EMB अगरवर E. coli आणि इतर वसाहतींचे स्वरूप समजून घेणे

एक विद्यार्थी अज्ञात नमुन्याचे इओसिन मिथिलीन ब्लू अगरवर रेषांकन करतो, रात्रभर उष्मायन करतो आणि दुसऱ्या दिवशी प्लेटवर हिरवी झळाळी असलेल्या गडद वसाहती पाहतो. नोंदवहीत तो लिहितो, "E. coli, पुष्टी झाली." प्लेटवरून जितके ठरवता येते, त्यापेक्षा अधिक दावा या नोंदीत केला जातो. प्लेट विशिष्ट परिस्थितींमधील वाढ आणि किण्वनाचा दृश्य गुणधर्म दाखवते. प्रजातीची ओळख हा स्वतंत्र दावा आहे, ज्यासाठी स्वतंत्र पुरावा आवश्यक असतो.

या मार्गदर्शकात EMB अगरवरील निष्कर्षांकडे अर्थनिर्णयनाचे काम म्हणून पाहिले आहे. यात मूलभूत संकल्पना स्पष्ट केली आहे, नियंत्रण नमुन्यांसह उदाहरणार्थ प्लेटांचा चित्रसंग्रह दिला आहे आणि पाठ्यपुस्तकातील चित्र कोणत्या परिस्थितींमध्ये दिशाभूल करते ते सांगितले आहे.

प्लेटमागील संकल्पना

EMB अगर हे निवडक आणि विभेदक अशा दोन्ही प्रकारचे माध्यम आहे. इओसिन Y आणि मिथिलीन ब्लू हे रंगद्रव्य अनेक ग्राम-पॉझिटिव्ह जीवांची वाढ दडपतात, त्यामुळे हे माध्यम ग्राम-नेगेटिव्ह जीवांच्या वाढीस अनुकूल ठरते. हीच रंगद्रव्ये निर्देशक म्हणूनही काम करतात: एखादा जीव उपलब्ध साखरेचे किण्वन करून स्थानिक पातळीवर पुरेसे आम्ल निर्माण करतो तेव्हा वसाहत मोठ्या प्रमाणात रंगद्रव्य शोषून घेते आणि गडद जांभळी ते निळसर काळी होते. तीव्र आम्लनिर्मिती झाल्यास वसाहतीच्या पृष्ठभागावर धातूसारखी हिरवी झळाळी दिसू शकते. इओसिन मिथिलीन ब्लू अगर प्लेटांसाठीचा ASM प्रोटोकॉल निवड आणि विभेदन यांच्या या एकत्रित कार्याचे वर्णन करतो आणि अध्यापनासाठी संदर्भ छायाचित्रे देतो.

कोणताही निष्कर्ष वाचण्याआधी एक तपशील महत्त्वाचा आहे: कोणती संघटना वापरली आहे ते तपासा. जुन्या Holt Harris Teague संघटनेत लॅक्टोज आणि सुक्रोज असतात, तर Levine EMB मध्ये फक्त लॅक्टोज असते. सुक्रोजचे किण्वन करणारा, पण लॅक्टोजचे किण्वन न करणारा जीव, उदाहरणार्थ Serratia marcescens चे अनेक विलगित प्रकार, या दोन प्रकारच्या माध्यमांवर वेगवेगळा दिसू शकतो. EMB माध्यमांविषयी निर्मात्याची कागदपत्रे संघटनेतील हा फरक स्पष्टपणे सांगतात. निष्कर्षासोबत निर्माता आणि माध्यमाची संघटना नोंदवहीत लिहा.

तयार केलेले, पण जीवांचे रोपण न केलेले EMB अगर सहसा लालसर तपकिरी ते लालसर जांभळे असते; कधीकधी त्यात हिरवट छटा किंवा सूक्ष्म अवक्षेप दिसतो. हा पार्श्वभूमीचा रंग म्हणजे वाढ नव्हे. प्रत्येक निरीक्षणाची तुलना रोपण न केलेल्या प्लेटशी किंवा नोंदवलेल्या मूळ स्वरूपाशी करा. अध्यापन प्रोटोकॉलमध्ये वेगळे सांगितले नसल्यास, प्राथमिक प्लेटचे निरीक्षण 35 ते 37 C तापमानावर सुमारे 18 ते 24 तास वायवीय उष्मायन केल्यानंतर करा. अधिक काळ उष्मायन केल्यास किण्वनाचे दृश्य स्वरूप बदलू शकते.

प्लेटचे निरीक्षण कसे करावे

दोन प्रकारचा प्रकाश वापरा. प्रथम परावर्तित किंवा तिरप्या प्रकाशात प्लेट पाहा आणि ती कलती करा: धातूसारखी झळाळी इंद्रधनुषी असते आणि पाहण्याच्या कोनानुसार दिसू किंवा नाहीशी होऊ शकते. त्यानंतर वसाहतीचा रंग आणि गडद केंद्रे तपासण्यासाठी आरपार जाणाऱ्या प्रकाशात पाहा. नीट विलग असलेल्या वसाहतींचे निरीक्षण करा, कारण गर्दी आणि शेजारच्या वसाहती स्थानिक आम्लसंचय बदलतात आणि रंग कमी किंवा अधिक ठळक करू शकतात. ASM चा प्रतिमासंच हे थेट दाखवतो: मिश्र संवर्धनातील E. coli ची अपेक्षित झळाळी नाहीशी होऊ शकते, कारण आसपासचे जीव आम्लीय वातावरण बदलतात.

प्रयोगात शक्य असेल तेव्हा नियंत्रण नमुने समाविष्ट करा. अध्यापनात सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या संचात निळसर काळ्या रंगासाठी आणि धातूसारख्या झळाळीसाठी E. coli ATCC 25922, रंगहीन स्वरूपासाठी Salmonella Typhimurium ATCC 14028 किंवा Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 सारखा किण्वन न करणारा जीव, आणि वाढ-दमन नियंत्रणासाठी Enterococcus faecalis किंवा Staphylococcus aureus सारखा ग्राम-पॉझिटिव्ह जीव असतो. हे EMB माध्यमांसाठीच्या मानक गुणवत्ता-नियंत्रण तक्त्यांमध्ये दिले आहे. सकारात्मक नियंत्रण नमुन्यात झळाळी दिसत नसेल, तर अज्ञात नमुन्याबद्दल शंका घेण्याआधी उष्मायन, गर्दी किंवा माध्यमाची संघटना तपासा.

उदाहरणार्थ प्लेटांचा चित्रसंग्रह

खालील प्लेटांची चित्रे निर्मित illustrations आहेत; ती वास्तविक संवर्धनांची छायाचित्रे नाहीत. ती कोणता नमुना पाहायचा हे दाखवतात, कोणत्याही एका जीवप्रकाराची अचूक रंगछटा नव्हे. त्यांची तुलना ASM च्या संदर्भ छायाचित्रांशी आणि अध्यापन प्रयोगशाळेतील वास्तविक प्लेटांशी करा.

प्लेट 1: EMB अगरवरील Escherichia coli, तीव्र लॅक्टोज किण्वन करणारा जीव

EMB अगरवरील E. coli सहसा गडद जांभळी ते निळसर काळी दिसते. अनेकदा वसाहतीचे केंद्र गडद असते आणि तीव्र आम्लनिर्मितीमुळे धातूसारखी हिरवी झळाळी दिसते. विद्यार्थी शोधत असलेले प्रसिद्ध लक्षण म्हणजे ही झळाळी, पण तिला ओळखीची व्याख्या न मानता पूरक पुरावा माना. जीवप्रकार, उष्मायनाचा कालावधी, वसाहतींची घनता आणि पाहण्याचा कोन यांनुसार झळाळीची तीव्रता बदलते. झळाळी नसल्याने E. coli ची शक्यता नाकारता येत नाही, आणि झळाळी नसलेली गडद वसाहत इतर अनेक किण्वन करणाऱ्या जीवांकडेही निर्देश करते. पुढील कोणत्याही कामासाठी गर्दीच्या भागातील निरीक्षणावर अवलंबून न राहता नीट विलग असलेली वसाहत निवडा.

प्लेट 2: EMB अगरवरील Klebsiella pneumoniae, श्लेष्मल वसाहती निर्माण करणारा किण्वक

EMB अगरवरील Klebsiella pneumoniae सहसा गुलाबी-जांभळ्या ते तपकिरी-जांभळ्या छटांच्या मोठ्या, चकचकीत, श्लेष्मल वसाहती निर्माण करते. त्यांची केंद्रे अनेकदा गडद असतात, पण सहसा ठळक धातूसारखी झळाळी नसते. Enterobacter सारख्या संबंधित किण्वन करणाऱ्या जीवांमध्येही असेच स्वरूप दिसते. श्लेष्मल पोत आणि वसाहतीचा आकार हे निरीक्षणाचे भाग आहेत: लहान आणि सपाट गुलाबी वसाहतीचा अर्थ मोठ्या, घुमटाकार श्लेष्मल वसाहतीपेक्षा वेगळा असतो. E. coli प्रमाणेच, प्लेट किण्वनाचा दृश्य गुणधर्म सुचवते; प्रजातीच्या पातळीवर नाव निश्चित करण्यासाठी खाली वर्णन केलेले जैवरासायनिक पुष्टीकरण आवश्यक असते.

प्लेट 3: EMB अगरवरील Salmonella आणि किण्वन न करणारे इतर जीव, रंगहीन वसाहती

EMB अगरवरील Salmonella आणि लॅक्टोजचे किण्वन न करणारे संबंधित जीव, ज्यात Shigella आणि Pseudomonas चे अनेक विलगित प्रकार येतात, सहसा रंगहीन ते अर्धपारदर्शक किंवा फिकट अंबर रंगाच्या वसाहती म्हणून वाढतात. काही संघटनांमध्ये आणि परिस्थितींमध्ये फिकट गुलाबी छटा दिसते; त्यामुळे फिकट गुलाबी वसाहत म्हणजे आपोआप किण्वन करणारा जीव असे नाही. EMB वर Salmonella ला Shigella पासून किंवा किण्वन न करणाऱ्या इतर जीवांपासून वेगळे ओळखता येत नाही; तो फरक पुढील चाचण्यांनी ठरवावा लागतो. हेही लक्षात घ्या की E. coli सारख्या धातूसारखी झळाळी असलेल्या वसाहती निर्माण करणारे लॅक्टोज-पॉझिटिव्ह Salmonella प्रकार नोंदवले गेले आहेत. त्यामुळे एका प्लेटवरून अंतिम निष्कर्ष काढता येत नाही.

प्लेट 4: Serratia marcescens आणि माध्यमाच्या संघटनेमुळे होणारी दिशाभूल

Serratia marcescens साठी स्वतंत्र विभाग आवश्यक आहे, कारण विद्यार्थी अनेकदा लाल वसाहतींची अपेक्षा करतात आणि त्यामुळे प्लेटचा चुकीचा अर्थ लावतात. बहुतेक चिकित्सीय विलगित प्रकार लॅक्टोजचे किण्वन करत नाहीत, त्यामुळे Levine EMB वर ते सामान्यतः फिकट किंवा अल्प रंगाचे दिसतात. अनेक विलगित प्रकार सुक्रोजचे किण्वन करत असल्यामुळे, सुक्रोज असलेल्या संघटनेत अधिक गडद किंवा आम्लनिर्मितीशी अधिक संबंधित प्रतिक्रिया दिसू शकते. 35 ते 37 C तापमानावर परिचित लाल प्रोडिजिओसिन रंगद्रव्याचीही अपेक्षा करू नका; उष्मायनयंत्राच्या तापमानावर रंगद्रव्यनिर्मिती भरोसेमंद नसते. प्रोटोकॉलमध्ये EMB अगरवरील Serratia marcescens चा उल्लेख असल्यास, त्या विधानात कोणती संघटना गृहीत धरली आहे ते तपासा. Serratia च्या चयापचयाचा आढावा या दिशाभुलीमागील लॅक्टोज-नेगेटिव्ह आणि सुक्रोज किण्वनातील बदलता नमुना संक्षेपात स्पष्ट करतो.

प्लेट 5: नियंत्रण नमुने आणि वाढ दडपलेले जीव

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus आणि Bacillus सारख्या ग्राम-पॉझिटिव्ह जीवांची वाढ EMB अगरवर सामान्यतः रोखली जाते किंवा मोठ्या प्रमाणात दडपली जाते, तरी प्रत्येक जीवप्रकारासाठी हे दमन पूर्ण असतेच असे नाही. नियंत्रण नमुन्यांचा संच निरीक्षणाची विश्वासार्हता राखतो: E. coli नियंत्रण नमुन्यात निळसर काळा रंग आणि झळाळीसह चांगली वाढ दिसली पाहिजे, किण्वन न करणाऱ्या नियंत्रण नमुन्यात रंगहीन वाढ दिसली पाहिजे, आणि वाढ-दमन नियंत्रण नमुन्यात अत्यल्प किंवा अजिबात वाढ दिसू नये. वाढ-दमन नियंत्रण नमुना चांगला वाढल्यास, निवडक दमनाचा टप्पा अपयशी ठरला आहे आणि त्या बॅचमधील प्रत्येक इतर निरीक्षण संशयास्पद ठरते. रंजन पद्धती संवर्धन माध्यमांपेक्षा वेगळ्या प्रश्नाचे उत्तर देतात; प्रयोगशाळेतील स्लाइड रंजनासाठी मिथिलीन ब्लू रंजनाचा चित्रसंग्रह पाहा.

मर्यादांसह तुलना

दिशाभूल करणाऱ्या स्वरूपांचा सारांश तीन वाक्यांत सांगता येतो. गडद रंग म्हणजे E. coli नव्हे, कारण Klebsiella, Enterobacter आणि इतर किण्वकांमध्ये झळाळीशिवाय गडद केंद्रे तयार होतात. गुलाबी रंग म्हणजे Klebsiella नव्हे, कारण मध्यम किंवा मंद गतीने किण्वन करणारे जीव आणि सामान्यतः किण्वन न करणारे मानले जाणारे काही जीव गुलाबी किंवा फिकट जांभळे दिसतात. झळाळी म्हणजे निश्चित E. coli नव्हे, कारण इतर तीव्र किण्वकही ती निर्माण करू शकतात. अध्यापन प्रोटोकॉल आणि त्यातील मिश्र संवर्धनाची चित्रे या प्रत्येक चुकीच्या निष्कर्षाचे उदाहरण दाखवतात.

पुष्टीकरणाच्या मर्यादा

EMB अगर दृश्य गुणधर्म दाखवते, प्रजाती सांगत नाही. वेगवेगळ्या जीवांच्या वसाहतींचे स्वरूप सारखे असू शकते, आणि एकाच जीवाचे स्वरूप जीवप्रकार, वय, गर्दी, माध्यमाची संघटना आणि उष्मायन यांमुळे पाठ्यपुस्तकातील चित्रापेक्षा वेगळे दिसू शकते. म्हणूनच अध्यापन आणि चिकित्सीय कार्यपद्धतींमध्ये EMB वरील वसाहतींच्या स्वरूपावर आधारित ओळख प्राथमिक मानली जाते.

विद्यार्थ्यांसाठी समर्थनीय कार्यपद्धती अशी आहे: विलग वसाहतीचे वर्णन करा — आकार, रंग, केंद्र, तिरप्या प्रकाशातील झळाळी आणि श्लेष्मल स्वरूप; माध्यमाची संघटना, उष्मायनाचा कालावधी व तापमान आणि नियंत्रण नमुने नोंदवा; त्यानंतर कोणतीही पुष्टीकरण चाचणी करण्याआधी नीट विलग वसाहतीचे उपसंवर्धन करून शुद्ध संवर्धन मिळवा. पुढील सामान्य चाचण्यांमध्ये प्राथमिक E. coli आणि कोलिफॉर्म ओळखीसाठी ग्राम रंजनासह IMViC अभिक्रिया, आंत्रीय जीवांसाठी TSI किंवा KIA आणि जीवविशिष्ट जैवरासायनिक चाचणीसंच यांचा समावेश होतो. कामाच्या गरजेनुसार सिरोलॉजिकल, MALDI TOF किंवा इतर प्रमाणित ओळख पद्धती वापरल्या जातात. निवडक आणि विभेदक आंत्रीय माध्यमांमध्ये EMB चे स्थान समजून घेण्यासाठी आंत्रीय संवर्धन माध्यमांच्या परिचयात्मक माहितीचा आणि ग्राम रंजनानंतरच्या तपासण्यांचा संदर्भ घ्या. निळ्या स्लाइड रंजनाने काय सिद्ध होऊ शकते आणि काय नाही या संबंधित प्रश्नासाठी मिथिलीन ब्लू रंजनाचा चित्रसंग्रह याच दृष्टिकोनातून निरीक्षण आणि निष्कर्ष वेगळे ठेवतो.

निष्कर्षापूर्वी निरीक्षण लिहा. "Levine EMB वर 24 तासांनी पाहण्याच्या कोनानुसार बदलणारी हिरवी झळाळी असलेल्या गडद निळसर काळ्या वसाहती; तीव्र लॅक्टोज किण्वनाशी सुसंगत" हे विधान समर्थनीय आहे. "E. coli, पुष्टी झाली" या विधानासाठी पुष्टीकरणाचा टप्पा आवश्यक आहे, जो केवळ प्लेट पुरवू शकत नाही.