Нийтлэл
Метилен хөх ба автофаги: AMPK, mTOR болон мэдрэлийн эсийн туршилтууд
Та эсийн туршилт хийж, метилен хөх нэмээд, блот дээрх LC3-II хэмээх уургийн зурвас бараан болж байгааг харлаа гэж төсөөлөөд үзье. Тэгээд энэ нэгдэл «автофагийг эрчимжүүлдэг» гэж зарлаад цааш үргэлжлүүлэхэд амархан. Гэвч ийм дүгнэлт хийхэд эрт байна. LC3-II зурвас бараан болох нь эс цэвэрлэгээний цэврүүнцрийг олноор үүсгэж байгааг илэрхийлж болно. Эсвэл устгах шат нь саатсанаас цэврүүнцрүүд хуримтлагдаж байгааг ч илэрхийлж болно. Энэ хоёр тайлбар эсрэг чиглэлийг заадаг бөгөөд метилен хөхийг мэдрэлийн эсэд судалсан бүтээлүүдэд аль алиныг нь дэмжих нотолгооны жишээ бий. Энэ нийтлэлд шинжилгээ тус бүрээр яг юуг хэмжсэнийг авч үзнэ.
Энд судалсан хэлбэр болох макроавтофаги нь эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг бөөнөөр нь дахин боловсруулах үйл явц юм. Фагофор хэмээх мембрант уут элэгдсэн уураг болон органеллуудыг хүрээлэн тэлж, хаагдан автофагосом үүсгээд, лизосомтой нийлдэг. Доторх агуулга нь задарч, дахин ашиглагдахаар чөлөөлөгдөнө. Нейронууд хуваагддаггүй, тиймээс хуваагдах замаар гэмтсэн хэсгүүдийнхээ эзлэх хувийг бууруулж чаддаггүй тул энэ үйл явцаас хамаардаг. Дахин боловсруулалт саатахад хаягдал хуримтлагдана. Харин хэвийн явагдах үед эс стресстэй нөхцөлд бүтцийн материалаа эргүүлэн олж авдаг.
Гиппокампын нэг туршилт юу харуулсан бэ
Өдөөлтийг судалсан гол туршилтад хулганы гиппокампын HT22 эсүүдийг 24 цаг ийлдэсгүй байлгаж стресст оруулсан. Энэ нөхцөл нь өсөлтийн хүчин зүйлс болон трофик дохиог үгүй болгож, апоптоз болон автофагийг хоёуланг нь өдөөдөг. Судлаачдын мэдээлснээр, метилен хөх эсийн үхлийг тунгаас хамааран бууруулсан бөгөөд энэ хамгаалах нөлөө макроавтофагийн шинжүүдтэй хамт илэрсэн.
Маркеруудын өөрчлөлт тодорхой байв. Метилен хөхийн концентраци ойролцоогоор 20 nM-ээс эхлэхэд тархмал LC3B будалт цөмийн эргэн тойрны цэгэн бөөгнөрөл рүү шилжсэн бөгөөд LC3-I ба LC3-II-ийн хамгийн хүчтэй хариу урвал 1 μM орчимд ажиглагдсан. LC3B-I болон LC3B-II хоёулаа тун болон хугацаанаас хамааран нэмэгдсэн. Хамгийн чухал нь баг нэг агшны LC3 блот хэмжилтээр хязгаарлагдаагүй. Тэд лизосомоор зайлуулах үйл явцыг хориглодог 10 μM хлорохин нэмж, метилен хөхөөр боловсруулсан эсүүдэд LC3-II улам нэмэгдэж, p62 тогтвортой хадгалагдаж байгааг тогтоосон. Энэ зураглал нь зүгээр нэг хуримтлал бус, лизосомоос хамааралт задрал, эргэлтийг дэмждэг. Мөн хлорохин апоптозын эсрэг нөлөөг хэсэгчлэн буцааж байгааг харуулсан нь энэ загварт хамгаалах нөлөө автофаги–лизосомын замтай холбоотойг илтгэнэ.
Дохиоллын үр дүн бол хамгийн их буруу эшлэгддэг хэсэг юм. Фосфоржсон AMPK болон түүний доод шатны бай болох фосфоржсон ACC-ээр хэмжсэн AMPK дохиолол 12 болон 24 цагт тунгаас хамааран нэмэгдсэн. Сүүлийн 4 цагийн турш 20 μM концентрациар хэрэглэсэн AMPK дарангуйлагч Compound C нь ACC-ийн фосфоржилт болон LC3-ийн идэвхжлийг хоёуланг нь бууруулсан. Харин фосфоржсон mTOR-д хэмжигдэхүйц дарангуйлалт илрээгүй. Иймээс стресст орсон гиппокампын эсүүдэд AMPK-тай холбоотой өдөөлт нь mTOR-оос үл хамаарах мэт замаар явагдсан гэсэн үр дүн гарсан. Амьд хулганад ч ижил зураглал ажиглагдаж, метилен хөхийн үйлчлэл тархины холтос болон гиппокампад макроавтофагийн маркеруудыг өдөөсөн.
Өдөөлт нь бүрэн явагдсан урсгал биш
Энд ойлголтуудын ялгаа хамгийн чухал. Өдөөлт гэдэг нь үйл явцын эхний шатны механизм илүү олон автофагосом үүсгэж байгааг хэлнэ. Урсгал гэдэг нь агуулга тусгаарлан бүрхэгдэх, боловсрох, лизосомтой нэгдэх, задрах, дахин боловсруулагдах бүхий л замыг туулж байгааг хэлнэ. Урсгалын шинжилгээгээр үлдсэн үе шатуудыг батлах хүртэл LC3-II-ийн аливаа өсөлт зөвхөн өдөөлтийн тухай дүгнэлт юм.
Урсгалын стандарт шинжилгээ нь бафиломицин A1 эсвэл хлорохин зэрэг бодисоор лизосомын үйл ажиллагааг богино хугацаанд хориглосон болон хориглоогүй нөхцөлд LC3-II-ийг хэмждэг. Хэрэв үйлчлэл нь үүсэлтийг үнэхээр хурдасгаж байгаа бол задралыг хориглоход LC3-II улам нэмэгдэх ёстой. Хосолсон mCherry-GFP-LC3 репортер өөр өнцгөөс мэдээлэл өгдөг: бүтцүүд лизосомтой нэгдэхээс өмнө шар өнгөөр гэрэлтэж, хүчиллэг орчин GFP-ийн дохиог унтраасны дараа зөвхөн улаан өнгөтэй болдог. Тиймээс зөвхөн улаан цэгэн бөөгнөрөл олшрох нь хүчиллэг автолизосом руу шилжиж байгааг дэмжинэ. p62 уургийн хэмжээ буурах нь агуулгын задрал, эргэлтийг бататгаж болно. Гэхдээ p62-ийн транскрипц өөрөө стресст хариу үзүүлдэг тул үүнийг mRNA түвшинд шалгах хэрэгтэй.
Доорх шалгах жагсаалт нь эдгээр судалгаанд ашигласан шинжилгээ бүр юуг хэмждэг, дангаараа юуг баталж чадахгүйг харуулна. Уншигчид үүнийг цаашдын макроавтофагийн аливаа тайлбарт, тэр дундаа эдгээр маркерт тулгуурласан мацаг ба урт наслалтын тухай тайлбаруудад дахин ашиглаж болно.
| Шинжилгээ | Юуг хэмждэг вэ | Дангаараа юуг баталж чадахгүй вэ |
|---|---|---|
| LC3B-I түвшин | Липиджих боломжтой цитозол дахь урьдал уургийн нөөцийн хэмжээ | Автофагийн идэвх; нийлэгжилт болон боловсруулалт мөн үүнийг өөрчилдөг |
| LC3B-II түвшин | Автофагийн бүтцүүд дээрх мембрантай холбогдсон LC3-ийн хэмжээ | Бүрэн явагдсан урсгал; өсөлт нь үүсэлт хурдассан эсвэл зайлуулалт хориглогдсоныг илэрхийлж болно |
| LC3-ийн цэгэн бөөгнөрөл ба цөмийн эргэн тойрны бөөгнөрөл | LC3 цэврүүнцэр бүтэц рүү дахин хуваарилагдах байдал | Өөрчлөлтийн чиглэл; нэг агшны зураг хурдассан үйл явцыг саатлаас ялгаж чадахгүй |
| Хлорохин эсвэл бафиломицин A1-тэй болон эдгээргүй нөхцөл дэх LC3-II | Зайлуулалт хориглогдсон үед шинэ автофагосомууд үргэлжлэн үүсэж байгаа эсэх | Агуулгын бүрэн задрал; дарангуйлагчийн үйлчлэх хугацаа богино, оновчтой тохируулсан байх шаардлагатай |
| p62 уургийн түвшин | Хэвийн үед автолизосомд задардаг агуулга холбогч уургийн задрал, эргэлт | Зөвхөн урсгалын өөрчлөлт; стрессийн замууд p62-ийн транскрипцийг мөн зохицуулдаг |
| Хосолсон mCherry-GFP-LC3 репортер | Хүчиллэг автолизосом руу шилжих явц (шараас зөвхөн улаан болж өөрчлөгдөх) | Бүх төрлийн агуулгын бүрэн задрал |
| Фосфо-AMPK ба фосфо-ACC | Энергийн стресс мэдрэгчийн оролцоо болон түүний гаралтын дохио | Эсийн амьд үлдэх нөлөөг автофаги үүсгэсэн гэдгийг; AMPK бодисын солилцооны олон салааг хянадаг |
| Фосфо-mTOR, p70S6K, 4EBP1 | Автофагийг хязгаарладаг өсөлтийн дохиоллын замын идэвх | Урсгал; эдгээр нь эхний шатны зөвшөөрөх дохио болохоос задлан зайлуулалтын хэмжилт биш |
Хүснэгт үг хэллэгийн нэг төөрөгдлөөс сэргийлж байгааг анхаарна уу. Фосфоржсон ACC нь ферментийн үйл ажиллагаа нь дарангуйлагдсан хэлбэр юм. Түүний өсөлт ACC-ийн идэвхжлийг бус, AMPK-ийн гаралтын дохиог харуулдаг.
«Макроавтофагийг дарангуйлахад мэдрэлийн эсийг хамгаалах нөлөө арилсан» гэсэн хэллэгт ч мөн адил нарийвчлал шаардлагатай. HT22 загварт энэ нь автофаги–лизосомын замд саад учруулахад ийлдэсгүй нөхцөл дэх метилен хөхийн эсийн амьд үлдэх давуу тал арилсан гэсэн үг. Энэ нь тухайн өсгөвөрт автофаги зайлшгүй шаардлагатай эсвэл нөлөөнд хувь нэмэр оруулдаг болохыг дэмжинэ. Гэхдээ автофаги нь нэгдлийн цорын ганц хамгаалах механизм болохыг тогтоохгүй, хлорохин зөвхөн автофагиар дамжин үйлчилдэг болохыг батлахгүй. Шалтгаант холбооны дүгнэлтийг бататгахын тулд ATG5, ATG7 эсвэл ULK1-д генетикийн аргаар өөрчлөлт оруулах шаардлагатай.
Нэг механизмд хүрэх хоёр зам
Хялбарчилсан зураглал ойлгоход тусална. Энергийн стресс AMPK-ийг нэмэгдүүлж, AMPK нь ULK1 цогцолборыг идэвхжүүлснээр автофаги эхэлдэг. Өсөлтийн хүчин зүйлс болон шим тэжээл mTORC1-ийг нэмэгдүүлж, mTORC1 нь ULK1-ийг дарангуйлснаар автофаги идэвхгүй хэвээр үлдэнэ. ULK1-ийн дараагийн шатанд Beclin-1 ба VPS34 цогцолбор фагофорын үүсэлтийг эхлүүлж, LC3-I липиджин LC3-II болж, автофагосом хаагдан лизосомтой нийлээд, агуулга задарч, p62 мөн задрал, эргэлтэд ордог.
Бүдүүвч нь метилен хөхийн үр дүн бүрийг энэ зураглалд байрлуулсан: гиппокампын үр дүнг AMPK салааны хажууд, урьдал эсийн үр дүнг mTOR салааны хажууд.
Ингэж авч үзэх нь Xie-ийн хоёр дахь судалгаатай зөрчилдөж байгаа мэт байдлыг тайлбарлана. Үржин олширч буй хархны мэдрэлийн урьдал эсүүдэд хийсэн тусдаа туршилтаар 5 μM метилен хөх эсийн олшролыг дарангуйлж, тайван төлөвт орохыг дэмжсэн. Ki67 эерэг эсүүд 1 болон 3 дахь өдөр буурсан боловч нейрон болох чиглэл нь тогтсон эсүүдийн ялгаран хөгжил хэвийн хадгалагдсан. Тэнд механизм нь mTOR дохиоллын дарангуйлалтаар дамжсан: нийт mTOR болон фосфоржсон mTOR буурч, p70S6K ба 4EBP1-ийн илэрхийлэл багасан, E1, B1, D1, D2 циклиний илэрхийлэл мөн буурсан. Давамгай илэрсэн шинж нь урьдал эсийн тайван төлөв байсан бөгөөд зохиогчид үүнийг стресст орсон гиппокампын эсүүдийг хамгаалсантай бус, эсийн хөгшрөлт хойшилсонтой холбосон.
Хоёр өгүүлэл хоорондоо зөрчилдөхгүй. AMPK болон mTOR нь тогтмол унтраалга бус, нөхцөл байдлаас хамааран дохиог нэгтгэдэг зохицуулагчид юм. Стресст орсон, нейронтой төстэй эс хэмжигдэхүйц mTOR дарангуйлалгүйгээр AMPK-ийг идэвхжүүлж болно. Харин митогенээр өдөөгдсөн урьдал эс ижил нэгдэлд mTOR-оос хамааралт өсөлтийн механизмаа сааруулах замаар хариу үзүүлж болно. Эсийн төрөл, стрессийн нөхцөл, концентраци болон хэмжилтийн хугацаа аль салаа давамгайлахыг шийддэг. Тиймээс метилен хөхийн митохондрийн энерги болон исэлдэн ангижрах үйл явцад үзүүлэх нөлөөг ч мөн энэ зураглалд багтаах хэрэгтэй. Мэдрэлийн эсийг хамгаалах механизмын тоймд тайлбарласнаар, энэ нэгдэл электрон зөөх өөр замын зөөгч болж, антиоксидант болон апоптозын эсрэг дохиололд оролцож, MAO ба NOS-ийг дарангуйлж, биогенез болон автофагиар дамжин митохондрийн шинэчлэлттэй холбогддог. Автофаги бол олон талт үйлчлэлийн нэг салаа болохоос бүхэл тайлбар нь биш.
Туршилтууд юуг харуулахгүй вэ
Ийлдэсгүй байлгах нь өсгөврийн саванд трофик болон бодисын солилцооны стрессийг загварчилдаг. Энэ нь бүхэл организмын мацгийг загварчилдаггүй: суурь тэжээлт орчинд глюкоз, амин хүчил болон давс хэвээр байдаг бөгөөд хооллох зан үйл гэж байхгүй. Өсгөвөрт хэрэглэсэн 20 nM-ээс 5 μM хүртэлх концентрацийг хүний тун руу арифметик тооцоогоор хөрвүүлэх боломжгүй. Учир нь шимэгдэлт, уурагтай холбогдох байдал, исэлдэн ангижрах төлөв, бодисын солилцоо, эдэд хуримтлагдах байдал болон үйлчлэх хугацаа бүгд ялгаатай.
Өвчтөнд метилен хөхөөр өдөөгдсөн автофагийн урсгалыг харуулах зорилготой хүний туршилт одоогоор хийгдээгүй. Механизмын нотолгоо нь эсийн, ex vivo болон амьтны судалгааны түвшинд хэвээр байгаа бөгөөд тойм өгүүллүүдэд хүний хэрэглээнд шилжүүлэх нотолгоог урьдчилсан шатны гэж тодорхойлсоор байна. Иймээс эдгээр судалгаа метилен хөх мацгийн нөлөөг давтдаг, автофагиар дамжин хүний насыг уртасгадаг эсвэл хүний тархинд автофагийн урсгалыг бүрэн гүйцээдэг болохыг харуулахгүй. Мацгийг дуурайх болон урт наслалтын тухай дүгнэлтэд тусдаа эмнэлзүйн нотолгоо шаардлагатай. Өөр заалтаар хийсэн метилен хөхийн хүний туршилтууд холбоо хамаарлаар нь автофагийн туршилт болчихгүй. Шим тэжээлийн стресс болон урт наслалтын загварын судалгааг энэ заагийг баримтлан унших хэрэгтэй.
Дараагийн өгүүллээ уншихдаа шалгах жагсаалтыг дарааллаар нь хэрэглээрэй. Эхлээд аль салаа өөрчлөгдсөнийг асуу: AMPK, mTOR эсвэл аль нь ч биш үү. Дараа нь LC3-ийн үр дүнг урсгалын шинжилгээтэй хослуулсан уу, эсвэл дангаар нь үзүүлсэн үү гэдгийг шалга. Үүний дараа замыг хориглоход эерэг нөлөө арилсан эсэх, мөн ямар аргаар хориглосныг шалга. Энэ гурвууланд хариулсан судалгаа механизмын талаар баттай дүгнэлт хийх үндэслэлтэй. Зөвхөн эхний асуултад хариулсан судалгаа зөвшөөрөх дохиог л харуулсан бөгөөд үйл явцын үлдсэн зам тодорхойгүй хэвээр байна.