मेथिलीन ब्लूचा अंशांकन वक्र तयार करणे: ब्लँक, व्याप्ती आणि रेषीयता

दोन विश्लेषक मेथिलीन ब्लूच्या एकाच मूलद्रावणाच्या बाटलीतून प्रत्येकी एक अंशांकन वक्र तयार करतात. पहिल्याला उगमबिंदूतून जाणारी सरळ रेषा मिळते आणि तो अज्ञात नमुन्यांचे मापन आत्मविश्वासाने करतो. दुसऱ्याला वरच्या टोकाला वाकणारी रेषा, शून्याजवळ न येणारा अक्षछेद आणि विरलीकरणानुसार बदलणारे नमुन्यांचे निकाल मिळतात. रंगद्रव्य तेच, उपकरण तेच, तरंगलांबीही तीच. फरक कौशल्यात नाही. तो प्रयोगाच्या रचनेत आहे: ब्लँकमध्ये काय होते, कोणत्या सांद्रता निवडल्या होत्या आणि तपासलेली व्याप्ती एक साधे मॉडेल लागू राहणाऱ्या क्षेत्रात होती का.

अंशांकन वक्र म्हणजे उपकरणाचा प्रतिसाद आणि सांद्रता यांच्यातील एक करार; तो ज्या परिस्थितीत तयार केला गेला, त्याच परिस्थितीत वैध असतो. मेथिलीन ब्लूसाठी या करारात एक ज्ञात कमकुवत दुवा आहे. हे रंगद्रव्य पाण्यात स्वतःचे समूह तयार करते, त्यामुळे प्रकाश शोषणारी रासायनिक रूपे सांद्रतेनुसार बदलतात. हा बदल समाविष्ट करणाऱ्या व्याप्तीत तयार केलेला वक्र सरळ राहणार नाही आणि कितीही सांख्यिकीय विश्लेषण केले तरी ते दुरुस्त होणार नाही. रेषेला अर्थपूर्ण आधार मिळावा यासाठी वक्राची रचना कशी करावी, हे या लेखात दाखवले आहे: योग्य ब्लँक निवडा, व्याप्ती मोनोमरचे प्राबल्य असलेल्या क्षेत्रात ठेवा, खऱ्या अर्थाने स्वतंत्र पुनरावृत्ती मापने करा आणि वक्रतेकडे गोंगाट म्हणून नव्हे, तर माहिती म्हणून पाहा.

सुरुवात मानकांपासून नव्हे, ब्लँकपासून करा

ब्लँक शून्य ठरवतो आणि मेथिलीन ब्लूसाठी त्यात रंगद्रव्य वगळता बाकी सर्व काही असले पाहिजे. पाण्याचा दर्जा, बफर आणि pH, क्षार, सहद्रावकाचे प्रमाण, तापमान—सर्व समान असले पाहिजे. अंशांकन मानके याच मॅट्रिक्समध्ये तयार करा. याचे कारण रासायनिक आहे, केवळ प्रक्रियात्मक नाही. क्षार आणि द्रावक मोनोमर, डायमर आणि मोठे समूह यांच्यातील संतुलन बदलतात, ज्यामुळे मापनाच्या तरंगलांबीवरील वर्णपट बदलतो. केवळ पाण्याचा ब्लँक मॅट्रिक्समुळे रासायनिक रूपांच्या वितरणात झालेला बदल दुरुस्त करू शकत नाही. पाण्यातील मेथिलीन ब्लूच्या वर्णपटांच्या एकत्रित विश्लेषणात, जे त्याच्या मुक्त प्रवेश नोंदीतून उपलब्ध आहे, सोडियम क्लोराइडची सांद्रता 0 ते 0.15 M अशी बदलली होती. याचे नेमके कारण म्हणजे आयनिक बलामुळे समतोल बदलतो आणि क्षार वाढल्यावर समूह निर्मिती वाढली.

याचा एक व्यावहारिक परिणाम: विआयनीकृत पाण्यात अंशांकन करून नंतर फॉस्फेट बफर किंवा सांडपाण्याच्या गाळणद्रवातील नमुन्यांचे मापन कधीही करू नका. विश्लेष्य नसलेला मॅट्रिक्स उपलब्ध नसल्यास, न जुळणाऱ्या बाह्य वक्रापेक्षा नमुन्यातच मानक वाढ पद्धत वापरणे अधिक योग्य ठरते. जलीय परिमाणात्मक चाचण्यांची विश्वासार्हता राखण्याबाबत संबंधित मार्गदर्शन मॅट्रिक्स आणि व्यत्ययांच्या चर्चेत दिले आहे; रंगद्रव्यांच्या परिमाणात्मक चाचण्यांची सामान्य तत्त्वे चाचणी रचनेच्या आढाव्यात दिली आहेत.

एका रासायनिक रूपाचे प्राबल्य असलेली व्याप्ती निवडा

664 nm जवळील दीर्घ तरंगलांबीच्या पट्ट्यातील परिमाणात्मक मापनात बहुतेक रंगद्रव्य मोनोमर रूपात असल्याचे गृहीत धरले जाते. साध्या पाण्यात हे गृहीतक द्रावणे विरल असतानाच, साधारण कमी मायक्रोमोलर क्षेत्रात, लागू राहते. प्रकाशित प्रायोगिक उतार ही मर्यादा स्पष्ट करतात: 1 cm मापन कक्षांत सुमारे 7 मायक्रोमोलरपेक्षा कमी सांद्रतेत ठेवलेल्या अंशांकनांचा उतार जवळपास 82,000 M-1 cm-1 असतो; पण अंशांकन सुमारे 37 मायक्रोमोलरपर्यंत वाढवल्यास तो साधारण 67,100 पर्यंत कमी होतो, कारण वरच्या सांद्रतेच्या मानकांत आधीच लक्षणीय प्रमाणात डायमर असतो. येथे दिलेल्या प्रत्येक गुणांकासोबत त्याच्या परिस्थितीची नोंद मेथिलीन ब्लूच्या वर्णपटीय संदर्भात आहे. आकड्यांची तुलना करण्यासाठी तोच योग्य संदर्भ आहे; या लेखात त्यांचा वापर फक्त व्याप्ती ठरवण्यासाठी केला आहे.

यावरून रचनेचे नियम थेट स्पष्ट होतात:

1. सर्वाधिक सांद्रतेचे मानक इतके विरल ठेवा की वर्णपटाचा आकार स्थिर राहील. पद्धत विकसित करताना प्रत्येक पातळीसाठी एकाच तरंगलांबीवर मापन करण्याऐवजी संपूर्ण दृश्य प्रकाश व्याप्तीचे (सुमारे 550 ते 750 nm) स्कॅन घ्या. सामान्यीकृत वर्णपटांचा आकार सांद्रतेनुसार बदलत असेल, तर रसायनशास्त्र बदलत आहे आणि व्याप्ती खूप विस्तृत आहे.
2. प्रत्येक पातळीवर 610 nm जवळील शोषकताचे 665 nm जवळील शोषकतेशी असलेले गुणोत्तर नोंदवा. सांद्रतेसोबत वाढणारे गुणोत्तर म्हणजे डायमरचा खांद्यासारखा उभार वाढत आहे आणि मोनोमर मॉडेल लागू राहत नाही. हे निदान समूह निर्मिती आणि सांद्रतेच्या परिणामांच्या मार्गदर्शकात अधिक स्पष्ट केले आहे.
3. कमी मायक्रोमोलर सांद्रतेतील कामासाठी 1 cm मापन कक्ष वापरा. उतार जवळपास 82,000 असताना, 5 मायक्रोमोलरमुळे जवळपास 0.41 शोषकता आणि 10 मायक्रोमोलरमुळे सुमारे 0.82 शोषकता मिळते; दोन्ही बहुतेक उपकरणांसाठी सोयीच्या आहेत.
4. सांद्र मूलद्रावणांसाठी, 1 पेक्षा खूप जास्त शोषकता स्वीकारण्याऐवजी प्रकाशपथ कमी करा; पण लक्षात ठेवा की लहान प्रकाशपथामुळे प्रकाशमापनातील अडचण सुटते, रासायनिक अडचण नाही. समूह निर्मिती सांद्रतेवर अवलंबून असते, प्रकाशपथाच्या लांबीवर नाही. त्यामुळे सांद्र मूलद्रावणासाठी विरल मोनोमर वक्र वापरण्याऐवजी त्यातील रासायनिक रूपांचे वितरण विचारात घेणारी स्वतंत्र पद्धत आवश्यक असते.

या चित्राचा मोठा भाग ज्या एकत्रित जुळवणीवर आधारित आहे, त्यात 1.1 मायक्रोमोलर ते 3.4 मिलिमोलर या व्याप्तीतील 224 वर्णपट समाविष्ट होते आणि 34 मायक्रोमोलरपेक्षाही कमी सांद्रतेत टेट्रामरचा संकेत ओळखता येत असल्याचे आढळले. हा निष्कर्ष सावध राहण्यास सांगतो: रेषीय क्षेत्र सहज वाटते त्यापेक्षा अरुंद आहे, म्हणून ते गृहीत धरण्याऐवजी पडताळा.

पातळ्या, पुनरावृत्ती मापने आणि क्रम

तीन बिंदूंचा वक्र काहीही सिद्ध करत नाही. ICH Q2(R2) मधील सत्यापन मार्गदर्शन रेषीयतेचे मूल्यमापन करण्यासाठी किमान पाच सांद्रता वापरण्यास सांगते. शून्य नसलेल्या सहा ते आठ पातळ्या अधिक विश्वासार्ह कार्यकारी वक्र देतात, विशेषतः समूह निर्मिती सुरू होणाऱ्या वरच्या टोकाजवळ. सोयीसाठी निवडलेल्या भूमितीय श्रेणीऐवजी, अपेक्षित नमुन्यांची व्याप्ती व्यापतील अशा पातळ्या निवडा आणि वक्रता होण्याची शक्यता सर्वाधिक असलेल्या भागात अधिक पातळ्या ठेवा.

प्रत्येक पातळीचे दोन किंवा तीन वेळा मापन करा; मात्र एकाच फ्लास्कमधून तीन वाचने घेण्याऐवजी द्रावणे स्वतंत्रपणे तयार करा. स्वतंत्र पुनरावृत्ती मापनांतून द्रावण तयार करतानाच्या त्रुटी दिसतात; एकाच फ्लास्कची वारंवार वाचने फक्त उपकरणातील गोंगाट दाखवतात. 2020 च्या एकत्रित अभ्यासात प्रत्येक द्रावणाचे तीन वेळा मापन केले होते आणि हा अजूनही योग्य प्रारंभिक पर्याय आहे. मापनांचा क्रम यादृच्छिक ठेवा, म्हणजे प्रतिसादातील हळूहळू होणारा बदल, काचेवर होणारे अधिशोषण किंवा तापमानातील बदल वक्रतेसारखे भासणार नाहीत. क्वार्ट्झ क्युवेटवरील एका अभ्यासात 34 मायक्रोमोलर द्रावणातील सुमारे 3 टक्के रंगद्रव्य 10 मिनिटांत अधिशोषित होत असल्याचे आढळले. त्यामुळे संपूर्ण मापन संचात संपर्काचा कालावधी, क्युवेट, स्वच्छता आणि क्रम सुसंगत ठेवा.

समजावून सांगण्यासाठी सोडवलेले उदाहरण (मोजलेला डेटा नाही)

खालील आकडे गणित दाखवण्यासाठी काल्पनिकरीत्या तयार केले आहेत. ते प्रयोगशाळेतील मापने नाहीत आणि मेथिलीन ब्लूचा डेटा म्हणून त्यांचा संदर्भ देऊ नये. त्यांच्याभोवती केलेल्या तपासण्यांची पद्धत महत्त्वाची आहे.

समजा, जुळणाऱ्या बफरमधील सहा मानकांचे, 1 cm प्रकाशपथ वापरून, जुळणाऱ्या ब्लँकच्या संदर्भात 665 nm वर मापन केले:

सांद्रतेच्या विरुद्ध सरासरी शोषकतेची सरळ रेषीय जुळवणी केल्यास प्रति मायक्रोमोलर जवळपास 0.0805 शोषकता एकक इतका उतार आणि शून्यापासून काही मिलिशोषकता एककांच्या आत असलेला अक्षछेद मिळतो. उताराला प्रकाशपथाच्या लांबीने भागल्यास त्याचे आभासी शोषण गुणांकात रूपांतर होते: प्रति मायक्रोमोलर 0.0805 म्हणजे सुमारे 80,500 M-1 cm-1, जे पाण्यातील मोनोमरचे प्राबल्य असलेल्या व्याप्तीशी सुसंगत आहे. महत्त्वाची तपासणी R च्या वर्गाची नाही; तो कोणत्याही परिस्थितीत उत्कृष्ट दिसेल. महत्त्वाचे आहेत शून्याजवळचा अक्षछेद, S2 ते S5 मध्ये स्थिर राहणारे A610/A665 गुणोत्तर आणि कोणताही कल नसलेले विखुरलेले अवशेष. S6 वरील गुणोत्तरातील वाढ हा स्पष्ट संकेत आहे: एकतर ती पातळी वगळा किंवा या मॅट्रिक्स आणि उपकरणाच्या संयोजनासाठी 7 मायक्रोमोलर ही तात्पुरती कमाल मर्यादा म्हणून नोंदवा.

अज्ञात नमुन्याचे त्याच परिस्थितीत घेतलेले वाचन 0.245 असल्यास थेट रूपांतर करता येते: 0.245 ला प्रति मायक्रोमोलर 0.0805 ने भागल्यास सुमारे 3.0 मायक्रोमोलर मिळते; यात नमुन्याचा कोणताही विरलीकरण गुणक अद्याप लागू केलेला नाही. निकालासोबत त्याच्या परिस्थितीची नोंद द्या: तरंगलांबी, प्रकाशपथ, ब्लँकचा मॅट्रिक्स, अंशांकनाची व्याप्ती आणि तारीख.

भरण्यासाठी अंशांकन कार्यपत्रक

प्रत्येक नवीन मॅट्रिक्ससाठी हा साचा प्रयोगशाळेच्या नोंदीत कॉपी करा. एक मॅट्रिक्स, एक पत्रक, एक वक्र.

अभिकर्मकाच्या रूपाची ओळ महत्त्वाची आहे. व्यावसायिक मेथिलीन ब्लू निर्जल क्षार किंवा ट्रायहायड्रेटसारखे हायड्रेट असू शकते आणि चुकीचे मोलर वस्तुमान प्रत्येक नाममात्र सांद्रतेत नकळत पद्धतशीर त्रुटी आणते. प्रारंभिक पदार्थाची शुद्धता आणि विनिर्देश तपासण्याबाबत गुणवत्ता आणि दर्जा मार्गदर्शकात माहिती दिली आहे.

स्वतंत्र तपासणी मानक वापरून पडताळा

अंशांकन वक्राने स्वतःच स्वतःचे मूल्यमापन करू नये. जुळवणी केल्यानंतर, स्वतंत्रपणे वजन करून तयार केलेल्या मूलद्रावणातून स्वीकारलेल्या व्याप्तीच्या मध्याजवळील सांद्रतेचे एक तपासणी मानक तयार करा आणि त्याचे अज्ञात नमुन्याप्रमाणे मापन करा. निकाल काही टक्क्यांच्या आत जुळल्यास तयारीच्या संपूर्ण साखळीची पुष्टी होते; न जुळल्यास उपकरणाऐवजी मूलद्रावण किंवा विरलीकरणे संशयास्पद ठरतात. नमुन्यांच्या प्रत्येक संचासोबत तपासणी मानकाचे मापन पुन्हा करा. वक्र बदललेला नसताना त्याचे मापन हळूहळू बदलत असेल, तर नमुन्यांवर संशय घेण्याआधी कामासाठी वापरल्या जाणाऱ्या द्रावणांवर किंवा क्युवेटवर संशय घ्या. या एका सवयीमुळे बहुतेक न उघड होणाऱ्या त्रुटी सापडतात: निर्जल पदार्थाच्या बाटलीसाठी हायड्रेटचे मोलर वस्तुमान वापरणे, अंशांकन बिघडलेली मायक्रोपिपेट किंवा चुकीच्या आयनिक बलाचा बफर तयार करणे. कार्यपत्रकात उताराच्या शेजारी तपासणी मानकाची पुनर्प्राप्ती नोंदवा, म्हणजे नंतर नोंद वाचणाऱ्याला रेषा केवळ काढलेली नसून तपासलेली आहे हे दिसेल.

अरेषीयतेचा निदानासाठी अर्थ लावणे

वक्र वाकल्यास, विचलनाचा आकार कारण ओळखण्यास मदत करतो. वर्णपटाचा आकार न बदलता उच्च शोषकतेवर खाली वाकणारा वक्र उपकरणाकडे निर्देश करतो; अनेकदा भटका प्रकाश जास्त शोषकतेची मूल्ये कमी दाखवतो. वक्रतेसोबत 610 nm वरील खांद्यासारखा उभार वाढत असेल, तर कारण रासायनिक आहे: डायमर आणि मोठे समूह मोनोमरपेक्षा वेगळ्या प्रकारे प्रकाश शोषतात. शून्य न होणारा ब्लँक किंवा वेळेनुसार कमी होत जाणारी मानकांची वाचने पात्राकडे निर्देश करतात: काच किंवा क्युवेटवर अधिशोषण होत असू शकते, विशेषतः मापन संचात संपर्काचे कालावधी बदलत असतील तर. तसेच, बिंदूंमधून व्यवस्थित जाणारी रेषा असूनही नमुन्यांचे निकाल चुकीचे मिळत असतील, तर कारण मॅट्रिक्समध्ये आहे: नमुने अंशांकन मानकांपेक्षा वेगळे आहेत, म्हणून नमुन्याच्या मॅट्रिक्समध्ये वक्र पुन्हा तयार करा किंवा मानक वाढ पद्धत वापरा. प्रत्येक वेळी सांद्रतेच्या विरुद्ध अवशेषांचा आलेख काढा. यादृच्छिक विखुरण सरळ रेषीय मॉडेलला आधार देते; वर किंवा खाली वाकलेला नमुना कोणत्याही R च्या वर्गाच्या मर्यादेपेक्षा अधिक विश्वासार्हपणे ते खोडून काढतो. सत्यापन मार्गदर्शनातही हा मुद्दा स्पष्टपणे मान्य केला आहे.

मेथिलीन ब्लूसाठी ही शिस्त उपयोगी ठरते. त्याचा मोनोमर पट्टा प्रबळ आहे, त्याचे रसायनशास्त्र नीट समजलेले आहे आणि मापनातील बिघाड आकडे दूषित करण्याआधीच वर्णपटात स्वतःची चिन्हे दाखवतात. वक्राची व्याप्ती अरुंद ठेवा, योग्य ब्लँक वापरा, स्वतंत्र पुनरावृत्ती मापने करा आणि व्याप्ती ठरवताना वर्णपटांच्या आकाराला निर्णायक महत्त्व द्या. परिणामी मिळणारी रेषा लहान असते, पण तिच्यावरचा प्रत्येक बिंदू विश्वासार्ह असतो.

या लेखातील उदाहरणार्थ गणना पद्धत दाखवण्यासाठी काल्पनिक आकडे वापरतात. संपूर्ण परिस्थितीसह मोजलेले संदर्भ गुणांक जोडलेल्या वर्णपटीय संदर्भात दिले आहेत आणि आधारभूत समूह निर्मितीचा अभ्यास PMID 33251415 येथे अनुक्रमित आहे.