Метилений хөхийг яагаад хүчилд тэсвэртэй бактерийн будалтын эсрэг будаг болгон ашигладаг вэ

Лабораторийн техникч будалтын бүх үе шатыг хийсний дараа цэрний түрхцийг шинжилнэ. Хөх дэвсгэр дээр улаан савханцрууд тод харагдаж, хариуг хүчилд тэсвэртэй савханцар илэрсэн гэж гаргана. Маргааш нь өөр нэг бэлдмэлд улаан савханцаргүй, жигд хөх талбай харагдахад сүрьеэгийн шинжилгээ сөрөг гэж мэдээлнэ. Эдгээр хариуны нэг нь бэлдмэлээс гаргаж болох дүгнэлтээс давсан утга илэрхийлж байгаа бөгөөд тэр нь эхнийх нь биш юм.

Энэ төөрөгдөл ойлголтын түвшинд үүсжээ. Техникч хөх будгийг илрүүлэлтийн химийн үйл явцын нэг хэсэг гэж үзэж, метилений хөх микобактерийг олоход тусалдаг мэт ойлгосон байна. Гэвч тийм биш. Метилений хөх бэлдмэлд хүрэх үед сорил аль хэдийн дууссан байдаг. Энэ будаг зөвхөн дэвсгэрийг будаж, үр дүнг унших боломжтой болгодог. Энэ нийтлэлд хүчилд тэсвэртэй бактерийн будалтад метилений хөх ямар үүрэгтэй, яагаад өөр өнгө биш хөхийг сонгодог, хөх дэвсгэр дээрх улаан өнгөнөөс ямар дүгнэлт хийж болохыг тайлбарлана.

Товч хариулт

Хүчилд тэсвэртэй бактерийн будалт нь гурван үндсэн зарчимд тулгуурласан ялган оношлох сорил юм. Үндсэн будаг болох карбол фуксиныг лавлаг бүрхүүлтэй микобактерийг оролцуулан бүх эсэд нэвтрүүлнэ. Өнгөгүйжүүлэгч хүчил-спирт нь энгийн эсээс улаан будгийг арилгадаг боловч хүчилд тэсвэртэй эсээс гаргаж чаддаггүй. Дараа нь эсрэг будаг болох метилений хөх өнгөгүйжүүлэгчийн будгийг нь арилгасан бүх зүйлийг буддаг. Ингэснээр хүчилд тэсвэргүй эс, эзэн биеийн эс болон үлдэгдэл хөх болж, хүчилд тэсвэртэй савханцрууд улаан хэвээр үлдэнэ. Эсрэг будаг нь өнгөний ялгарал үүсгэдэг. Эсийг хүчилд тэсвэртэй болгодог химийн шинжид ямар ч үүрэггүй.

Үе шат бүрийн үүрэг

Доорх схемд үе шат бүрийн үүргийг харуулав. Зүүнээс баруун тийш нь үйл явцын дараалал болгон уншиж, доод зурвасыг будалтын арга тус бүр өөр асуултад хариулдгийг сануулах хэсэг гэж үзээрэй.

Эхлээд будгийг нэвтрүүлнэ. Микобактерийн бүрхүүл онцгой гидрофоб шинжтэй тул энгийн усан будаг нэвтрэхэд саад болдог. Иймээс протоколд будгийг зориуд нэвтрүүлэх нөхцөл бүрдүүлдэг. Циль–Нильсений аргад уур гартал халаах нь фенол агуулсан карбол фуксиныг лавлаг ханаар нэвтрүүлдэг. Киньюны хүйтэн аргад халаалтыг үндсэн будгийн хавьгүй өндөр агууламжтай найрлагаар орлуулдаг бөгөөд халаалтгүй зарим өөрчилсөн хувилбарт гадаргуугийн идэвхт бодис нэмдэг. Америкийн микробиологийн нийгэмлэгийн хүчилд тэсвэртэй бактерийн будалтын протоколууд хоёр найрлагыг зэрэгцүүлэн тайлбарласан бөгөөд агууламжийн ялгаа нь их: халаадаг аргад 100 mL тутамд ойролцоогоор 0.3 g суурилаг фуксин, харин хүйтэн аргад ойролцоогоор 4 g хэрэглэдэг.

Хоёрдугаарт ялгана. Ихэвчлэн 95 хувийн этанолын 97 mL-д 3 mL концентрацитай давсны хүчил нэмсэн хүчил-спирт нь хана нь онцгой тэсвэр үзүүлдэггүй бүх эсээс улаан будгийг угааж арилгадаг. Микобактерийн липидэн бүрхүүл нь бүтэн байгаа эсүүд будгийг хадгалж үлдэнэ. Энэ нь бүх аргын гол үе шат бөгөөд доор тайлбарлахчлан ажиллагааны техникээс хамгийн их хамаардаг.

Эцэст нь өнгөний ялгарал үүсгэнэ. Энэ үед бэлдмэлд будаг нь арилсан эсүүдийн бараг өнгөгүй дэвсгэр дээр хүчилд тэсвэртэй улаан эсүүд байна. 0.3 хувийн w/v метилений хөх нь дэвсгэрийг улаанаас хамгийн эрс ялгарах өнгөөр будаж, дахин харагдахуйц болгоно. Эсрэг будалт богино хугацаатай: халаадаг аргад ихэвчлэн 20–30 секунд, хүйтэн аргын зарим хувилбарт хэдэн минут хүртэл үргэлжилдэг. Энэ хугацаа нь будгийн өөрийн шинж бус, протоколоос хамаарна.

Яагаад энэ будаг, яагаад хөх өнгө вэ

Метилений хөх нь катион суурилаг будаг. Өөрөөр хэлбэл, өнгөт ион нь эерэг цэнэгтэй бөгөөд өнгөгүйжүүлсэн бактери, эзэн биеийн эс болон үлдэгдлийн сөрөг цэнэгтэй гадаргууд холбогддог. OpenStax-ийн микробиологийн сурах бичиг цэнэгт суурилсан энэ зарчмыг суурилаг будгийн нийтлэг үндэс гэж тайлбарладаг. Гэхдээ энд метилений хөх химийн хувьд онцгой биш. Кристалл виолет болон сафранин ч суурилаг будаг юм. Сонголт нь химийн бус, оптикийн үндэслэлтэй.

Улаан савханцарт ялгаатай өнгийн дэвсгэр хэрэгтэй бөгөөд хөх нь гэрэлт талбайн микроскопт улаанаас хамгийн хэрэгтэй байдлаар ялгардаг. Сафранины эцсийн ягаан-улаан өнгө хадгалагдсан карбол фуксины өнгөтэй хэт ойр тул эсрэг будагт тохиромж муутай. Энэ нь будалтын явцад бий болгосон ялгааг үгүй болгоно. Кристалл виолет нь бараан нил ягаан дэвсгэр үүсгэж, нарийн улаан савханцруудыг ажиглахад саад болно. Энэ үүрэг химийн урвал бус, өнгөний ялгарал гэдгийн хамгийн хүчтэй нотолгоо нь орлуулан хэрэглэж болдогт оршино: малахитын ногоон, бриллиант ногоон зэрэг ногоон эсрэг будгийг мал эмнэлгийн болон өөрчилсөн зарим протоколд хэрэглэсэн ч сорил хэвийн ажилладаг. Учир нь тодорхой ялгарах ямар ч өнгө ижил үүрэг гүйцэтгэнэ.

Эндээс практикт хамаарах хоёр дүгнэлт гарна. Нэгдүгээрт, стандарт жорт pH тохируулахыг заадаггүй. Энэ энгийн 0.3 хувийн усан уусмалыг будалтын өөр зарчимд хамаарах Лёффлерийн метилений хөх зэрэг шүлтлэг найрлагатай андуурч болохгүй. Хоёрдугаарт, хэт их будах нь сөрөг нөлөөтэй. Хэт өтгөн хөх дэвсгэр цөөн тооны савханцрыг далдалж болохыг эд судлалын ном зохиолд тусгайлан анхааруулдаг. Иймээс бэлдмэлийг протоколд зааснаас удаан хугацаанд будгийн уусмалд байлгах нь ямар ч ашиггүйгээр унших боломжийг муутгана.

Сорилыг боломжтой болгодог ханын хими

Хүчил-спирт эсүүдийг ялгаж чаддагийн шалтгаан микобактерийн бүрхүүлд оршино. Бүтцийнх нь үндсэн цөм нь миколил-арабиногалактан-пептидогликаны нийлмэл бүтэц юм. Пептидогликан нь арабиногалактантай холбогдож, арабиногалактангийн гадна үзүүрүүдэд маш урт гинжтэй миколын хүчлүүд бэхлэгдсэнээр липидээр баялаг, нэвчимтгий чанар онцгой бага гаднах микомембран үүсгэдэг. Микобактерийн гаднах мембраны тойм өгүүлэл энэ бүтцийг дэлгэрэнгүй тайлбарладаг. Уг хаалт хоёр чиглэлд үйлчилнэ. Будгийг дотогш нэвтрэхэд саад болдог тул халаалт эсвэл илүү хүчтэй үндсэн будаг шаардлагатай. Мөн будгийг гадагш гаргахад саад болдог тул карбол фуксин нэгэнт дотогш орсон бол хүчил-спирт түүнийг арилгаж чаддаггүй. Энгийн бактерид ийм бүрхүүл байхгүй учраас будаг нь арилна. Тиймээс хүчилд тэсвэртэй чанарыг фуксин миколын хүчилтэй химийн холбоо үүсгэдэг гэж бус, липидэн хаалтын үзэгдэл гэж ойлгох нь оновчтой.

Энэ хими бас нэг түгээмэл асуултыг тайлбарладаг: микобактери Грамын аргаар муу, тогтворгүй будагддаг бөгөөд заримдаа бүдэг, сувдан цуваа мэт хэлбэрээр эсвэл будагдаагүй бүдэг дүрсээр харагддаг. Тэдний гидрофоб хана кристалл виолетын нэвтрэлтийг хязгаарладаг. Хүчилд тэсвэртэй бактерийн будалт нь Грамын будалтын өөрчилсөн хувилбар биш. Энэ нь ханын өөр шинж чанарт тулгуурласан ялгах өөр зарчим юм. Нөгөө хоёр аргын ялгааг энгийн будалт ба Грамын будалтын харьцуулалт-аас харж болно.

Гурван арга, гурван асуулт

Нэг будаг ашигладаг бактерийн аргуудын өргөн хүрээний талаар микроскопын будалтын атлас-аас үзнэ үү.

Хөх дэвсгэр дээрх улаан өнгө юуг нотолж чадахгүй вэ

Улаан савханцрууд нь хүчил-спиртийн үйлчлэлийн дараа карбол фуксиныг хадгалсан бичил биетүүдийг илэрхийлнэ. Энэ олдвор Mycobacterium tuberculosis-тэй нийцдэг боловч CDC-ийн сүрьеэгийн оношилгооны удирдамж-д бусад микобактери ч хүчилд тэсвэртэй байдгийг тодорхой тэмдэглэсэн. Тиймээс зүйлийг өнгөөр бус, өсгөвөр болон нуклейн хүчлийн шинжилгээгээр тогтоох шаардлагатай.

Ажиллагааны алдаа голчлон хоёр угаалтын үед гардаг. Дутуу өнгөгүйжүүлбэл дэвсгэр материал улаан хэвээр үлдэж, хуурамч эерэг гэж уншихад хүргэнэ. Хэт өнгөгүйжүүлбэл сул хадгалагдсан үндсэн будаг арилж, хуурамч сөрөг үр дүнд нөлөөлнө. Эсрэг будгийг хэт их хэрэглэвэл цөөн тооны савханцар хөх өнгөнд далдлагдана. Зузаан түрхэц, тунадасжсан урвалж, бохирдсон зайлах ус нь тус тусын хиймэл дүрслэлийг үүсгэдэг.

Техникийг хэчнээн зөв гүйцэтгэсэн ч мэдрэг чанар нь бичил биетийн тоогоор хязгаарлагдана. Уламжлалт түрхцийн микроскопийн шинжилгээнд нэг миллилитр цэр тутамд ойролцоогоор 5,000–10,000 савханцар шаардлагатай. CDC-ийн өмнөх нотолгооны тоймуудад өсгөврөөр батлагдсан уушгины сүрьеэгийн тохиолдлуудын дунд түрхцийн мэдрэг чанарыг ойролцоогоор 45–80 хувь гэж тогтоосон. Иймээс сөрөг түрхэц сүрьеэг хэзээ ч үгүйсгэхгүй. CDC-ийн одоогийн удирдамжид түрхэц бүртэй хамт өсгөвөр хийхийг хэвээр зөвлөж, уушгины сүрьеэ байж болзошгүй бөгөөд үр дүн нь эмнэлзүйн шийдвэрт нөлөөлөх үед амьсгалын замын дор хаяж нэг сорьцод нуклейн хүчлийг олшруулах шинжилгээ хийхийг зөвлөдөг.

Практик ажилд баталгаажсан протокол мөрдөнө

Сургалтын тайлбарууд, түүний дотор энэ нийтлэл нь эмнэлзүйн ажил хийх зөвшөөрөл биш. Лабораторийн практикт CDC, APHL эсвэл CLSI-ийн одоогийн баримт бичигтэй нийцсэн, тухайн лабораторийн баталгаажуулсан стандарт ажиллагааны журмыг мөрдөнө. CDC-ийн Stacks архив дахь хүчилд тэсвэртэй бактерийн будалтын лавлах нь ийм журамд урвалж болон үр дүнг унших шалгуурыг хэрхэн заадгийг харуулдаг. Сүрьеэгийн сорьцтой ажиллахад биологийн аюулыг тусгаарлан хязгаарлах шаардлагатай: түрхэц бэлтгэхэд аэрозол, үсрэлт үүсдэг тул биологийн аюулгүй ажиллагааны шүүгээнд бэлтгэнэ. CDC-ийн лабораторийн аюулгүй ажиллагааны удирдамжид халааж бэхжүүлсэн түрхэц хүртэл амьд сүрьеэгийн савханцар агуулж болзошгүй тул бохирдсон материалын адил харьцах ёстой гэж заасан. M. leprae илрүүлэхээр шинжилсэн, карбол фуксин ба метилений хөхөөр будсан түрхцийн тухай CDC-ийн Нийгмийн эрүүл мэндийн зургийн сангийн бүртгэл нь энэ арга зөвхөн сүрьеэгээр хязгаарлагддаггүйг сануулдаг. Хүчилд тэсвэртэй бичил биет хайж буй хаана ч хөх дэвсгэр дээрх улаан өнгөний ижил ялгарал үйлчилнэ. Нягт шалгаж гаргасан сөрөг уншилт ч өөрөө тэмдэглэх үнэ цэнтэй үр дүн юм.

Будсан бэлдмэлийг унших нь

Эсрэг будгийн хэрэгцээ бэлдмэлийг шалгах үед тодорхой болдог. Микроскопоор бага өсгөлтөд гүйлгэн ажиглахдаа эхлээд хөх дэвсгэрээр түрхцийн чанарыг үнэлнэ: эсүүд жигд тархсан эсэх, фокус тохируулахад ашиглах эзэн биеийн эсүүд бүтэн эсэх, их хэмжээний тунадасгүй эсэхийг шалгана. Дараа нь бэлдмэл дээр өөр юу ч улаан биш учраас сэжигтэй улаан дүрсүүд анхаарал татна. Тэдгээрийг тосон иммерсийн үед баталгаажуулна. Энэ үед жинхэнэ савханцрууд жигд будгийн үлдэгдэл бус, хүлээгдэж буй нарийн, заримдаа бага зэрэг муруй эсвэл сувдан цуваа мэт савханцар хэлбэртэй харагдана.

Дэвсгэрийн будалт шинжилгээний хариуны үг хэллэгийг ч тодорхойлдог. Улаан савханцартай бэлдмэлийг хүчилд тэсвэртэй савханцар илэрсэн гэж мэдээлж, ихэвчлэн лабораторийн шатлалын дагуу хагас тоон үнэлгээ хавсаргана. Улаан бичил биетгүй бэлдмэлийг хүчилд тэсвэртэй савханцар ажиглагдсангүй гэж мэдээлэхээс биш, сүрьеэгийн шинжилгээ сөрөг гэж хэзээ ч мэдээлэхгүй. Хөх талбай нь будалт явагдсан, эсүүд эсрэг будгийг шингээсэн, оптикийн нөхцөл хангалттай байсныг нотлох боловч илрүүлэх хязгаараас доогуур тоотой бичил биетийн талаар юу ч хэлэхгүй учраас энэ ялгаа чухал. Улаан дүрсгүй хөх талбай нь бэлдмэлийн тухай хүчинтэй үр дүн болохоос өвчтөний тухай эцсийн дүгнэлт биш.

Үе шат бүрийн үүргийг санавал хариуг зөв бичихэд хялбар. Карбол фуксин сэжигтэй бичил биетүүдийг илрүүлнэ. Хүчил-спирт сорилыг гүйцэтгэнэ. Метилений хөх зөвхөн хариуг уншихуйц болгоно: улаан нь хүчлийн үйлчлэлд будгийг хадгалсан, хөх нь будгаа алдсан гэсэн үг. Бусад бүх мэдээлэл буюу зүйл, бичил биетийн хэмжээ, эмнэлзүйн утгыг бэлдмэлээс гаднах шинжилгээ, үнэлгээгээр тогтооно.