बायोफिल्मविरुद्ध मिथिलीन ब्लू: प्रकाशाने सक्रिय केलेल्या प्रयोगशाळा अभ्यासांत काय मोजले जाते

बायोफिल्म म्हणजे द्रवात तरंगणाऱ्या पेशींचा जमाव नव्हे. ती एक रचना असते: पृष्ठभागाला चिकटलेल्या पेशी, त्यांनी स्वतः तयार केलेल्या पॉलिसॅकराइड्स, प्रथिने आणि पेशीबाह्य DNA यांच्या मॅट्रिक्समध्ये सामावलेल्या असतात; बाहेरून आत जाताना ऑक्सिजन आणि पोषकद्रव्यांच्या प्रमाणात चढउतार असतात. या रचनेमुळेच द्रवात निलंबित जीवाणूंना काही मिनिटांत मारणारे संयुग, तेच जीव बायोफिल्मच्या स्वरूपात वाढलेले असताना निष्प्रभ ठरू शकते. मिथिलीन ब्लू आणि बायोफिल्मबाबतचा कोणताही दावा या रचनेच्या संदर्भातच समजून घ्यावा लागतो, कारण पेशींपर्यंत किती रंजक पोहोचतो आणि रंजकापर्यंत किती प्रकाश पोहोचतो, हे मॅट्रिक्स ठरवते.

या आढाव्यात नेमके तीन स्रोत समाविष्ट आहेत. एक पार्श्वभूमीसाठी आहे. दोन प्रयोगशाळेतील प्रयोग आहेत. या भूमिका वेगळ्या ठेवणे हीच संपूर्ण पद्धत आहे. त्यामुळे या विषयातील सर्वांत सामान्य चूक टाळता येते: प्रयोगशाळेतील पात्रात मिळालेला निष्कर्ष एखाद्या व्यक्तीतील संसर्गावर उपचार करण्याचा पुरावा असल्याप्रमाणे उद्धृत करणे.

पार्श्वभूमीचा स्रोत रसायनशास्त्राविषयी आहे, सूक्ष्मजीव मारण्याविषयी नाही

या तिघांपैकी सर्वांत जुना स्रोत म्हणजे 2005 मध्ये प्रकाशित झालेला फेनोथायझिनियम प्रकाशसंवेदीकारकांच्या विकासावरील वर्णनात्मक आढावा. त्यात मिथिलीन ब्लूचा प्रवास 19व्या शतकातील रंजकापासून कर्करोगाच्या प्रकाशगतिक उपचारांसाठी आणि नंतर प्रकाशगतिक सूक्ष्मजीवरोधी रासायनिक उपचारांसाठी अग्रणी संयुगापर्यंत मांडला आहे. त्याचे योगदान रचना आणि क्रियाशीलता यांतील संबंध स्पष्ट करण्यात आहे: क्रोमोफोरचे मिथिलीकरण केल्याने मेदस्नेहिता, सिंग्लेट ऑक्सिजनचे उत्पादन आणि प्रकाशाधारित जीवाणूनाशक सामर्थ्य वाढते, तर कमी सक्रिय ल्युको स्वरूपात होणारे अपचयन मंदावते. तो या संशोधनक्षेत्रातील अडचणही स्पष्टपणे सांगतो. बहुतेक अहवालांत प्रमाणित व्यावसायिक रंजक वापरले गेले होते आणि त्यांच्या व्युत्पन्न संयुगांचा विकास तुलनेने कमी झाला होता.

तुमच्या संकल्पनात्मक चौकटीतील क्रियाविधी समजून घेण्यासाठी हा आढावा वापरा: प्रकाश रंजकाला उत्तेजित करतो; त्रिक अवस्थेतून ऑक्सिजनशी प्रकार II ऊर्जा हस्तांतरणाद्वारे परस्परक्रिया होऊन सिंग्लेट ऑक्सिजन तयार होतो किंवा प्रकार I इलेक्ट्रॉन हस्तांतरणाद्वारे मुक्त मूलके तयार होतात. हा बहुघटक हल्ला असल्यामुळे पारंपरिक प्रतिकारयंत्रणा प्रकाशगतिक सूक्ष्मजीवनाशाविरुद्ध फारशा लागू पडत नाहीत. लॉग घट दर्शवण्यासाठी हा आढावा उद्धृत करू नका. त्यात अशी कोणतीही घट मोजलेली नाही. या क्रियाविधीमागील व्यापक प्रकाशरसायनशास्त्र प्रकाशगतिक उपचारांच्या पुराव्यांच्या संग्रहात मांडले आहे, आणि एखादा विशिष्ट दिवा ही प्रक्रिया घडवू शकतो का हे ठरवणारे तरंगलांबीचे नियम मिथिलीन ब्लू लाल प्रकाश कसा शोषतो या लेखात दिले आहेत.

बायोफिल्मवरील दोन प्रयोग, परिणामांच्या दोन भिन्न संकल्पना

दोन्ही प्रयोगात्मक संशोधनलेख तोंडातील बायोफिल्मवर 660 nm येथे मिथिलीन ब्लूची प्रकाशगतिक क्रिया तपासतात; याखेरीज त्यांच्यात जवळजवळ काहीच साम्य नाही. सूक्ष्मजीवसमुदाय वेगळे, वय वेगळे, रंजकाची सूत्रणे वेगळी, प्रकाशमात्रा वेगळ्या आणि सर्वांत महत्त्वाचे म्हणजे परिणाममापे वेगळी. हा फरकच या लेखाचा मुख्य मुद्दा आहे आणि खालील स्वतंत्र तुलनात्मक मांडणीचाही आधार आहे.

पहिला म्हणजे 2024 मध्ये प्रकाशित झालेला हिरडीखालील परिपक्व बहुप्रजाती बायोफिल्मचा प्रयोगशाळेतील अभ्यास. Calgary Biofilm Device मधील पॉलिस्टायरीन पिनांवर तेहतीस प्रजाती एकत्र वाढवण्यात आल्या. त्यांना अवायवीय परिस्थितीत पोषण देण्यात आले, 72 तासांनंतर संवर्धन माध्यम बदलण्यात आले आणि वाढ साधारण 7 दिवसांपर्यंत सुरू ठेवण्यात आली. उपचारात 0.01 टक्के मुक्त मिथिलीन ब्लू आणि 660 nm लाल LED वापरण्यात आला. LED ची किरणन क्षमता सुमारे 330 mW प्रति चौरस cm होती; 2 mm अंतरावरून 5 मिनिटे प्रकाश दिला गेला. यांचा गुणाकार केल्यास साधारण 99 J प्रति चौरस cm मिळते. प्रयोगाची रचना चार गटांसह स्पष्ट घटकाधारित होती: उपचार न केलेला नियंत्रण गट, प्रकाशाशिवाय रंजक, रंजकाशिवाय प्रकाश आणि रंजकासह प्रकाश.

दुसरा म्हणजे 2021 मध्ये प्रकाशित झालेला सुरुवातीला वसाहत करणाऱ्या तोंडातील बायोफिल्मचा प्रयोगशाळेतील अभ्यास. स्ट्रेप्टोकोकसच्या चार प्रजाती 1 टक्का सुक्रोज असलेल्या 96 कप्प्यांच्या प्लेटमध्ये 24 तास एकत्र वाढवण्यात आल्या. प्रकाशसंवेदीकारक म्हणून बीटा सायक्लोडेक्स्ट्रिन नॅनोकणांशी जोडलेले मिथिलीन ब्लू 4.65 मायक्रोमोलर या सांद्रतेत वापरण्यात आले. बायोफिल्मचे अडथळे पार करून रंजक पोहोचवण्यासाठी ही वहनाधारित सूत्रणा होती. दोन्ही प्रकाशस्रोत 660 nm लाल प्रकाशाचे होते आणि प्रत्येकी 90 सेकंद प्रकाश दिला गेला; पण प्रकाशमात्रांत मोठा फरक होता: लेसर गटासाठी 320 J प्रति चौरस cm आणि LED गटासाठी 8.1 J प्रति चौरस cm. नियंत्रण गटांत प्रकाशाशिवाय रंजक, केवळ लेसर, केवळ LED, नकारात्मक नियंत्रण म्हणून सलाईन आणि सूक्ष्मजीवरोधी तुलना-मानक म्हणून 0.2 टक्के क्लोरहेक्सिडीन यांचा समावेश होता.

7 दिवसांचा, 33 प्रजातींचा अवायवीय समुदाय आणि 24 तासांची, सुरुवातीला वसाहत करणाऱ्या 4 प्रजातींची बायोफिल्म या भिन्न मापनप्रणाली आहेत. पुढे दिलेल्या संख्यांची सरासरी काढता येत नाही.

प्रत्येक अभ्यासाने प्रत्यक्षात काय मोजले

परिपक्व बायोफिल्मच्या अभ्यासात TTC अपचयनाचे 485 nm येथे वाचन करून चयापचयात्मक क्रियाशीलता मोजली गेली. तसेच 33 प्रजातींसाठीच्या प्रोबच्या साहाय्याने चेकरबोर्ड DNA-DNA संकरीकरण वापरून जीवाणूंची संख्या मोजली गेली; त्याची शोधमर्यादा जवळपास 10,000 पेशी होती. जिवंत सूक्ष्मजीवांची संख्या मोजण्यासाठी प्लेट संवर्धन केले गेले नाही, क्रिस्टल व्हायोलेटद्वारे जैववस्तुमान मोजले गेले नाही, जिवंत-मृत पेशींचे प्रतिमांकन झाले नाही आणि पुन्हा वाढीचा पाठपुरावा करण्यात आला नाही. LED नसलेल्या गटांच्या तुलनेत केवळ LED मुळे चयापचयात्मक क्रियाशीलता सुमारे 50 टक्क्यांनी कमी झाली आणि रंजकासह LED मुळे ती सुमारे 55 टक्क्यांनी कमी झाली. केवळ रंजकाचा गट सांख्यिकीदृष्ट्या उपचार न केलेल्या नियंत्रण गटासोबत होता. DNA-आधारित संख्यांच्या बाबतीत, केवळ रंजक, केवळ LED आणि रंजकासह LED या तिन्ही गटांत नियंत्रण गटापेक्षा सांख्यिकीदृष्ट्या लक्षणीय घट होती; मात्र या तिन्ही गटांमध्ये लक्षणीय फरक नव्हता. लेखक याचा निष्कर्ष थेट सांगतात: या उपचारांनी आधीपासून स्थिरावलेली, पृष्ठभागाला चिकटलेली बहुसूक्ष्मजीवी बायोफिल्म नष्ट केली नाही. परिपक्व पेरिओडॉन्टल बायोफिल्मची रचना यांत्रिक पद्धतीने विस्कळीत करणे आवश्यक आहे आणि प्रकाशगतिक पद्धतीची भूमिका जास्तीत जास्त पूरक असू शकते.

सुरुवातीला वसाहत करणाऱ्या बायोफिल्मच्या अभ्यासात निवडक संवर्धन माध्यमांवर पुनर्प्राप्त झालेल्या जिवंत सूक्ष्मजीवांची संख्या हे परिणाममाप होते आणि ती लॉगरिदमिक मापनपट्टीवर व्यक्त केली गेली. प्रकाशाशिवाय रंजक असलेल्या गटात सलाईनपेक्षा फरक नव्हता. प्रकाशाने सक्रिय केलेल्या दोन्ही गटांत—लेसरसह नॅनोकणांत बंदिस्त रंजक आणि LED सह नॅनोकणांत बंदिस्त रंजक—नकारात्मक नियंत्रणाच्या तुलनेत जिवंत सूक्ष्मजीवांची संख्या सुमारे 4 log पर्यंत कमी झाली. या मापनानुसार ती 10,000 पट किंवा 99.99 टक्के घट होती आणि दोन्ही गट क्लोरहेक्सिडीनपेक्षा सांख्यिकीदृष्ट्या वेगळे नव्हते. केवळ प्रकाश आणि केवळ अंधारातील उपचारांसाठी स्वतंत्र, विश्वासार्ह लॉग संख्या नोंदवण्यात आल्या नव्हत्या. त्यामुळे प्रामाणिक सारांश हा संशोधनलेखाला समर्थनीय असलेलाच आहे: प्रकाशाने सक्रिय केलेल्या बंदिस्त रंजकामुळे घट झाली, अंधारातील रंजकामुळे झाली नाही आणि या तरुण बायोफिल्म प्रतिमानात घटेचे परिमाण जंतुनाशक तुलना-मानकाशी जुळले.

कोणत्याही संशोधनलेखात उपचारानंतरची पुन्हा वाढ, उरलेले जैववस्तुमान किंवा मॅट्रिक्सची रचना मोजली गेली नाही. CFU मधील घट उरलेल्या मॅट्रिक्सविषयी काहीही सांगत नाही. चयापचयातील घट किती सूक्ष्मजीव जिवंत राहिले याविषयी काहीही सांगत नाही. DNA-आधारित संख्या कोण जिवंत आहे हे सांगू शकत नाही.

चाचणीपद्धती आणि परिणाममापांची तुलना

हा तक्ता या लेखाची तुलनात्मक मांडणी आहे. एखादा अभ्यास काय सिद्ध करतो हे पाहण्यासाठी एक ओळ आडवी वाचा; दोन्ही अभ्यास कोणत्या प्रश्नांची उत्तरे देत नाहीत हे पाहण्यासाठी एक स्तंभ उभा वाचा.

तीन फरक ठळकपणे लक्षात घेण्यासारखे आहेत. पहिला, परिपक्व प्रतिमानात चयापचयावरील जवळजवळ संपूर्ण परिणाम केवळ प्रकाश गटामुळे स्पष्ट होतो. त्यामुळे 55 टक्के हा आकडा रंजकामुळे झालेला सूक्ष्मजीवनाश दर्शवत नाही. दुसरा, तरुण प्रतिमानात अंधारातील सूत्रणा निष्क्रिय आहे आणि परिणाम फक्त प्रकाशासह दिसतो; हे प्रकाशसक्रियतेचे निदर्शक आहे. तिसरा, DNA-आधारित संख्यांतील 80 टक्के घट गणिती दृष्टीने जवळपास 0.7 log ठरेल, पण फक्त मोजलेला चल जिवंत सूक्ष्मजीवांची संख्या असेल तरच. येथे तो तसा नाही; त्यामुळे हा आकडा लॉग सूक्ष्मजीवनाश म्हणून कधीही उद्धृत करू नये. दातांशी संबंधित बायोफिल्मचा संदर्भ तोंडातील बायोफिल्म आणि दंत संशोधनाच्या संग्रहात दिला आहे. तसेच विविध अभ्यासांतील प्रतिमाने, वापराचे मार्ग आणि परिणाममापे वेगळी ओळखण्याची सर्वसाधारण पद्धत प्रयोगशाळा पद्धतींच्या मार्गदर्शकात सविस्तर दिली आहे.

बायोफिल्म अभ्यास वाचण्यासाठी स्वतंत्र नियम का आवश्यक आहेत

मिथिलीन ब्लू आणि बायोफिल्मविषयीचा एखादा निष्कर्ष त्याच्या स्वतःच्या प्रयोगप्लेटपलीकडे काही अर्थपूर्ण सांगतो का, हे चार चल ठरवतात.

प्रथम येतात बायोफिल्मचे वय आणि मॅट्रिक्स. जुन्या बायोफिल्म अधिक जाड असतात, त्यांच्यात परस्पर बंध अधिक असतात आणि रंजकाला आत शिरणे अधिक कठीण असते. 2021 च्या अभ्यासाचे लेखक रंजकाचा प्रवेश आणि संघटित बायोफिल्ममधून प्रकाशाचा अपुरा प्रसार या मुख्य मर्यादा असल्याचे सांगतात. सायक्लोडेक्स्ट्रिनमध्ये बंदिस्त करण्यासारख्या वाहकाधारित पद्धती नेमकी ही मर्यादा दूर करण्याचे प्रयत्न आहेत. म्हणूनच सूत्रणा हा केवळ तपशील नसून प्रयोगातील एक चल आहे.

दुसरे येते प्रकाशमात्रेचे गणित. येथे एकाच तरंगलांबीवर फ्लुएन्स मूल्ये 8.1 ते 320 J प्रति चौरस cm अशी जवळजवळ चाळीस पट बदलतात आणि किरणन क्षमता 90 mW ते अनेक W प्रति चौरस cm इतकी बदलते. तरंगलांबी समान असणे म्हणजे प्रकाशसंपर्क समान असणे नव्हे. तसेच कोणत्याही अभ्यासात मात्रा इतक्या पद्धतशीरपणे बदललेली नाही की मात्रा-परिणाम वक्र निश्चित करता येईल.

तिसरे येतात नियंत्रण गट. अंधारातील रंजकाचा गट नसलेला अभ्यास रंजकाची स्वतःची विषारी क्रिया नाकारू शकत नाही. केवळ प्रकाशाचा गट नसलेला अभ्यास कोणताही परिणाम प्रकाशसक्रियतेमुळे झाला असे सांगू शकत नाही. दोन्ही संशोधनलेखांत हे दोन्ही गट आहेत, ही त्यांची जमेची बाजू आहे. परिपक्व बायोफिल्मचा संशोधनलेख केवळ प्रकाश गट महत्त्वाचा का आहे हे दाखवतो: तो नसता, तर चयापचयाचा निष्कर्ष रंजकाचा परिणाम म्हणून समजला गेला असता.

चौथे येतात परिणाममापे. जिवंतपणा, चयापचय, DNA चे प्रमाण, जैववस्तुमान, रचना आणि पुन्हा वाढ हे सहा भिन्न दावे आहेत. येथील कोणताही संशोधनलेख यांपैकी दोनपेक्षा जास्त गोष्टी मोजत नाही. विशेषतः पुन्हा वाढीचे मापन सर्वत्र अनुपस्थित आहे. त्यामुळे परिणाम किती काळ टिकतो हे सिद्ध झालेले नसून मोजलेलेच नाही.

संसर्गाच्या उपचारांबाबत यातून काय सिद्ध होत नाही

यांपैकी कोणत्याही प्रायोगिक प्रणालीत रक्ताभिसरण, प्रतिरक्षापेशी, लाळेचा प्रवाह, हिरडीच्या खाचांतील द्रवाचे नूतनीकरण किंवा यांत्रिकरीत्या थर काढणे यांचा समावेश नाही. प्रयोगातील कप्प्यातील रंजकाची सांद्रता म्हणजे मानवात कोणत्याही मार्गाने दिल्यानंतर ऊतींमध्ये असणारी सांद्रता नव्हे. तरुण किंवा अगदी परिपक्व प्रयोगशाळेतील बायोफिल्मला एकदाच 5 मिनिटे किंवा 90 सेकंद प्रकाश देणे म्हणजे उपचारक्रम नव्हे. परिपक्व बायोफिल्मच्या अभ्यासाचे लेखकही हेच सांगतात: ते प्रकाशगतिक पद्धतीला स्वतंत्र निर्मूलन पद्धत न मानता यांत्रिकरीत्या बायोफिल्म काढण्याला संभाव्य पूरक पद्धत म्हणून मांडतात.

योग्य सारांश मर्यादित आणि ठोस आहे. प्रकाशाने सक्रिय केलेले मिथिलीन ब्लू प्रयोगशाळेतील तोंडाशी संबंधित परिपक्व सूक्ष्मजीवसमुदाय नष्ट न करता त्याचा चयापचय आणि DNA-आधारित संख्या कमी करू शकते; त्या मांडणीत चयापचयावरील बहुतांश परिणाम केवळ प्रकाशामुळे होतो. सायक्लोडेक्स्ट्रिनद्वारे वाहून नेलेला आणि प्रकाशाने सक्रिय केलेला रंजक प्रयोगशाळेतील तरुण स्ट्रेप्टोकोकल बायोफिल्ममधील जिवंत सूक्ष्मजीवांची संख्या अनेक लॉग पातळ्यांनी कमी करू शकतो. त्याच प्रतिमानात ही घट क्लोरहेक्सिडीनशी तुलनीय असते. यांपैकी कोणतेही निरीक्षण एखाद्या व्यक्तीतील संसर्गाला लागू होते का, हे रंजक पोहोचवण्याची पद्धत, प्रकाशाचा प्रवेश, ऑक्सिजन, शरीररचना आणि चिकित्सीय परिणाममापे यांवर अवलंबून आहे. ही मापने करण्यासाठी या प्रयोगांची रचना केलेलीच नव्हती.