मिथिलीन ब्लूवरील पेशी, प्राणी आणि वैद्यकीय अभ्यास वाचताना प्रत्येक दावा त्याच्या प्रत्यक्ष मोजलेल्या पातळीशी जुळवणे आवश्यक असते.

यांपैकी कोणतीही गोष्ट मानवांमधील मात्रानियोजन, सुरक्षितता किंवा लाभ स्थापित करत नाही. लिपोपॉलिसॅकराइड प्रतिमाने ही यंत्रणा तपासण्यासाठीची नियंत्रित उद्दीपक प्रतिमाने आहेत, दीर्घकालीन आजारांच्या प्रतिकृती नव्हेत. उद्दीपकासोबत मात्रा देऊन प्रेरित बदल रोखला जातो का हे तपासले जाते; आधीच स्थापित झालेला रोग उलटवला जातो का हे नव्हे. यंत्रणांचे हे विवेचन रुग्णांच्या निष्पत्तींपासून वेगळे ठेवा आणि कोणत्याही आरोग्यविषयक दाव्याचे मूल्यमापन त्यामागील रुग्णांवरील अभ्यासाच्या आधारे करा.