ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് സ്റ്റെയിനിങ്ങും: വ്യത്യസ്തമായ ഒരു ചായവും ജീവനുള്ള കോശങ്ങൾക്കായുള്ള ഒരു രീതിയും

ഒരു വിദ്യാർഥി റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് എണ്ണലിനായി തയ്യാറെടുക്കുന്നു, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഓർഡർ ചെയ്യുന്നു, അത് രക്തവുമായി കലർത്തുന്നു, എന്നാൽ ഏതാണ്ട് ഒന്നും കാണുന്നില്ല. ഒരു സഹപാഠി ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ എന്ന് ലേബൽ ചെയ്ത കുപ്പി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ചുവന്ന രക്തകോശങ്ങളിൽ ഒരു വിഭാഗത്തിനുള്ളിൽ വ്യക്തമായ നീല നാരുകൾ കാണുന്നു. രണ്ടാമത്തെ കുപ്പിയിലെ ചായം കൂടുതൽ പുതുമയുള്ളതോ കൂടുതൽ സാന്ദ്രതയുള്ളതോ ആയിരിക്കുമെന്ന് ആദ്യ വിദ്യാർഥി കരുതുന്നു. രണ്ടുമല്ല. അതിലുള്ളത് വ്യത്യസ്തമായ ഒരു തന്മാത്രയാണ്.

ഈ മേഖലയിലെ മിക്ക ആശയക്കുഴപ്പങ്ങൾക്കും പിന്നിലുള്ള അടിസ്ഥാന ധാരണാപിശക് ഇതാണ്. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ മെച്ചപ്പെടുത്തിയ ഒരു ബാച്ചാണ് ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ എന്ന് പേര് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എന്നാൽ രസതന്ത്രം പറയുന്നത് മറ്റൊന്നാണ്. ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ N, സ്വന്തമായ കളർ ഇൻഡക്സ് നമ്പറും പ്രതിസ്ഥാപന ക്രമവും ഹീമറ്റോളജിയിൽ സ്വന്തമായ മാനദണ്ഡപ്പെടുത്തിയ ഉപയോഗവുമുള്ള വ്യത്യസ്തമായ ഒരു ഫീനോതയസീൻ ചായമാണ്. ഈ വ്യത്യാസം വ്യക്തമായാൽ, രീതിയുടെ ബാക്കി ഭാഗങ്ങൾ—സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുമ്പോൾ കോശങ്ങൾ ജീവനോടെ ഇരിക്കേണ്ടത് എന്തുകൊണ്ട്, എന്തിനെയാണ് റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റായി എണ്ണേണ്ടത്, ഹൈൻസ് ബോഡികളുടെ സ്ഥാനം എന്താണ്, ബ്രില്യന്റ് ക്രെസിൽ ബ്ലൂ എപ്പോഴാണ് പ്രസക്തമാകുന്നത്—എളുപ്പത്തിൽ മനസ്സിലാക്കാം.

ചുരുക്കത്തിലുള്ള ഉത്തരം

ഹീമറ്റോളജി റീഏജന്റായ ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ N സാധാരണയായി ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ PubChem രേഖയിലെ ബേസിക് ബ്ലൂ 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, C18H22ClN3S എന്ന സൂത്രവാക്യമുള്ള സംയുക്തം എന്നിങ്ങനെയാണ് തിരിച്ചറിയപ്പെടുന്നത്. സാധാരണ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അതിന്റെ PubChem രേഖയിലെ മെത്തിൽതയോണിനിയം ക്ലോറൈഡ്, ബേസിക് ബ്ലൂ 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, C16H18ClN3S എന്ന സൂത്രവാക്യമുള്ള സംയുക്തമാണ്. ഘടനാപരമായി, ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് വലയത്തിൽ രണ്ട് മെത്തിൽ ഗ്രൂപ്പുകളും എഥൈൽഅമിനോ പാർശ്വശൃംഖലകളുമുണ്ട്; മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിൽ അതിനു പകരം ഡൈമെത്തിൽഅമിനോ ഗ്രൂപ്പുകളാണുള്ളത്. ഈ വ്യത്യാസം സ്റ്റെയിനിങ് സ്വഭാവത്തെ മാറ്റുന്നു. ഹീമറ്റോളജി ഗ്രന്ഥങ്ങൾ സാധാരണ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ താരതമ്യേന മോശമായ റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് സ്റ്റെയിനായും ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ കൂടുതൽ തീവ്രവും ഏകീകൃതവുമായ സ്റ്റെയിനായും വിവരിക്കുന്നു. ഈ താരതമ്യം ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെക്കുറിച്ചുള്ള ScienceDirect വിഷയാവലോകനത്തിൽ സംഗ്രഹിച്ചിട്ടുണ്ട്.

അതെ, ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒരു സുപ്രാവൈറ്റൽ സ്റ്റെയിനാണ്. സുപ്രാവൈറ്റൽ സ്റ്റെയിനിങ്ങിന്റെ തത്ത്വങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള NCBI അവലോകനത്തിൽ നിർവചിക്കുന്നതുപോലെ, ശരീരത്തിൽനിന്ന് നീക്കം ചെയ്തശേഷവും ഫിക്സേഷന് മുമ്പും ജീവനുള്ള കോശങ്ങളെ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നതാണ് സുപ്രാവൈറ്റൽ സ്റ്റെയിനിങ്. ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും ബ്രില്യന്റ് ക്രെസിൽ ബ്ലൂവും ഈ വിഭാഗത്തിൽപ്പെടുന്നു; CLSI റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് മാനദണ്ഡം ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ വ്യക്തമായി ഒരു സുപ്രാവൈറ്റൽ ചായമായി ഉൾക്കൊള്ളുന്നു. ചിലപ്പോൾ വിദ്യാർഥികൾ ഇതിനെ ഫിക്സ് ചെയ്ത ഫിലിമുകളുടെ റൊമനോവ്സ്കി സ്റ്റെയിനിങ്ങിനൊപ്പം മനസ്സിൽ വർഗീകരിക്കുന്നു. ആ ധാരണ ഇവിടെ ശരിയല്ല. ആദ്യം ഫിക്സ് ചെയ്താൽ ഈ രീതി പ്രവർത്തിക്കാതാകും.

സമാനമായ ചായപ്പേരുകൾ പരിശോധിക്കുന്ന വായനക്കാർക്കായി, മെത്തിൽ ബ്ലൂവും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം എന്ന ലേഖനം ഋണായോണിക ട്രൈഅരൈൽമീഥേൻ ചായവും ധനായോണിക ഫീനോതയസീൻ കുടുംബവും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യസ്തവും കൂടുതൽ വ്യാപകവുമായ ആശയക്കുഴപ്പം വിശദീകരിക്കുന്നു. ലബോറട്ടറി സ്റ്റെയിനിങ് അവലോകനം ഫിക്സ് ചെയ്ത ഫിലിം രീതികൾക്കൊപ്പം സുപ്രാവൈറ്റൽ പ്രവർത്തനങ്ങളുടെ സ്ഥാനവും വിശദീകരിക്കുന്നു; രക്തകോശ രൂപഘടനാ മാർഗദർശി വിപുലമായ ഡിഫറൻഷ്യൽ വിലയിരുത്തലിൽ റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് പരിശോധന എവിടെയാണ് ഉൾപ്പെടുന്നതെന്ന് കാണിക്കുന്നു.

കാറ്റലോഗ് സംബന്ധിച്ച ഒരു മുൻകരുതൽ: ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ വ്യത്യസ്തമായ ഒരു സിങ്ക് ക്ലോറൈഡ് ഇരട്ടലവണരൂപം CAS 6586-05-6 എന്ന നമ്പറിൽ ലഭ്യമാണ്. അതിനാൽ രീതികൾ വിവരിക്കുന്ന വിഭാഗത്തിൽ പൊതുവായ പേര് മാത്രമല്ല, ലവണരൂപവും വിതരണക്കാരനും വ്യക്തമാക്കണം.

സുപ്രാവൈറ്റൽ സ്റ്റെയിനിങ് യഥാർഥത്തിൽ ചെയ്യുന്നത്

ന്യൂക്ലിയസ് നഷ്ടപ്പെട്ടെങ്കിലും ശേഷിച്ച റൈബോസോമൽ RNA നിലനിർത്തുന്ന ഇളം ചുവന്ന രക്തകോശമാണ് റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ്. സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാത്ത നനവുള്ള പ്രിപ്പറേഷനിൽ ആ RNA ദൃശ്യമല്ല. സുപ്രാവൈറ്റൽ ചായം ജീവനുള്ള കോശത്തിലേക്ക് കടന്ന് ആ RNA-യെ അവക്ഷേപിപ്പിക്കുകയോ കൂട്ടിച്ചേർക്കുകയോ ചെയ്ത് നീല തരികളും നാരുകളുമാക്കി മാറ്റുന്നു; ഓയിൽ ഇമ്മർഷനിൽ കാണുന്ന റെറ്റിക്കുലോഫിലമെന്റസ് പദാർഥം ഇതാണ്. അതിനാൽ ഈ വലയം സ്റ്റെയിനിങ്ങിലൂടെ ഉണ്ടാകുന്നതാണ്; നിറം ലഭിക്കാൻ കാത്തിരിക്കുന്ന, മുൻകൂട്ടി രൂപപ്പെട്ട ഒരു അസ്ഥികൂടമല്ല. അതുകൊണ്ടാണ് പ്രോട്ടോക്കോളിലെ ഘടകങ്ങൾ—ചായത്തിന്റെ സാന്ദ്രത, ബഫർ, രക്തവും ചായവും തമ്മിലുള്ള അനുപാതം, താപനില, സമയം—ചായത്തിന്റെ പേരിനോളം പ്രധാനമാകുന്നത്.

പ്രായോഗികമായി ഇതിന് കർശനമായ ഒരു പ്രവർത്തനക്രമമുണ്ട്: ആദ്യം രക്തം കട്ടപിടിക്കാതിരിക്കാൻ ആന്റികൊആഗുലന്റ് ചേർത്ത രക്തം ചായവുമായി കലർത്തുക, ഇൻക്യുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് ഫിലിമുകൾ തയ്യാറാക്കി ഫിക്സ് ചെയ്യാതെയും കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാതെയും പരിശോധിക്കുക. സ്റ്റെയിനിങ്ങിന് മുമ്പുള്ള ഫിക്സേഷനോ മങ്ങിയ നാരുകൾ മറയ്ക്കുന്ന കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനോ എണ്ണലിന് ആവശ്യമായ വിവരങ്ങൾ നശിപ്പിക്കുന്നു.

ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ചുള്ള പ്രായോഗിക റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് പ്രോട്ടോക്കോൾ

എല്ലായിടത്തും ബാധകമായ ഒരൊറ്റ ഫോർമുലേഷൻ ഇല്ല; അതിനാൽ ഉപയോഗിച്ചത് ഏതെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുക. രേഖപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ള മൂന്ന് വകഭേദങ്ങൾ ഈ വൈവിധ്യം കാണിക്കുന്നു.

പരമ്പരാഗത ബ്രെച്ചർ രീതിയിൽ പൊട്ടാസ്യം ഓക്സലേറ്റിനൊപ്പം ഏകദേശം 0.5 ശതമാനം ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ഇത് നന്നായി കലർത്തിയ EDTA രക്തവുമായി തുല്യ വ്യാപ്തത്തിൽ ചേർത്ത് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഏകദേശം 10 മുതൽ 15 മിനിറ്റ് വരെ ഇൻക്യുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നു. വീണ്ടും മെല്ലെ കലർത്തിയശേഷം നേർത്ത വെഡ്ജ് ഫിലിമുകൾ തയ്യാറാക്കി വായുവിൽ ഉണക്കി, ഫിക്സ് ചെയ്യാതെ 100x ഓയിൽ ഒബ്ജക്റ്റീവിൽ പരിശോധിക്കുന്നു. റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് എണ്ണലിനുള്ള NCBI നടപടിക്രമം ഈ പ്രവർത്തനക്രമവും അതിനൊപ്പം ഉപയോഗിക്കുന്ന എണ്ണൽ ചട്ടക്കൂടും വിവരിക്കുന്നു.

ഡേസി ആൻഡ് ലൂയിസ് വകഭേദത്തിൽ സിട്രേറ്റ് സലൈൻ ലായനിയിലെ 1.0 ശതമാനം ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ, രക്തത്തിന്റെ 2 മുതൽ 4 വ്യാപ്ത അളവുകളുമായി കലർത്തി, ഫിലിം തയ്യാറാക്കുന്നതിന് മുമ്പ് 37 C-ൽ 15 മുതൽ 20 മിനിറ്റ് വരെ വയ്ക്കുന്നു. CLSI H44 നടപടിക്രമത്തിന്റെ സമീപകാല സമന്വയ നടപ്പാക്കലിൽ, pH 7.4 ഉള്ള ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർഡ് സലൈനിലെ സാന്ദ്രത കുറഞ്ഞ 0.1 ശതമാനം ലായനി ഉപയോഗിച്ചു; 20 C-ൽ 10 മിനിറ്റ് ഇൻക്യുബേറ്റ് ചെയ്തു, ഫിക്സേഷൻ നടത്തിയില്ല. ഇത് 2026-ലെ NMB സമന്വയ പഠനത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.

എണ്ണൽ നിയമങ്ങൾ എല്ലാ വകഭേദങ്ങൾക്കും പൊതുവാണ്. ഒരു കോശത്തിൽ നീല നിറത്തിൽ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത കുറഞ്ഞത് രണ്ട് വേർതിരിഞ്ഞ തരികളോ നാരുകളുടെ ഭാഗങ്ങളോ ഉണ്ടെങ്കിൽ അതിനെ റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റായി എണ്ണുക; ഒറ്റപ്പെട്ട സ്റ്റെയിൻ നിക്ഷേപം ഇതിലൂടെ ഒഴിവാക്കുന്നു. പതിവ് പരിശോധനയിൽ കുറഞ്ഞത് 1,000 ചുവന്ന രക്തകോശങ്ങൾ എണ്ണുകയും റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റുകൾ ശതമാനമായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുകയും വേണം. ശതമാനം കുറവാണെങ്കിൽ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകളുടെ ആവശ്യകത നിറവേറ്റാൻ കൂടുതൽ കോശങ്ങൾ എണ്ണണം. റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റുകൾ ഏകദേശം 1 ശതമാനമായിരിക്കുമ്പോൾ എണ്ണലിലെ വ്യതിയാനം 5 ശതമാനത്തിലേക്ക് എത്തിക്കാൻ ഏകദേശം 4,400 കോശങ്ങൾ ആവശ്യമാണെന്ന് CLSI H44 രീതിയുടെ ഒരു അവലോകനം ചൂണ്ടിക്കാട്ടുന്നു; ഇത് De Gruyter-ലെ CLSI H44 അവലോകനത്തിൽ കാണാം. മില്ലർ ഒക്യുലാർ ഡിസ്ക് വലിയ എണ്ണലുകൾ പ്രായോഗികമാക്കുന്നു. ചായം ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയോ പുതുതായി തയ്യാറാക്കുകയോ വേണം; അവക്ഷേപം തരിരൂപത്തിലുള്ള ഉൾച്ചേർക്കലുകളെ അനുകരിക്കാം.

അതേ പ്രിപ്പറേഷനിലെ ഹൈൻസ് ബോഡികൾ

അതേ സുപ്രാവൈറ്റൽ ഫിലിമിൽ ഹൈൻസ് ബോഡികളും കാണാനാകും. അവ ശേഷിച്ച RNA അല്ല, ഓക്സീകരിക്കപ്പെടുകയും സ്വാഭാവിക ഘടന നഷ്ടപ്പെടുകയും ചെയ്ത ഹീമോഗ്ലോബിന്റെ കൂട്ടങ്ങളാണ്. ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ പ്രിപ്പറേഷനുകളിൽ അവ വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ബോഡികളായി കാണപ്പെടുന്നു; പലപ്പോഴും ഒറ്റയ്ക്കും കോശസ്തരത്തിനടുത്തുമാണ് കാണുക. റെറ്റിക്കുലോഫിലമെന്റസ് പദാർഥത്തെക്കാൾ ഇളം നീല നിറത്തിലാണ് അവ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നത്. ഫിക്സേഷനും കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനിങ്ങും കഴിഞ്ഞാൽ അവ നന്നായി നിലനിൽക്കില്ല; അതിനാൽ ഫിക്സ് ചെയ്യാത്ത ഫിലിം പരിശോധിക്കുക. EDTA രക്തത്തിന്റെ 20 മൈക്രോലിറ്ററും 1 ശതമാനം ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ 20 മൈക്രോലിറ്ററും ഉപയോഗിച്ച് 15 മിനിറ്റ് ഇൻക്യുബേറ്റ് ചെയ്ത സമീപകാല പ്രോട്ടോക്കോളിൽ 250 എരിത്രോസൈറ്റുകൾക്കിടയിലെ ഹൈൻസ് ബോഡി പോസിറ്റീവ് കോശങ്ങൾ എണ്ണി. ഇത് ആ നടപടിക്രമം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്ന PMC പഠനത്തിൽ വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്.

രണ്ട് വ്യത്യാസങ്ങൾ തെറ്റായ വായനകൾ തടയുന്നു. ഒന്നാമതായി, ഹൈൻസ് ബോഡികളെക്കുറിച്ചുള്ള ScienceDirect വിഷയാവലോകനത്തിൽ സൂചിപ്പിക്കുന്നതുപോലെ, മെത്തിൽ വയലറ്റും ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റും ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെക്കാൾ തീവ്രമായി ഹൈൻസ് ബോഡികളെ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നു. റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റുകളും ഹൈൻസ് ബോഡികളും ഒരുമിച്ച് വിലയിരുത്തുമ്പോൾ ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സൗകര്യപ്രദമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പാണ്; ഹൈൻസ് ബോഡികൾക്കായി മാത്രമുള്ള ഏറ്റവും ശക്തമായ ചായമല്ല അത്. രണ്ടാമതായി, ആൽഫ തലസീമിയ ട്രെയിറ്റിലെ HbH ഉൾച്ചേർക്കലുകൾ സുപ്രാവൈറ്റൽ സ്റ്റെയിനിങ്ങിന് ശേഷം കോശത്തിലുടനീളം നിരവധി സൂക്ഷ്മ ബിന്ദുക്കളായി കാണപ്പെടുന്നു. എന്നാൽ സാധാരണ ഹൈൻസ് ബോഡികൾ എണ്ണത്തിൽ കുറവും വലുപ്പത്തിൽ കൂടുതലുമാണ്; പലപ്പോഴും കോശസ്തരവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കും. സമാനമായി തോന്നിക്കുന്ന മൂന്നാമത്തെ ഘടകം സ്റ്റെയിൻ നിക്ഷേപമാണ്: അത് കോശങ്ങളുടെ ഫോക്കൽ തലത്തിന് പുറത്താണ് സ്ഥിതിചെയ്യുന്നത്, ഓരോ ദൃശ്യക്ഷേത്രത്തിലും വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു.

ബ്രില്യന്റ് ക്രെസിൽ ബ്ലൂവും ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും തമ്മിലുള്ള താരതമ്യം

രണ്ട് ചായങ്ങളും റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റുകൾക്കുള്ള സുപ്രാവൈറ്റൽ സ്റ്റെയിനുകളാണ്, എന്നാൽ മാനദണ്ഡപ്പെടുത്തലിൽ അവയിലൊന്നിനാണ് മുൻഗണന. ഇന്റർനാഷണൽ കൗൺസിൽ ഫോർ സ്റ്റാൻഡർഡൈസേഷൻ ഇൻ ഹീമറ്റോളജിയുമായി ചേർന്ന് വികസിപ്പിച്ചതും CLSI H44 മാനദണ്ഡ പേജിൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളതുമായ CLSI H44-A2 റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് രീതി, EDTA രക്തത്തെ ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നതിനെ മാനുവൽ താരതമ്യ രീതിയായി നിർദേശിക്കുന്നു. പരമ്പരാഗത ഹീമറ്റോളജി പഠനവും ദൃശ്യഫലത്തെക്കുറിച്ച് ഇതേ നിലപാടാണ് പുലർത്തുന്നത്: ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ കൂടുതൽ തീവ്രവും ഏകീകൃതവുമായ നാർ സ്റ്റെയിനിങ് നൽകുന്നു; ബ്രില്യന്റ് ക്രെസിൽ ബ്ലൂവിൽ ബാച്ചുകൾക്കിടയിലും സാമ്പിളുകൾക്കിടയിലും കൂടുതൽ വ്യതിയാനമുണ്ട്.

ഈ സ്ഥാനത്തോടൊപ്പം ഒരു പരിമിതി വ്യക്തമാക്കേണ്ടതുണ്ട്. ICSH അനലൈസർ വിലയിരുത്തൽ മാർഗനിർദേശം മാനുവൽ ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ മൈക്രോസ്കോപ്പിയെ ഒരു റഫറൻസ് താരതമ്യ സമീപനമായി അംഗീകരിക്കുന്നു. എന്നാൽ അത് നിരീക്ഷകന്റെ വിധിനിർണയത്തെ ആശ്രയിക്കുന്നതും താരതമ്യേന കൃത്യത കുറഞ്ഞതുമാണെന്ന് ചൂണ്ടിക്കാട്ടുകയും ലഭ്യമായിടത്ത് ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രിക് റഫറൻസ് നടപടിക്രമങ്ങൾക്ക് മുൻഗണന നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു. 100 സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിച്ച 2022-ലെ ഒരു താരതമ്യത്തിൽ, ഉപയോഗിച്ച അനലൈസറുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെക്കാൾ കുറഞ്ഞ ബയസ് ബ്രില്യന്റ് ക്രെസിൽ ബ്ലൂവിനുണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി. ഇത് സ്റ്റെയിനിങ് രീതികളുടെ PMC താരതമ്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. വിദ്യാർഥികൾക്കായി തെളിവുകൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന സംഗ്രഹം ഇതാണ്: മാനദണ്ഡപ്പെടുത്തിയ മാനുവൽ താരതമ്യ റീഏജന്റായി ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിക്കുക; പ്രാദേശികമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഏതൊരു ബ്രില്യന്റ് ക്രെസിൽ ബ്ലൂ രീതിയും അതുമായോ ഓട്ടോമേറ്റഡ് രീതിയുമായോ താരതമ്യം ചെയ്ത് സ്ഥിരീകരിക്കുക; ഏത് ചായം ഉപയോഗിച്ചാലും മാനുവൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിയിൽ ഫലങ്ങൾക്ക് കൂടുതൽ ചിതറൽ പ്രതീക്ഷിക്കുക. വാണിജ്യ ചായ ബാച്ചുകൾ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരുന്നതിനാൽ രാസപരമായി കൂടുതൽ ശുദ്ധമായ പകരമായി ശുദ്ധീകരിച്ച Azure B ഉപയോഗിക്കണമെന്നും പഴയ മാനദണ്ഡപ്പെടുത്തൽ സാഹിത്യം നിർദേശിച്ചിരുന്നു. Azure B-യെക്കുറിച്ചുള്ള മാർഷൽ പഠനത്തിൽ ഇതു കാണാം; രീതികളെക്കുറിച്ചുള്ള ചർച്ചകളിൽ റീഏജന്റിന്റെ ഗ്രേഡ് ഇപ്പോഴും പരാമർശിക്കപ്പെടുന്നത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് ഇത് വിശദീകരിക്കുന്നു.

പതിവ് പിശകുകൾ ഒഴിവാക്കൽ

പരാജയപ്പെടുന്ന മിക്ക പ്രിപ്പറേഷനുകൾക്കും കാരണം നാല് പിശകുകളാണ്. ന്യൂ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ N-ന് പകരം സാധാരണ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഓർഡർ ചെയ്യുന്നത് ദുർബലമായ സ്റ്റെയിനിങ്ങിന് കാരണമാകുന്നു; അതിന് കാരണം സാങ്കേതികതയല്ല, രാസഘടനയാണ്. വായിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഫിക്സ് ചെയ്യുകയോ കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുകയോ ചെയ്യുന്നത് സുപ്രാവൈറ്റൽ സൂചന ഇല്ലാതാക്കുന്നു. സ്റ്റെയിൻ അവക്ഷേപത്തെ തരികളായി എണ്ണുന്നത് ഫലം അമിതമാക്കുന്നു; കുറഞ്ഞത് രണ്ട് തരികൾ വേണമെന്ന നിയമവും ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ചായവും ഇത് തടയുന്നു. റെറ്റിക്കുലോസൈറ്റ് ശതമാനം കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ വളരെ കുറച്ച് കോശങ്ങൾ മാത്രം എണ്ണുന്നത് കൃത്യമെന്ന് തോന്നിക്കുന്ന, എന്നാൽ വിശാലമായ വിശ്വാസപരിധികളുള്ള ഒരു സംഖ്യ നൽകുന്നു. ഓരോ പിശകിന്റെയും ലക്ഷണം ഒന്നുതന്നെ: റീഏജന്റ് ഘട്ടം നിർണയിച്ച ഫലത്തിന് മൈക്രോസ്കോപ്പിസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പിനെ കുറ്റപ്പെടുത്തുന്നു.