Метилений хөхийн туршилтад хүчилтөрөгчийн идэвхт хэлбэрүүдийг хэмжих нь

Хоёр лаборатори тус бүр метилений хөхийн антиоксидант нөлөөг судалж байна гэж нэрлэсэн туршилт явуулжээ. Нэг нь энэ будаг хүчилтөрөгчийн идэвхт хэлбэрүүдийг дарангуйлдаг гэж мэдээлэв. Нөгөө нь тэдгээрийг үүсгэдэг гэж мэдээлэв. Хоёул тодорхой тун–хариу урвалын муруй үзүүлсэн. Хоёул үнэнчээр ажилласан. Ялгаа нь залилан эсвэл чадваргүй байдалд биш. Харин хоёр баг өөр өөр гэрэлтүүлгийн нөхцөлд, өөр өөр асуултад хариулдаг зонд ашиглан өөр өөр зүйлийг хэмжээд, хоёр хариугаа ижил үгээр буюу ROS гэж тодорхойлсонд оршино.

Метилений хөхийг нарийн хэмжихэд хүндрэлтэй байдгийн шалтгаан нь ажиглах ёстой химийн урвалдаа өөрөө оролцдогт байдаг. Харанхуйд донор ба акцепторын хооронд электрон зөөвөрлөөд, анхны хэлбэртээ буцаж, дахин мөчлөгт ороход бэлэн болдог. Гэрэлд фотосенсибилизатор болж, өдөөгдсөн триплет төлөвт хүрнэ. Энэ төлөвөөс хүчилтөрөгчид энерги дамжуулж синглет хүчилтөрөгч үүсгэх, эсвэл электрон дамжуулж радикал болон устөрөгчийн хэт исэл үүсгэх боломжтой. Ийм системд оруулсан ямар ч зонд будагнаас болж исэлдэх, ангижрах, өнгөө алдах эсвэл оптикийн хувьд халхлагдаж болно. Тиймээс ROS-ийн аливаа хэмжилтэд хамгийн түрүүнд асуух зүйл нь тоон утга хэд гарсан бэ гэдэг биш. Харин шинжилгээ яг юуг илрүүлдэг, будаг тухайн шинжилгээнд хэрхэн нөлөөлдөг вэ гэдэг юм.

Amplex Red: калибровк хийсэн устөрөгчийн хэт ислийн шинжилгээ

Зөв тохируулсан тохиолдолд метилений хөх ба Amplex Red-ийн хослол нь энэ чиглэлийн судалгаанд хамгийн үндэслэлтэй хослол юм. Урвалын хими нь өвөрмөц: тунхууны пероксидаза устөрөгчийн хэт ислийг ашиглан Amplex субстратыг флуоресценцтэй бүтээгдэхүүн болох резоруфин болгон исэлдүүлдэг бөгөөд стехиометрийн харьцаа нь ойролцоогоор нэгийг нэгтэй харьцуулсан байна. Дээж дэх хэт исэл илрүүлэгч дээр флуоресценц болж хувирна. ROS-ийн түгээмэл бүлэгт багтах өөр ямар ч бодис энэ урвалыг шууд явуулдаггүй.

Шийдвэрлэх давуу тал нь калибровк юм. Нягт нямбай судлаач ижил буфер, ижил пероксидаз ба субстратын концентраци, ижил инкубацийн хугацаа, ижил оптикийн тохиргоонд мэдэгдэж буй агууламжтай хэт ислийн стандартуудыг хэмжиж, дараа нь дээжүүдийн утгыг тэр муруйтай харьцуулдаг. Энэ аргын тулгуур болсон, тархинаас тусгаарласан митохондрийн судалгаанд зохиогчид яг ингэж ажилласан: туршилт бүрийн төгсгөлд мэдэгдэж буй хэмжээний хэт исэл нэмж, үр дүнг флуоресценцийн дурын нэгжээр биш, нэг миллиграмм уурагт ногдох минут тутмын пикомолоор илэрхийлсэн хурд болгон мэдээлжээ. Ингэж л гэрэлтэлтийг хэмжилт болгодог.

Тэр судалгааны гурван нарийн зүйлийг дуурайн хэрэгжүүлэх нь зүйтэй. Нэгдүгээрт, зохиогчид хэт ислийг задалдаг каталаза ашиглан дохиог баталгаажуулсан. Каталаза нэмэхэд метилений хөхөөс үүдсэн флуоресценцийн өсөлт зогссон нь дохио оптикийн артефакт биш, хэт исэл болохыг баталжээ. Хоёрдугаарт, тэд өдөөгч гэрлийн цацрагийг хаалтаар тасалж, дээжид ердийн гэрлийн тунгийн наймны нэгийг өгсөн нөхцөлд гэрэлтүүлгийн нөлөөг шууд шалгахад дохио ердөө есөн хувиар буурсан. Тэдний мэдээлсэн хэт ислийн ерэн хувиас илүү нь хэмжилтийн гэрлээс үл хамаарч байв. Гуравдугаарт, тэд хэт ислийн зайлуулалтыг электродоор тусад нь хэмжээд, будаг үүсэлтийг нэмэгдүүлэхийн зэрэгцээ зайлуулалтыг удаашруулдаг болохыг тогтоосон. Зөвхөн цэвэр флуоресценцийн дохио мэдээлдэг зонд энэ хоёр нөлөөг хооронд нь ялгахгүй байх байв.

Энэ шинжилгээнд алдаа гарах боломж хэвээр байдаг бөгөөд метилений хөх тэдгээрийн хэд хэдийг нь үүсгэдэг. Будаг резоруфины цацаргалт явагддаг улаан мужид өргөн хүрээгээр гэрэл шингээдэг тул өндөр концентрацитай үед дээж дотоод шүүлтүүрийн нөлөөгөөр өөрийн дохиог халхалж болно. Иймээс стандартууд дээжтэй ижил будагны концентрацитай байх ёстой. Amplex Red өөрөө ч гэрлийн нөлөөгөөр исэлдэж болох бөгөөд түүний бүтээгдэхүүн резоруфин супероксид, хэт исэл үүсгэдэг фотоисэлдэн-ангижрах мөчлөгт орж болно. Туршилтаар фотосенсибилизаторыг давхар гэрэлтүүлж байгаа үед энэ нь онцгой ач холбогдолтой. Практик шийдэл нь будаг ба зондыг хамтад нь гэрэлтүүлэхийн оронд эхлээд метилений хөхтэй дээжийг гэрлээр шарж, дараа нь тодорхой эзлэхүүнтэй хэсгүүдийг Amplex урвалжуудаар харанхуйд шинжлэх явдал юм. Эцэст нь, супероксид дисмутаза Amplex-ийн дохиог зүгээр л бууруулдаггүй: супероксидыг хэт исэл болгон хувиргаснаар дохиог нэмэгдүүлж болно. Флуоресценцийг нэмэгдүүлсэн SOD хяналт бүтэлгүйтсэн гэсэн үг биш. Харин урвалын өмнөх шатанд супероксид байгааг илрүүлсэн гэсэн үг.

DCFDA: өвөрмөц бус исэлдэлтийн индикатор

Метилений хөх ба DCFDA-ийн хослол нь ихэнх төөрөгдлийн эх үүсвэр болдог. DCFH-DA нь эсэд нэвтрүүлдэг урьдал нэгдэл юм. Эс доторх эстеразууд ацетат бүлгүүдийг нь салгаж, флуоресценцгүй DCFH үлдээдэг бөгөөд DCFH исэлдэхэд флуоресценцтэй DCF үүснэ. Үүнийг исэлдүүлдэг бодисын жагсаалт урт: гидроксил радикал, пероксидазын болон гемийн завсрын нэгдлүүд, азотын давхар исэл, гипохлорын хүчил, пероксинитритээс гаралтай радикалууд. Устөрөгчийн хэт исэл дангаараа үүнийг хэмжилтэд хэрэг болохуйц хурдаар шууд исэлдүүлдэггүй; хэт ислээс хамаарах флуоресценц үүсэхэд ерөнхийдөө төмөр, гем агуулсан уураг эсвэл пероксидазын урвалын оролцоо шаардлагатай.

Арга зүйн хэсэг бүрд эшлэх ёстой шүүмж нь Калянараман болон хамтран ажиллагчдын DCFH-ийг зонд болгон шинжилсэн ажлаас гаралтай. Энэ шалтгаанаар DCFDA-г ашиглахаас татгалзсан тархины митохондрийн судалгаанд уг шүүмжийг нэгтгэн дурдсанаар, будаг удаан урвалд ордог, стехиометр нь тодорхойлогдоогүй, хүчинтэй калибровкгүй, мөн ROS биш нэгдлүүдтэй урвалд ордог болохыг харуулсан. Зонд хэмжиж буй зүйлээ мөн өсгөн нэмэгдүүлдэг: DCFH нэг электроноо алдан исэлдэхэд DCF радикал үүсэж, тэр нь хүчилтөрөгчтэй урвалдан супероксид үүсгэдэг. Супероксид дисмутацийн урвалаар нэмэлт хэт исэл үүсгэнэ. Иймээс хэмжилт мэдээлж буй химийн үйл явцынхаа нэг хэсгийг өөрөө бий болгодог.

Энэ бүхнээс DCFDA хэрэггүй гэсэн дүгнэлт гарахгүй. Харин энэ нь бодисыг тодорхойлох арга биш, урьдчилан тандах арга гэсэн үг. DCF-ийн флуоресценц нэмэгдэх нь исэлдүүлэгчээс хамаарах зондын исэлдэлт нэмэгдсэнийг илтгэнэ. Энэ нь хэт исэл нэмэгдсэн гэсэн үг биш бөгөөд нийт ROS нэмэгдсэн гэсэн үг бүр ч биш. Нийт ROS-ийг ганц зондоор хэмжих боломжгүй. Нэг микромоляраас дээш концентрацид DCF-ийн исэлдэлтэд тулгуурласан метилений хөхийн өмнөх судалгаанууд прооксидант нөлөө мэдээлсэн бол тухайн үеийн бусад системд хэт ислээс үүдсэн эсийн үхлээс хамгаалах нөлөө мэдээлжээ. Өөр өөр исэлдэн-ангижрах орчинд нэг будагны хувьд энэ хоёр ажиглалт хоёул үнэн байж болох бөгөөд зөвхөн DCF-ийн үр дүнгээр аль исэлдүүлэгч дохио үүсгэснийг хэлэх боломжгүй. Тархины митохондрийн өмнөх судалгааны ач холбогдол нь энэ тандах аргыг калибровк хийсэн хэт ислийн хэмжилтээр сольж, ачааллыг шууд тогтоосонд оршино: ердөө нэг зуун наномоляр будаг ч туршсан бүх субстрат болон амьсгалын төлөвт хэт ислийн ялгаралтыг хэд дахин нэмэгдүүлсэн.

DCFDA-д метилений хөхтэй холбоотой өөр нэг урхи бий. Будаг маш тод өнгөтэй, исэлдэн-ангижрах идэвхтэй тул флуоресценцийг бүдгэрүүлэх, цацаргалтыг унтраах эсвэл эсийн ROS-оос үл хамааран зондын урвалын системийг исэлдүүлэх боломжтой. Будаг ба зонд агуулсан боловч эсгүй хяналт нь байвал зүгээр нэг нэмэлт биш. Энэ нь будаг зондтой харилцан үйлчилж байгаа эсэхийг тогтоодог туршилт юм.

Спин барих арга ба хүчилтөрөгчийн хэрэглээ: бодисын төрөл ба урсгал

Флуоресцент зондууд исэлдүүлэх чадвартай ямар нэг зүйл үүссэнийг мэдээлдэг бол спин баригчтай электрон спины резонанс нь тэр зүйл юу байсныг илүү ойр тодорхойлдог. Метилений хөхийн фотохимийн сонгодог судалгаанд будаг, аскорбат, гэрлээс үүссэн аскорбатын радикалыг ESR-ээр илрүүлсэн. Дараа нь хүчилтөрөгчийн хэрэглээний туршилтаар хэт исэл үүсэхийг, спин барих туршилтаар төмрийн катализтай гидроксил радикал үүсэхийг харуулсан. Арга бүр бусад нь хариулж чадахгүй асуултад хариулсан: ESR радикалын төрлийг, хүчилтөрөгчийн хэрэглээ ямар ч флуоресцент зондоос үл хамаарах урвалын урсгалыг тодорхойлсон бөгөөд эдгээрийг хослуулахад нэг гэрэлтүүлсэн системд синглет хүчилтөрөгчийн болон радикалын замууд зэрэг ажиллаж байгааг харуулсан.

1984 оны тэр үр дүн өнөөдөр ч анхааруулга мэт уншигдана. Гэрэлтүүлэг болон ангижруулагч бодис байгаа үед будаг хэт исэл үүсгэсэн бөгөөд төмөр байгаа үед систем нь энэ бүлгийн хамгийн идэвхтэй хэлбэр болох гидроксил радикалыг үүсгэсэн. Зохиогчид үүнийг нүдэнд байдаг аскорбаттай холбон тайлбарлаж, нүдний эмчилгээнд хөнгөн хуумгай хэрэглэхийг эргэлзээтэй гэж үзсэн. Өнөөгийн уншигчид нөхцөлийг нь анхаарах ёстой: гэрэл, ангижруулагч, төмөр. Эдгээрийн аль нэгийг хасахад уг зам суларна эсвэл арилна.

Хүчилтөрөгчийн электродын ач холбогдол өөр. Кларк төрлийн электрод хүчилтөрөгчийн цэвэр хэрэглээг хэмждэг. Ингэснээр будагнаас үүдсэн исэлдэн-ангижрах урвал молекул хүчилтөрөгч хэрэглэж байгааг тогтоож, флуоресценцийн ямар ч артефактаар дуурайлган үүсгэх боломжгүй кинетикийн мэдээлэл өгдөг. Гэхдээ бүтээгдэхүүнийг тодорхойлдоггүй. Хэт исэл, супероксид, ус үүсэх, мөн синглет хүчилтөрөгчийн задралтай холбоотой үйл явцууд бүгд хүчилтөрөгч хэрэглэдэг. Бодисын төрлийг мэдэхгүй урсгалын мэдээлэл нь урсгалыг мэдэхгүй бодисын төрлийн мэдээлэлтэй адил дутуу. Тиймээс чанартай өгүүллүүд электродыг калибровк хийсэн хэт ислийн шинжилгээ эсвэл баригчтай хослуулдаг.

Антиоксидант нөлөөний үр дүн яагаад зөрчилддөг вэ

Эдгээр гурван хэмжилтийг зэрэгцүүлэн үзвэл метилений хөхийн судалгаан дахь илэрхий зөрчлүүд нь аргын ялгаа болон биологийн гурван баримтаар тайлбарлагдана.

Нэгдүгээрт, будаг нь электрон зөөвөрлөгч төдийгүй хэт ислийн эх үүсвэр юм. Хүчилтөрөгч супероксид болж хувирах байсан амьсгалын цэгүүдээс электроныг өөр тийш чиглүүлснээр нэг ROS-ийг бууруулж болох ч ангижирсан хэлбэр нь хүчилтөрөгчийг шууд хэт исэл болгон ангижруулж, өөр ROS-ийг нэмэгдүүлдэг. Иймээс митохондрийн исэлдэн-ангижрах хими болон тойруу зам үүсгэх үүргийг судалж буй лаборатори зондоос хамаарсан хариу хүлээх ёстой: нэг кюветэд супероксидод мэдрэг хэмжилтийн утга буурч байхад хэт ислийн хэмжилтийн утга нэмэгдэж болно.

Хоёрдугаарт, бага тунтай хэт исэл нь зөвхөн гэмтэл биш, дохио юм. Өмнөх ажлыг үргэлжлүүлсэн хулганы тархины митохондрийн судалгаанд ердөө тавин наномоляр будаг хэт исэл үүсгэж, эмчилгээний түвшний концентрацид митохондрийн ДНХ-д гэмтэл үүсгээгүй бөгөөд урьдчилан үйлчлүүлсний дараа ротеноноос үүдсэн гэмтлээс хамгаалсан байна. Эмчилгээний хүрээнээс хавьгүй өндөр буюу нэг зуун микромоляр концентрацид л будаг сонгосон ДНХ-ийн хэсгүүдийг гэмтээсэн. Харин улаан гэрэлтэй хосолсон хорин микромоляр будаг синглет хүчилтөрөгч үүсгэж, туршсан бүх хэсгийг гэмтээжээ. Санал болгосон механизм нь гормезис юм: хэт ислийн бага хэмжээний үүсэлт Nrf2-тэй холбоотой антиоксидант хамгаалалт болон митохондрийн биогенезийг өдөөдөг тул богино хугацааны прооксидант хэмжилтийн дараа урт хугацааны антиоксидант үр дүн гардаг. Нэг цагийн дараах шинжилгээ ба нэг өдрийн дараах шинжилгээ хоорондоо зөрж болно. Учир нь энэ хугацаанд биологийн нөхцөл өөрчлөгдсөн байдаг.

Гуравдугаарт, гэрэл ямар молекул байгааг хүртэл шийддэг. Гэрэлтүүлэг будагны метил бүлгүүдийг салгаж, Azure B болон түүнтэй холбоотой бүтээгдэхүүнүүд рүү хувиргадаг бөгөөд дээжийн таваг дээрх микроскопын гэрэл л фотосенсибилизаци үүсгэхэд хангалттай. Харанхуй болон гэрэлтүүлсэн туршилтууд нь өөр өөр туршилт бөгөөд аливаа протоколын гэрэлтүүлэг ба будагтай ажиллах нөхцөлийн хяналтын хэсэгт үүнийг ийм байдлаар авч үзэх ёстой.

Зайлшгүй шаардлагатай хяналтууд ба аливаа дүгнэлтийг хэрхэн унших нь

Доорх харьцуулалт нь энэ өгүүлэлд зориулан боловсруулсан анхдагч лавлах материал юм. Метилений хөхийн ROS-ийн аливаа үр дүнг хүлээн зөвшөөрөхөөсөө өмнө зохиогчид аль мөрийн хяналтыг хийсэн, алийг нь алгассаныг шалгаарай.

Эндээс үр дүнг унших практик дүрэм гарна. Пероксидазтай, калибровк хийсэн, каталазаар шалгасан Amplex шинжилгээ нь хэт ислийн тухай нотолгоо юм. DCFDA нь зондын өвөрмөц бус исэлдэлтийн тухай нотолгоо бөгөөд түүнээс цааш юу ч хэлэхгүй. Радикал саармагжуулагчийн хяналттай спин барих арга нь радикалын төрлийн тухай нотолгоо. Хүчилтөрөгчийн хэрэглээ нь урсгалын тухай нотолгоо. Шинжилгээнийхээ нотолж чадах хэмжээнээс давсан дүгнэлттэй өгүүлбэр хэчнээн итгэлтэй бичигдсэн ч будагны тухай биш, зондын тухай өгүүлбэр байдаг. Тунгийн хамаарал ба гормезисийн хүрээ, митохондрийн электроны урсгал, будсан дээж дэх шинжилгээний хөндлөн нөлөө, микроскопын гэрэлтүүлгийн артефактын талаарх холбогдох хэлэлцүүлгүүд эдгээр санаа бүрийг дэлгэрүүлдэг бөгөөд түр эшлэлийг нь бодит эшлэлээр сольсны дараа ч тус бүр нь хүчинтэй хэвээр үлдэнэ.