Шинэ метилен хөх ба ретикулоцитын будалт: өөр будаг, амьд эсийг будах арга

Нэг оюутан ретикулоцит тоолохоор бэлтгэж, метилен хөх захиалан цустай хольсон ч бараг юу ч олж харахгүй. Харин ангийнх нь өөр оюутан шинэ метилен хөх гэсэн шошготой савтай будаг ашиглаад улаан эсүүдийн заримын дотор тод хөх утаслаг бүтэц харав. Эхний оюутан хоёр дахь савтай будаг илүү шинэ эсвэл илүү өтгөрүүлсэн байх гэж бодно. Аль нь ч биш. Тэр саванд өөр молекул агуулагдаж байгаа юм.

Энэ салбарын ихэнх төөрөгдлийн цаана ийм ойлголтын алдаа байдаг. Нэрнээс нь харахад шинэ метилен хөх нь метилен хөхийн сайжруулсан хувилбар мэт санагдана. Гэвч химийн бүтэц нь өөрийг хэлдэг. Шинэ метилен хөх N нь өөрийн Colour Index дугаар, орлуулагч бүлгүүдийн өөр байрлал, гематологид стандартчилсан өөрийн хэрэглээтэй тусдаа фенотиазины будаг юм. Энэ ялгааг ойлгосны дараа аргын бусад хэсэг буюу будах үед эсүүд яагаад амьд байх ёстой, ямар эсийг ретикулоцит гэж тоолох, Хайнцын биетүүд ямар хамааралтай, бриллиант крезил хөхийг хэзээ хэрэглэх нь тодорхой болно.

Товч хариулт

Гематологийн урвалж болох шинэ метилен хөх N-ийг ерөнхийдөө PubChem дэх шинэ метилен хөхийн бүртгэлд Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, C18H22ClN3S томьёотой гэж тодорхойлдог. Ердийн метилен хөхийг PubChem-ийн бүртгэлд метилтионинийн хлорид, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, C16H18ClN3S томьёотой гэж тэмдэглэсэн байдаг. Бүтцийн хувьд шинэ метилен хөх нь цагираг дээрээ хоёр метил бүлэгтэй бөгөөд метилен хөхийн диметиламино бүлгүүдийн оронд этиламино хажуугийн бүлгүүдтэй. Энэ ялгаа будалтын шинж чанарыг өөрчилдөг. Гематологийн сурах бичгүүдэд ердийн метилен хөхийг ретикулоцит будахад харьцангуй муу, харин шинэ метилен хөхийг илүү тод, жигд буддаг гэж тайлбарладаг. Энэ харьцуулгыг ScienceDirect-ийн шинэ метилен хөхийн тухай сэдэвт нэгтгэн өгүүлсэн байна.

Тийм ээ, шинэ метилен хөх нь суправитал будаг юм. Суправитал будалт гэдэг нь эсийг биеэс гаргасны дараа, бэхжүүлэхээс өмнө амьд байхад нь будахыг хэлнэ. Үүнийг NCBI-ийн суправитал будалтын зарчмын тоймд ийнхүү тодорхойлсон. Шинэ метилен хөх болон бриллиант крезил хөх хоёулаа энэ ангилалд багтдаг бөгөөд CLSI-ийн ретикулоцитын стандарт шинэ метилен хөхийг суправитал будаг гэж тусгайлан авч үздэг. Оюутнууд заримдаа үүнийг бэхжүүлсэн түрхцийн Романовскийн будалттай нэг ойлголтод багтаадаг. Гэвч энд тэр ойлголт тохирохгүй. Эхлээд бэхжүүлбэл арга ажиллахаа болино.

Төстэй нэртэй будгуудыг ялгаж ойлгохыг хүссэн уншигчдад зориулсан метил хөх ба метилен хөхийн харьцуулалт нь анион триарилметаны будаг ба катион фенотиазины бүлгийн хоорондох өөр, илүү өргөн хүрээтэй төөрөгдлийг тайлбарладаг. Лабораторийн будалтын тойм нь суправитал аргыг бэхжүүлсэн түрхцийн аргуудтай хамтатган авч үздэг бол цусны эсийн морфологийн гарын авлага нь ретикулоцитын үнэлгээ цусны эсүүдийг ялган үнэлэх өргөн хүрээнд ямар байр суурьтайг харуулдаг.

Каталогтой холбоотой нэг анхааруулга: шинэ метилен хөхийн цайрын хлоридтой давхар давсны тусдаа хэлбэр CAS 6586-05-6 дугаартай байдаг. Тиймээс арга зүйн хэсэгт зөвхөн түгээмэл нэрийг бус, давсны хэлбэр болон нийлүүлэгчийг нэрлэх хэрэгтэй.

Суправитал будалт үнэндээ юу хийдэг вэ?

Ретикулоцит бол бөөмөө алдсан боловч рибосомын РНХ-ийн үлдэгдэл агуулсан залуу улаан эс юм. Будаагүй нойтон бэлдцэд тэр РНХ харагддаггүй. Суправитал будаг амьд эсэд нэвтэрч, РНХ-ийг тунадасжуулах эсвэл бөөгнөрүүлэх замаар хөх мөхлөг, утаслаг бүтэц үүсгэдэг. Эдгээр нь тосон иммерсийн үед харагддаг торлог-утаслаг материал юм. Иймээс энэ тор нь будаг орохыг хүлээж буй урьдчилан үүссэн араг бүтэц биш, харин будалтын үр дүнд үүссэн бүтэц юм. Тийм ч учраас протоколын хувьсагчид буюу будгийн концентраци, буфер, цус ба будгийн харьцаа, температур, хугацаа нь будгийн нэрээс дутахгүй чухал байдаг.

Практикт үүнээс ажиллагааны хатуу дараалал урган гарна: эхлээд бүлэгнэлтээс сэргийлсэн цусыг будагтай хольж, инкубацлан, дараа нь түрхэц бэлтгээд бэхжүүлэлгүй, нэмэлт будалтгүйгээр шинжилнэ. Будахаас өмнө бэхжүүлэх, эсвэл бүдэг утаслаг бүтцийг халхлах нэмэлт будалт хийх нь тооллогын үндэс болох мэдээллийг алдагдуулдаг.

Шинэ метилен хөхөөр ретикулоцит будах практик протокол

Бүх тохиолдолд тохирох ганц найрлага байдаггүй тул хэрэглэсэн найрлагаа тайлагнах хэрэгтэй. Баримтжуулсан гурван хувилбар нь хэрэглээний хүрээг харуулна.

Брехерийн сонгодог аргаар ойролцоогоор 0.5 хувийн шинэ метилен хөхийг калийн оксалаттай хамт хэрэглэж, сайтар хольсон EDTA-тай цустай ижил эзлэхүүнээр холиод өрөөний температурт ойролцоогоор 10–15 минут инкубацлана. Зөөлөн дахин хольсны дараа нимгэн шаантаг хэлбэрийн түрхэц бэлтгэж, агаарт хатаагаад бэхжүүлэлгүйгээр 100x тосон иммерсийн объективоор шинжилнэ. NCBI-ийн ретикулоцит тоолох аргачлалд энэ ажиллагааны дараалал болон түүнд ашиглах тоолох хүрээг тайлбарласан байдаг.

Дейси ба Льюисийн хувилбарт цитраттай давсны уусмал дахь 1.0 хувийн шинэ метилен хөхийг цусны 2–4 эзлэхүүнтэй хольж, түрхэц бэлтгэхийн өмнө 37 C-д 15–20 минут байлгана. CLSI H44 аргачлалыг уялдуулан хэрэгжүүлсэн сүүлийн үеийн нэг судалгаанд pH 7.4 бүхий фосфатын буферт давсны уусмал дахь илүү шингэн, 0.1 хувийн уусмалыг хэрэглэж, 20 C-д 10 минут инкубацлан, бэхжүүлэлт хийгээгүй гэж 2026 оны NMB-ийн аргуудыг уялдуулах судалгаанд мэдээлсэн байна.

Тоолох дүрэм нь эдгээр хувилбарт ижил. Эс дотор дор хаяж хоёр тусдаа хөхөөр будагдсан мөхлөг эсвэл утаслаг хэсэг байвал ретикулоцит гэж тоолно. Ингэснээр ганц будгийн тунадасыг тоолохоос сэргийлнэ. Өдөр тутмын шинжилгээнд дор хаяж 1,000 улаан эс тоолж, ретикулоцитын хэмжээг хувиар тайлагнана. Хувь бага үед статистикийн хувьд илүү олон эс тоолох шаардлагатай. Ретикулоцитын хэмжээ 1 хувь орчим байхад тооллогын хэлбэлзлийг 5 хувь болгохын тулд ойролцоогоор 4,400 эс тоолох шаардлагатайг CLSI H44 арга зүйн тоймд тэмдэглэсэн бөгөөд энэ нь De Gruyter дэх CLSI H44-ийн тоймд бий. Миллерийн окулярын диск нь олон эс тоолох ажлыг хөнгөвчилдөг. Будгийн тунадас мөхлөгт оршихуунтай төстэй харагддаг тул будгийг шүүх эсвэл шинээр бэлтгэх хэрэгтэй.

Ижил бэлдцэд харагдах Хайнцын биетүүд

Суправитал аргаар будсан тэрхүү түрхцэд Хайнцын биетүүдийг мөн харж болно. Эдгээр нь РНХ-ийн үлдэгдэл биш, харин исэлдэж, денатурацид орсон гемоглобины бөөгнөрөл юм. Шинэ метилен хөхөөр будсан бэлдцэд тэдгээр нь дугуй биет хэлбэртэй, ихэвчлэн ганц, мембраны ойролцоо байрласан байх бөгөөд торлог-утаслаг материалаас цайвар хөхөөр будагдана. Бэхжүүлэлт болон нэмэлт будалтын дараа тэдгээр нь муу хадгалагддаг тул бэхжүүлээгүй түрхцийг шинжлэх хэрэгтэй. Сүүлийн үеийн нэг протоколд 20 микролитр EDTA-тай цусыг 20 микролитр 1 хувийн шинэ метилен хөхтэй хольж, 15 минут инкубацлаад, 250 эритроцитын дундах Хайнцын биеттэй эсүүдийг тоолсон гэж энэ аргачлалыг тайлагнасан PMC судалгаанд өгүүлсэн байна.

Хоёр ялгааг мэдэх нь буруу тайлбарлахаас сэргийлнэ. Нэгдүгээрт, метил нил ягаан болон кристалл нил ягаан нь Хайнцын биетүүдийг шинэ метилен хөхөөс илүү хүчтэй буддаг. Үүнийг ScienceDirect-ийн Хайнцын биетийн тухай сэдэвт тэмдэглэсэн байдаг. Шинэ метилен хөх нь ретикулоцит болон Хайнцын биетүүдийг хамт үнэлэхэд тохиромжтой сонголт болохоос Хайнцын биетийг тусгайлан будах хамгийн хүчтэй будаг биш. Хоёрдугаарт, альфа талассемийн тээгчийн HbH оршихуунууд суправитал будалтын дараа эс даяар олон жижиг цэг үүсгэдэг бол сонгодог Хайнцын биетүүд цөөн, том, ихэвчлэн мембрантай холбоотой байдаг. Гурав дахь төстэй харагдах зүйл нь будгийн тунадас юм: энэ нь эсүүдийн фокусын хавтгайн гадна байрлаж, харах талбай бүрд өөр байдаг.

Бриллиант крезил хөх ба шинэ метилен хөх

Хоёр будаг хоёулаа ретикулоцитын суправитал будаг боловч стандартчиллын хувьд нэгийг нь илүүд үздэг. Гематологийн стандартчиллын олон улсын зөвлөлтэй хамтран боловсруулсан, CLSI H44 стандартын хуудсанд жагсаасан CLSI H44-A2 ретикулоцитын арга нь EDTA-тай цусыг шинэ метилен хөхөөр будахыг гар аргаар харьцуулах арга болгон тогтоосон. Гематологийн сонгодог сургалт ч дүрслэлийн хувьд үүнтэй нийцдэг: шинэ метилен хөх нь утаслаг бүтцийг илүү тод, жигд буддаг бол бриллиант крезил хөхийн будалт үйлдвэрлэлийн цуврал болон сорьц хооронд илүү их ялгаатай байдаг.

Гэхдээ энэ байр суурийг тодруулан тайлбарлах хэрэгтэй. ICSH-ийн анализатор үнэлэх удирдамж нь шинэ метилен хөхөөр будсан бэлдцийг гар аргаар микроскопоор шинжлэхийг лавлагаа харьцуулалтын арга гэж зөвшөөрдөг ч үүнийг субъектив, харьцангуй нарийвчлал багатай гэж үзэж, боломжтой үед урсгал цитометрийн лавлагаа аргуудыг илүүд үздэг. 2022 онд 100 сорьцыг харьцуулсан судалгаанд хэрэглэсэн анализаторын үр дүнтэй харьцуулахад бриллиант крезил хөх нь шинэ метилен хөхөөс бага системчилсэн зөрүүтэй байсан гэж будалтын аргуудыг харьцуулсан PMC судалгаанд мэдээлжээ. Оюутнуудад өгөх үндэслэлтэй дүгнэлт нь: шинэ метилен хөхийг стандартчилсан гар аргын харьцуулах арга болгон ашигла; тухайн лабораторийн бриллиант крезил хөхийн аргыг үүнтэй эсвэл автоматжуулсан аргатай харьцуулан баталгаажуул; аль ч будгийг хэрэглэсэн гар аргын микроскопийн үр дүн илүү өргөн хэлбэлзэлтэй байна гэж тооц. Худалдааны будгийн цувралууд хоорондоо ялгаатай байсан тул стандартчиллын өмнөх үеийн судалгаанууд цэвэршүүлсэн Azure B-ийг химийн хувьд илүү цэвэр хувилбар болгон дэмжиж байв. Үүнийг Azure B-ийн тухай Маршаллын судалгаанд өгүүлсэн нь арга зүйн хэлэлцүүлэгт урвалжийн цэвэршлийн зэрэг яагаад одоо ч дурдагддагийг тайлбарладаг.

Түгээмэл алдаанаас зайлсхийх нь

Амжилтгүй бэлдцийн ихэнх нь дөрвөн алдаатай холбоотой. Шинэ метилен хөх N-ийн оронд ердийн метилен хөх захиалбал техникээс бус, химийн ялгаанаас шалтгаалан сул будалт үүснэ. Үнэлэхээс өмнө бэхжүүлэх эсвэл нэмэлт будалт хийх нь суправитал дохиог арилгана. Будгийн тунадасыг мөхлөг гэж тоолох нь үр дүнг хэт өсгөдөг бөгөөд хоёр мөхлөгийн дүрэм, шүүсэн будаг үүнээс сэргийлнэ. Ретикулоцитын хувь бага үед хэт цөөн эс тоолбол нарийн мэт харагдах боловч итгэлцлийн хязгаар нь өргөн тоо гарна. Эдгээр алдаа бүгд ижил дүр зурагтай: урвалжийн шатанд аль хэдийн шийдэгдсэн үр дүнгийн төлөө микроскопоор шинжилж буй хүн микроскопоо буруутгадаг.