Метилений хөхийн митохондрид үзүүлэх нөлөөг хэмжих нь: хүчилтөрөгч, ATP ба мембраны потенциал

Лаборатори амьсгал нь алдагдсан митохондрид метилений хөх нэмж, хүчилтөрөгчийн хэрэглээ нэмэгдэхийг ажиглалаа гэж бодъё. Тэгэхэд будагч бодис митохондрийн үйл ажиллагааг сэргээсэн гэж бичих нь хамгийн ойлгомжтой мэт санагдана. Гэвч энэ өгүүлбэр буруу байж болно. Хүчилтөрөгчийн урсгал, ATP-ийн нийлэгжилт, мембраны потенциал нь гурван өөр ойлголт юм. Нөөцлөх, синхрончлох, хуваалцах үйлдлүүд нэг үүлэн хавтсыг ашигладагтай адил эдгээр нь нэг эрхтэнцэрт явагддаг: хоорондоо холбоотой ч өөр өөр зарчмаар зохицуулагдана. Нэгийг нь нөгөөгөөр андуурвал хэмжилт бүр техникийн хувьд зөв байсан ч тайлбар нь буруу болно.

Метилений хөх хэмжиж буй системдээ өөрөө оролцдог тул ийм андуурал үүсэх магадлалыг нэмэгдүүлдэг. Энэ нь гинжин хэлхээний өмнөх хэсгээс электрон хүлээн авч, дараах хэсэгт өгдөг исэлдэн ангижрах мөчлөгт оролцогч; энергижсэн митохондрид хуримтлагддаг липофиль катион; мөн түгээмэл зондуудтай ижил спектрийн мужид гэрэл шингээж, цацруулдаг тод хөх нэгдэл юм. Нэг үзүүлэлт эдгээр бүх нөлөөг ялгаж чадахгүй. Будапештийн митохондрийн судалгаануудад хэрэглэсэн найдвартай арга нь хүчилтөрөгчийн урсгал, ATP-ийн нийлэгжилтийн хурд, мембраны потенциал, устөрөгчийн хэт ислийн ялгаралтыг хамтад нь хэмжиж, алхам бүрд будагч бодист зориулсан хяналт хийх явдал юм.

Респирометр энергийн гарцыг бус, хүчилтөрөгчийн урсгалыг хэмждэг

Oroboros Oxygraph эсвэл Seahorse эсийн гаднах урсгалын анализатор ашигласан өндөр нарийвчлалтай респирометр нэг л зүйлийг харуулдаг: хүчилтөрөгч хэр хурдан ангижирч байгааг. Энэ нь нэг электронд хэдэн протон шахагдсан, градиент хэр хэмжээгээр хадгалагдсан, эсвэл ATP синтаза түүнийг ашигласан эсэхийг харуулахгүй.

Нэр томьёо чухал. Тусгаарласан митохондрид ADP-гүй субстрат нь протоны алдагдалтай амьсгалыг, ханасан түвшний ADP-тай субстрат нь исэлдэлтийн фосфоржилтын хүчин чадлыг, холбоос салгагчийн титрлэлт нь электрон дамжуулалтын дээд хүчин чадлыг харуулна. Бүтэн эсэд Seahorse-ийн харгалзах үзүүлэлтүүд нь суурь амьсгал, олигомицинд мэдрэг ATP-тэй холбоотой амьсгал, протоны алдагдал, FCCP-ээр тогтоосон дээд амьсгал, ротенон болон антимицинд тэсвэртэй митохондрийн бус хүчилтөрөгчийн хэрэглээ юм. Seahorse-ийн үр дүнг 3-р төлөв ба 4-р төлөв гэж нэрлэх нь тухайн бэлдцийн хувьд үндэслэлгүй нарийвчлал илэрхийлж байгааг Agilent Mito Stress Test-ийн арга зүйн хүрээ тодорхой харуулдаг.

Метилений хөх нь хүчилтөрөгч ихсэх тусам энерги ихсэнэ гэсэн зөн совингийн холбоог эвддэг. Тусгаарласан тархины митохондрийн судалгаанд дурдсанаар, далайн гахайн тархинаас тусгаарласан митохондрид 100 nM-аас 1 uM будагч бодис нэмэхэд глутамат ба малат, сукцинат, альфа-глицерофосфатын субстраттай үеийн тайван төлөвийн хүчилтөрөгчийн хэрэглээ нэмэгдсэн бөгөөд альфа-глицерофосфаттай үед ойролцоогоор 64 хувиар өссөн. Гэсэн ч хэвийн митохондрийн ADP-ээр өдөөгдсөн амьсгал үндсэндээ өөрчлөгдөөгүй. Протоны алдагдалтай амьсгал нэмэгдэж, ADP-ээр өдөөгдсөн урсгал тогтвортой үлдсэн тул тооцоолсон амьсгалын хяналтын харьцаа буурна. Энэ бууралт нь будагч бодис митохондрийг гэмтээсэн гэсэн үг биш. Харин хэвийн амьсгал дээр хүчилтөрөгч хэрэглэдэг исэлдэн ангижрах мөчлөг нэмэгдсэн гэсэн үг. Метилений хөхийн хүчилтөрөгчийн хэрэглээний шинжилгээ зөвхөн өсөлтийг мэдээлж байвал бодит химийн үйл явцыг хэмжсэн боловч энергийн хадгалалтын талаар юу ч хэлээгүй байна.

Сэргэлтийг шалгасан туршилтууд мөн энэ зөрүүг илүү том хэмжээнд харуулдаг. I комплексийг хориглоход хүчилтөрөгчийн урсгал ойролцоогоор гурав дахин сэргэсэн бол ATP-ийн нийлэгжилт ердөө 1.5 дахин орчим сэргэсэн. Электродод илүү их хүчилтөрөгч хүрсэн. Гэвч түүний бага хэсэг нь ATP үүсгэхэд зарцуулагдсан. Исэлдэлтийн фосфоржилт сайжирсан гэж дүгнэхийн тулд ATP-ийн талын хэмжилт хэрэгтэй бөгөөд боломжтой бол үүнийг хүчилтөрөгчид ногдох ATP-ийн харьцаагаар илэрхийлж, хуваарийг хэрхэн тодорхойлсноо заах ёстой.

ATP-ийн шинжилгээ нийлэгжилтийн хурдыг хэмждэг бөгөөд агууламж түүнийг орлож чадахгүй

ATP-ийн шинжилгээ өөр асуултад хариулдаг: нэгж хугацаанд хэр их ATP үүсэж байна вэ? Гэрэлт цохын люциферазын гэрэлтэлтийг минутын турш дагах эсвэл гексокиназа ба глюкоз-6-фосфат дегидрогеназыг хослуулсан шинжилгээг 340 nm-д унших зэрэг кинетик хэмжилт нь хурдыг өгдөг. Нийт ATP-ийг нэг эцсийн цэгт хэмжих нь агууламжийг өгнө. Энэ агууламж нь нийлэгжилтээс хэрэглээг хассан үр дүнг илэрхийлэх бөгөөд дангаараа исэлдэлтийн фосфоржилтын талаар бага мэдээлэл өгдөг.

Будапештийн баг аденилат киназыг дарангуйлсан нөхцөлд хосолсон ферментийн аргыг ашиглаж, 1-ээс 2 uM метилений хөх ротенон болон антимицинээр боловсруулсан митохондрийн ATP үүсэлтийг бага хэмжээгээр боловч статистикийн ач холбогдолтой нэмэгдүүлснийг тогтоосон. Энэ нь бодит сэргэлт боловч хэсэгчилсэн сэргэлт юм. TEGDMA-ийн хоруу чанарын судалгаа өөр загварт ижил төрлийн үр дүнд хүрсэн: 5 mM шүдний материалын мономер TEGDMA нь I комплекстэй холбоотой амьсгалыг ойролцоогоор 286-аас 28 урсгалын нэгж хүртэл унагаасан бөгөөд 2 uM будагч бодис үүнийг ойролцоогоор 86 хүртэл сэргээсэн.

Өнгөт исэлдэн ангижрах нэгдэлтэй ажиллахад хоёр хяналтыг заавал хийх ёстой. Нэгдүгээрт, хэмжсэн ATP-ийн нийлэгжилтийн хэр их хэсэг нь ATP синтазагаас хамаарч байгааг тогтоохын тулд олигомицин хэрэглэнэ. Хоёрдугаарт, мэдэгдэж буй хэмжээний ATP, бүрэн урвалж, туршилтад хэрэглэсэн яг ижил будагч бодисын концентрацийг хослуулж, эсгүй орчинд нэмсэн ATP-ийн нөхөн илрүүлэлтийг шалгана. Наад зах нь 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, 2 uM концентрацийг хамруулах ёстой. Будагч бодис цацарсан гэрлийг шингээх, дохио үүсгэгч ферментийг дарангуйлах, эсвэл урвалжийн исэлдэн ангижрах химийг өөрчилж болно. Люциферазын шинжилгээний ерөнхий зөвлөмж нь яг ийм төрлийн хөндлөн нөлөөг илрүүлэх биохимийн эсрэг шалгалтуудыг зөвлөдөг. Унтралт ихэвчлэн өндөр концентрацид илүү хүчтэй байдаг гэдгээр 1 uM-д хэмжилтийн гажуудал байхгүй гэж бүү үз.

Мембраны потенциалын зондууд урсгалыг бус, будагч бодисын тархалтыг хэмждэг

Сафранин O, TMRM ба TMRE, родамин 123, JC-1 нь бүгд мембран нэвтрэх чадвартай катионууд юм. Тэд электрохимийн тэнцвэрийн дагуу сөрөг цэнэгтэй матрикст хуримтлагддаг тул нийт флюоресценц нь зонд хаана байрлаж байгаагаар дамжуулан потенциалыг шууд бусаар харуулна. Эдгээрийн аль нь ч ATP эсвэл электроны урсгалыг хэмждэггүй.

Зонд бүрд илүү тохирох бэлдэц бий. Сафранин O нь тусгаарласан митохондри болон мембраны нэвчимхий чанарыг нэмэгдүүлсэн эсэд тохирдог. Үүнийг ихэвчлэн ойролцоогоор 2 uM концентрацид, 495 nm орчмын өдөөлт, 585 nm орчмын цацаргалтаар ашиглах бөгөөд зондын шингээлт нийт флюоресценцийг өөрчилдөг унтралтын горимд ажиллуулдаг. TMRM ба TMRE нь бүтэн эсэд наномолийн бага түвшний ачаалалтай, унтралтгүй горимд тохирно. Энэ үед деполяризаци будагч бодисыг гадагшлуулж, митохондрийн флюоресценц буурдаг; өндөр ачааллын үед өөрөө унтрах үзэгдлээс болж дохионы чиглэл урвуу болж болно. JC-1 нь хэрэглэхэд хялбар ногоон-улаан дохионы харьцаа өгдөг ч ачаалал болон митохондрийн массаас хамаардаг тул нарийн хяналттай TMRM-ээс тоон хэмжилтэд сул байдаг. Эдгээр давуу болон сул талыг өргөн хэрэглэгддэг митохондрийн мембраны потенциалын зондуудын тоймд нэгтгэн тайлбарласан.

Метилений хөх яг ажлын концентрацид оптикийн хөндлөн нөлөө үзүүлдэг. Түүний 600-аас 665 nm орчмын шингээлтийн зурвасууд улаан зондын цацаргалттай давхцдаг тул дотоод шүүлтүүрийн нөлөө, унтралт, өдөөлтийн гэрлийн шингээлт бүгд үүсэх боломжтой. Түүнчлэн энэ будагч бодис нь хоёр дахь липофиль катион бөгөөд өөрийн тархалт нь хэмжиж буй потенциалаас хамааран өөрчлөгдөнө. Үүнээс хамгаалах арга нь давхар хэмжилт ба хоосон хяналтууд юм: зөвхөн зонд, зөвхөн будагч бодис, зонд дээр будагч бодисын концентраци тус бүрийг нэмсэн нөхцөл, тэг утгын жишиг болгон FCCP-ээр бүрэн деполяризаци хийх, боломжтой бол оптикийн хувьд ялгаатай хоёр дахь зонд хэрэглэх. III комплексийг тойрон гарах замын судалгаа антимицин болон миксотиазолоор дарангуйлсны дараах мембраны потенциалын сэргэлтийг сафранин O болон TMRM хоёроор давтан хэмжиж, чанарын хувьд ижил сэргэлт ажигласнаар энэ аргын жишгийг тогтоосон. Нэг оптик дохио үүсгэгч нь сэжүүр. Хоёр бие даасан дохио үүсгэгч нь нотолгоо.

Гурван бэлдэц, гурван өөр асуулт

Тусгаарласан митохондри, мембраны нэвчимхий чанарыг нэмэгдүүлсэн эс, бүтэн эс нь нэг шинжилгээний сольж хэрэглэж болох мэдрэг чанарын тохиргоо биш. Эдгээр нь өөр өөр ажиллагааны зарчимтай, ялгаатай ойлголтууд юм.

Тусгаарласан митохондри нь электрон зөөвөрлөх гинжин хэлхээ, дотоод мембран, матриксын үйл ажиллагааны тогтолцоог хадгалж, плазмын мембран, цитозоль, сүлжээний бүтцийг зайлуулдаг. Зайлуулах нь өөрөө зорилго нь юм: субстрат, ADP, дарангуйлагч, будагч бодисын концентрацийг яг таг тогтоодог тул тодорхой замыг ялган тогтоож болно. Үүний сул тал нь байгалийн субстратын хангамж, дохиолол, хэрэгцээ алдагдах явдал.

Мембраны нэвчимхий чанарыг нэмэгдүүлсэн эс нь митохондрийг эсийн бүтцийнх нь ихэнх хэсэгт хадгалж, нээгдсэн плазмын мембранаар гаднаас өгсөн субстрат болон ADP-ийг нэвтрүүлдэг. Эсийн орчинд субстратын замын аль хэсэгт доголдол байгааг тогтооход энэ нь тохирох хэрэгсэл юм. Нэвчимхий чанарыг хэт нэмэгдүүлэхэд гадна мембран гэмтэж, цитозолийн зохицуулагч хүчин зүйлс угаагдан гардаг.

Бүтэн эс бүхнийг хадгална: плазмын мембраны саад, цитозолийн ангижруулагчид, дотоод субстратын зөөвөрлөлт, митохондрийн сүлжээ, ATP-ийн хэрэгцээ. Эдгээр нь физиологид хамгийн ойр, харин механизмыг ялган тогтоохоос хамгийн хол байдаг. Учир нь будагч бодисын шингээлт, ангижрал, тусгаарлагдан хуримтлагдах үйл явц бүгд митохондрид бодитоор хүрэх хэмжээнд нөлөөлдөг.

TEGDMA-ийн судалгаа эдгээр гурван түвшинг зориуд ашигласан: исэлдэлт ба потенциалыг будагч бодисоор сэргээхийг шалгахад тусгаарласан тархины митохондри; гэмтлийн байрлалыг голчлон I комплекстэй холбоотой субстратын исэлдэлтэд хамааруулахын тулд мембраны нэвчимхий чанарыг нэмэгдүүлсэн шүдний зөөлцийн үүдэл эс; дарангуйлагдсан хүчилтөрөгчийн хэрэглээнд 2 uM будагч бодисын үзүүлэх физиологийн цэвэр нөлөөг шалгахад бүтэн үүдэл эс ашигласан. Өөр өөр бэлдцийн митохондрийн үзүүлэлтүүдийг харьцуулж буй уншигчдад метилений хөх амьсгалын гинжин хэлхээгээр электроныг хэрхэн дамжуулдаг тухай дагалдах тайлбар нь замын суурь мэдээлэл өгнө. Харин метилений хөхийн амьсгалын судалгааг унших гарын авлага нь концентраци болон дарангуйлагч ашиглах логикийг авч үздэг.

Исэлдэн ангижрах идэвхтэй будагч бодист шаардагдах хяналтууд

Исэлдэн ангижрах мөчлөгт оролцогчид ердийн дарангуйлагчаас илүү урт хяналтын жагсаалт хэрэгтэй. Учир нь зөвхөн будагч бодисоос үүсэх химийн урвал биологийн үйл явцыг дуурайж болно.

Респирометрийн хувьд суурь дохионы шилжилтийг шалгах зөвхөн буфертэй камер, биологийн материалгүй буфер ба будагч бодистой камер, будагч бодис дээр шинжилгээнд байгаа эсийн гаднах аливаа ангижруулагчийг нэмсэн нөхцөл, мөн бүтэн эсийн митохондрийн бус хүчилтөрөгчийн хэрэглээг тодорхойлох төгсгөлийн ротенон ба антимицин нэмэлтийг хэрэглэнэ. Ангижирсан будагч бодис хүчилтөрөгчид электрон шилжүүлж, устөрөгчийн хэт исэл үүсгэн дахин исэлддэгийг анхаар. Иймээс электрон өгөгчгүй, зөвхөн будагч бодистой хоосон хяналт нь NADH эсвэл NADPH бий болоход үүсэх эсгүй орчны хүчилтөрөгчийн хэрэглээг дутуу үнэлнэ.

Устөрөгчийн хэт ислийн хувьд сонгомол бус DCFDA будагч бодисоос илүүтэй шалгалт тохируулга хийсэн Amplex UltraRed ба тунхууны пероксидазыг сонгож, каталазаар баталгаажуулан, гэрэлтүүлгээс хамаарах эсэхийг шалгана. Учир нь будагч бодис гэрэлд мэдрэгжүүлэгч юм. Тархины митохондрийн судалгаанд ердөө 100 nM будагч бодистой үед хэт ислийн ачаалал дөрөв дахинаас илүү нэмэгдэж, зайлуулах явц удааширсан бөгөөд хэт исэл нь супероксидын завсрын үе шатгүйгээр ангижирсан будагч бодисоос шууд үүссэн. Зондын сонголт болон гэрлийн хяналтын дэлгэрэнгүйг будагч бодисын туршилтад хүчилтөрөгчийн идэвхтэй хэлбэрүүдийг хэмжих тухай дагалдах нийтлэлд авч үзсэн. Харин хэт исэл хэзээ дохио, хэзээ ачаалал болдог тухай өргөн хүрээний асуултыг эсийн исэлдэн ангижрах тэнцвэр ба антиоксиданттай холбоотой мэдэгдлүүдийн хамт тайлбарласан.

Замын тухай дүгнэлт хийхдээ III комплексийн дарангуйлагч холбогдох хоёр байрлалыг хоёуланг нь шалгана: Qi байрлалд антимицин A, Qo байрлалд миксотиазол хэрэглэж, нэмэлтээр цианидаар IV комплексийн эцсийн цэгийг шалгана. Хулганы тархины өмнөх судалгаанд будагч бодис ротеноноор хориглосон амьсгалыг сэргээсэн боловч антимициноор хориглосон амьсгалыг сэргээгээгүй гэж мэдээлсэн. Харин дараах гурван зүйлийг хамарсан судалгаанд хоёр дарангуйлагчийн аль алинтай нь хэсэгчилсэн сэргэлт ажиглагдаж, цитохром c шууд ангижирдаг нотолгоо олдсон. Будагч бодисын концентраци, дарангуйлагчийн байрлал, субстратын төлөв, будагч бодисын тархалт бүгд ажиглагдах замыг өөрчилдөг тул тойрон гарах замыг бүрэн тогтоогдсон гэж бус, шинэ өгөгдөлтэй нийцэж байна гэж үзэх хэрэгтэй.

Шинжилгээ сонгох хүснэгт

Энэ хүснэгтийг ашиглан хэмжилтээс асуулт гаргах бус, асуултадаа тохирох хэмжилтийг сонго.

Үндэслэлтэй дүгнэлт хийхэд шаардагдах хамгийн бага багц нь ижил будагч бодисын концентрациуд болох 100 nM, 300 nM, 1 uM, 2 uM-д протоны алдагдалтай, ADP-тай, олигомицинтэй, холбоос салгагчтай нөхцөл дэх хүчилтөрөгчийн урсгал; ATP-ийн нийлэгжилтийн хурд; боломжтой бол хоёр зондоор хэмжсэн мембраны потенциал; каталаза болон эсгүй хяналттай, шалгалт тохируулга хийсэн хэт ислийн ялгаралтыг хэмжих явдал юм. Хоорондоо холбоотой багцыг мэдээл: хүчилтөрөгчийн урсгал, ATP-ийн хурд, хүчилтөрөгчид ногдох ATP, потенциал, хэт исэл. Эдгээр тооны аль нэг нь дангаараа утга тайлбараа хүлээж буй хэмжилт төдий юм.