മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ പ്രതിക്രിയാശീല ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകൾ അളക്കൽ

രണ്ട് ലബോറട്ടറികൾ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ആന്റിഓക്സിഡന്റ് പരീക്ഷണം എന്ന് ഓരോന്നും വിശേഷിപ്പിക്കുന്ന പരീക്ഷണം നടത്തുന്നു. ഡൈ പ്രതിക്രിയാശീല ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകളെ കുറയ്ക്കുന്നുവെന്ന് ഒന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. അവയെ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് മറ്റൊന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. രണ്ടും വ്യക്തമായ ഡോസ്–പ്രതികരണ വക്രങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. രണ്ടും സത്യസന്ധമാണ്. വ്യത്യാസത്തിന് കാരണം വഞ്ചനയോ കഴിവില്ലായ്മയോ അല്ല. വ്യത്യസ്ത ചോദ്യങ്ങൾക്ക് ഉത്തരം നൽകുന്ന പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിച്ച്, വ്യത്യസ്ത പ്രകാശസാഹചര്യങ്ങളിൽ, വ്യത്യസ്ത കാര്യങ്ങളാണ് ഈ രണ്ട് സംഘങ്ങളും അളന്നത്. തുടർന്ന് രണ്ട് ഉത്തരങ്ങളെയും ഒരേ വാക്കുകൊണ്ട് വിശേഷിപ്പിച്ചു: ROS.

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ കൃത്യമായി അളക്കാൻ പ്രയാസമുള്ള ഒരു തന്മാത്രയാണ്; നിരീക്ഷിക്കേണ്ട രാസപ്രക്രിയയിൽ അത് സ്വയം പങ്കെടുക്കുന്നു എന്നതാണ് കാരണം. ഇരുട്ടിൽ അത് ദാതാക്കൾക്കും സ്വീകർത്താക്കൾക്കുമിടയിൽ ഇലക്ട്രോണുകളെ കൈമാറുകയും വീണ്ടും ചക്രത്തിൽ പങ്കെടുക്കാൻ തയ്യാറായി പ്രാരംഭ രൂപത്തിലേക്ക് മടങ്ങുകയും ചെയ്യുന്നു. പ്രകാശത്തിൽ അത് ഒരു ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറായി മാറി, ഉത്തേജിത ട്രിപ്ലെറ്റ് അവസ്ഥയിലെത്തുന്നു. അവിടെനിന്ന് ഓക്സിജന് ഊർജം കൈമാറി സിംഗ്ലെറ്റ് ഓക്സിജൻ ഉണ്ടാക്കാനോ ഇലക്ട്രോണുകൾ കൈമാറി റാഡിക്കലുകളും ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡും ഉണ്ടാക്കാനോ കഴിയും. ആ സംവിധാനത്തിൽ ചേർക്കുന്ന ഏത് പ്രോബിനെയും ഡൈയ്ക്ക് തന്നെ ഓക്സീകരിക്കാനോ നിരോക്സീകരിക്കാനോ നിറം മങ്ങിക്കാനോ പ്രകാശപരമായി മറയ്ക്കാനോ കഴിയും. അതിനാൽ ഏതൊരു ROS അളവുഫലത്തെയും കുറിച്ചുള്ള ആദ്യ ചോദ്യം സംഖ്യ എത്രയാണ് എന്നതല്ല. അസേ യഥാർത്ഥത്തിൽ എന്താണ് കണ്ടെത്തുന്നത്, ഡൈ അസേയെ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്നതാണ്.

Amplex Red: കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് അസേ

ശരിയായി സജ്ജീകരിക്കുമ്പോൾ, ഈ വിഷയത്തിലെ ഗവേഷണസാഹിത്യത്തിൽ ഏറ്റവും ഉറപ്പോടെ ന്യായീകരിക്കാവുന്ന കൂട്ടുകെട്ടാണ് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ Amplex Red. ഇതിന്റെ രാസപ്രക്രിയ നിർദ്ദിഷ്ടമാണ്: ഹോഴ്സ്റാഡിഷ് പെറോക്സിഡേസ് ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് Amplex സബ്‌സ്ട്രേറ്റിനെ ഫ്ലൂറസന്റ് ഉൽപ്പന്നമായ റെസോറുഫിനായി ഓക്സീകരിക്കുന്നു; സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രി ഏകദേശം ഒന്നിന് ഒന്ന് എന്ന അനുപാതത്തിലാണ്. സാമ്പിളിലെ പെറോക്സൈഡ് ഡിറ്റക്ടറിൽ ഫ്ലൂറസൻസായി മാറുന്നു. പരമ്പരാഗതമായി ROS കുടുംബത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തുന്ന മറ്റൊന്നും ഈ പ്രതികരണത്തെ നേരിട്ട് നയിക്കുന്നില്ല.

നിർണായകമായ നേട്ടം കാലിബ്രേഷനാണ്. ശ്രദ്ധയോടെ പ്രവർത്തിക്കുന്ന ഗവേഷകൻ അതേ ബഫറിൽ, അതേ പെറോക്സിഡേസ്, സബ്‌സ്ട്രേറ്റ് സാന്ദ്രതകളോടെ, അതേ ഇൻക്യുബേഷൻ സമയവും പ്രകാശപരമായ ക്രമീകരണങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച്, അറിയാവുന്ന പെറോക്സൈഡ് സ്റ്റാൻഡേർഡുകൾ പരിശോധിക്കുന്നു. തുടർന്ന് ആ വക്രവുമായി താരതമ്യം ചെയ്ത് സാമ്പിളുകളുടെ ഫലങ്ങൾ വായിക്കുന്നു. ഈ രീതിക്ക് അടിത്തറയായ, വേർതിരിച്ചെടുത്ത മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിൽ ഗവേഷകർ കൃത്യമായി ഇതുതന്നെ ചെയ്തു. ഓരോ പരീക്ഷണത്തിന്റെയും അവസാനം അറിയാവുന്ന അളവിൽ പെറോക്സൈഡ് ചേർത്തു; ഫലങ്ങൾ ഏകപക്ഷീയമായ ഫ്ലൂറസൻസ് യൂണിറ്റുകൾക്ക് പകരം, ഒരു മില്ലിഗ്രാം പ്രോട്ടീനിന് ഒരു മിനിറ്റിൽ എത്ര പിക്കോമോൾ എന്ന നിരക്കിലാണ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തത്. ഒരു തിളക്കത്തെ അളവാക്കി മാറ്റുന്നത് ഇതാണ്.

ആ പഠനത്തിലെ മൂന്ന് വിശദാംശങ്ങൾ പിന്തുടരേണ്ടതാണ്. ഒന്നാമതായി, പെറോക്സൈഡിനെ നശിപ്പിക്കുന്ന കാറ്റലേസ് ഉപയോഗിച്ച് ഗവേഷകർ സിഗ്നൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു. കാറ്റലേസ് ചേർത്തപ്പോൾ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ മൂലമുള്ള ഫ്ലൂറസൻസ് വർധന നിലച്ചു; സിഗ്നൽ പ്രകാശപരമായ ആർട്ടിഫാക്റ്റല്ല, പെറോക്സൈഡാണ് എന്ന് ഇത് സ്ഥിരീകരിച്ചു. രണ്ടാമതായി, ഉത്തേജന പ്രകാശകിരണം ഷട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് നിയന്ത്രിച്ച്, സാധാരണ പ്രകാശ ഡോസിന്റെ എട്ടിലൊന്ന് മാത്രം സാമ്പിളുകൾക്ക് ലഭിക്കുന്ന രീതിയിൽ അവർ പ്രകാശത്തിന്റെ സ്വാധീനം നേരിട്ട് പരിശോധിച്ചു. സിഗ്നൽ കുറഞ്ഞത് ഒമ്പത് ശതമാനം മാത്രം. അവർ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത പെറോക്സൈഡിന്റെ തൊണ്ണൂറ് ശതമാനത്തിലധികവും അളക്കലിനുപയോഗിച്ച പ്രകാശത്തിൽനിന്ന് സ്വതന്ത്രമായിരുന്നു. മൂന്നാമതായി, ഒരു ഇലക്ട്രോഡ് ഉപയോഗിച്ച് പെറോക്സൈഡ് നീക്കംചെയ്യപ്പെടുന്നത് പ്രത്യേകം അളന്നു. ഡൈ ഉൽപ്പാദനം വർധിപ്പിക്കുകയും നീക്കംചെയ്യൽ മന്ദഗതിയിലാക്കുകയും ചെയ്യുന്നതായി കണ്ടെത്തി. ആകെ ഫ്ലൂറസൻസ് മാത്രം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്ന ഒരു പ്രോബ് ഈ രണ്ട് ഫലങ്ങളെയും ഒന്നായി കലർത്തുമായിരുന്നു.

ഈ അസേയ്ക്കും തെറ്റായ ഫലങ്ങൾ നൽകുന്ന സാഹചര്യങ്ങളുണ്ട്; മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അവയിൽ പലതും സൃഷ്ടിക്കുന്നു. റെസോറുഫിൻ പ്രകാശം പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന അതേ ചുവപ്പ് മേഖലയിലുടനീളം ഡൈ വ്യാപകമായി പ്രകാശം ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ ഉയർന്ന ഡൈ സാന്ദ്രതകളിൽ, ആന്തരിക ഫിൽട്ടർ പ്രഭാവങ്ങളിലൂടെ സാമ്പിളിന് സ്വന്തം സിഗ്നൽ മറയ്ക്കാൻ കഴിയും. അതുകൊണ്ട് സ്റ്റാൻഡേർഡുകളിലും സാമ്പിളുകളിലേതിന് തുല്യമായ ഡൈ സാന്ദ്രത ഉണ്ടായിരിക്കണം. Amplex Red സ്വയം ഫോട്ടോഓക്സീകരണത്തിന് വിധേയമാകാനും കഴിയും. അതിന്റെ ഉൽപ്പന്നമായ റെസോറുഫിന് സൂപ്പർഓക്സൈഡും പെറോക്സൈഡും സൃഷ്ടിക്കുന്ന ഫോട്ടോറെഡോക്സ് ചക്രങ്ങളിൽ പങ്കെടുക്കാനും കഴിയും. പരീക്ഷണത്തിൽ ഒരു ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറിനെയും പ്രകാശിപ്പിക്കുമ്പോൾ ഇത് വളരെ പ്രധാനമാണ്. ഡൈയും പ്രോബും ഒരുമിച്ച് പ്രകാശിപ്പിക്കുന്നതിനു പകരം, ആദ്യം മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സാമ്പിളുകൾക്ക് പ്രകാശം നൽകുകയും തുടർന്ന് അവയുടെ അലിക്കോട്ടുകൾ Amplex റീയജന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇരുട്ടിൽ പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതാണ് പ്രായോഗിക പരിഹാരം. അവസാനമായി, സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മ്യൂട്ടേസ് ഒരു Amplex സിഗ്നലിനെ വെറുതെ കുറയ്ക്കുകയല്ല ചെയ്യുന്നത്: സൂപ്പർഓക്സൈഡിനെ പെറോക്സൈഡാക്കി മാറ്റുന്നത് സിഗ്നൽ വർധിപ്പിക്കാം. ഫ്ലൂറസൻസ് വർധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു SOD കൺട്രോൾ പരാജയപ്പെട്ടതല്ല. പ്രതികരണശൃംഖലയിൽ മുൻപുള്ള ഒരു സ്പീഷീസായി സൂപ്പർഓക്സൈഡിനെ അത് തിരിച്ചറിഞ്ഞിരിക്കുകയാണ്.

DCFDA: നിർദ്ദിഷ്ടതയില്ലാത്ത ഓക്സീകരണ സൂചകം

ആശയക്കുഴപ്പങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗത്തിന്റെയും ഉറവിടം മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ DCFDA കൂട്ടുകെട്ടാണ്. കോശത്തിനുള്ളിലേക്ക് പ്രോബ് എത്തിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന മുൻഗാമിയാണ് DCFH-DA. കോശത്തിനുള്ളിലെ എസ്റ്ററേസുകൾ അതിന്റെ അസിറ്റേറ്റ് ഗ്രൂപ്പുകൾ നീക്കംചെയ്ത് ഫ്ലൂറസൻസ് ഇല്ലാത്ത DCFH ശേഷിപ്പിക്കുന്നു. DCFH-ന്റെ ഓക്സീകരണം ഫ്ലൂറസന്റ് DCF ഉണ്ടാക്കുന്നു. അതിനെ ഓക്സീകരിക്കുന്നവയുടെ പട്ടിക നീണ്ടതാണ്: ഹൈഡ്രോക്സിൽ റാഡിക്കലുകൾ, പെറോക്സിഡേസ്, ഹീം ഇടനില പദാർഥങ്ങൾ, നൈട്രജൻ ഡൈഓക്സൈഡ്, ഹൈപ്പോക്ലോറസ് ആസിഡ്, പെറോക്സിനൈട്രൈറ്റിൽനിന്ന് രൂപപ്പെടുന്ന റാഡിക്കലുകൾ. ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് മാത്രം അതിനെ പ്രയോജനകരമായ ഏതെങ്കിലും നിരക്കിൽ നേരിട്ട് ഓക്സീകരിക്കുന്നില്ല; പെറോക്സൈഡിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഫ്ലൂറസൻസിന് സാധാരണയായി ഇരുമ്പ്, ഹീം പ്രോട്ടീനുകൾ, അല്ലെങ്കിൽ പെറോക്സിഡേസ് രാസപ്രക്രിയ എന്നിവയുടെ പങ്കാളിത്തം ആവശ്യമാണ്.

ഓരോ രീതിവിവരണ വിഭാഗവും ഉദ്ധരിക്കേണ്ട വിമർശനം, കല്യാണരാമനും സഹപ്രവർത്തകരും DCFH-നെ ഒരു പ്രോബായി വിശകലനം ചെയ്തതിൽനിന്നാണ് വരുന്നത്. ഈ കാരണത്താൽ DCFDA നിരസിച്ച മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോണ്ട്രിയ പഠനത്തിൽ സംഗ്രഹിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഡൈ മന്ദഗതിയിൽ പ്രതികരിക്കുന്നുവെന്നും, അതിന്റെ സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രി നിർണയിച്ചിട്ടില്ലെന്നും, സാധുവായ കാലിബ്രേഷൻ ഇല്ലെന്നും, ROS അല്ലാത്ത സംയുക്തങ്ങളുമായും പ്രതികരിക്കുന്നുവെന്നും അവർ കാണിച്ചു. പ്രോബ് അളക്കുന്ന പ്രതിഭാസത്തെ വർധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു: DCFH-ന്റെ ഒറ്റ-ഇലക്ട്രോൺ ഓക്സീകരണം ഒരു DCF റാഡിക്കൽ ഉണ്ടാക്കുന്നു. അത് ഓക്സിജനുമായി പ്രതികരിച്ച് സൂപ്പർഓക്സൈഡ് സൃഷ്ടിക്കുകയും, അത് ഡിസ്മ്യൂട്ടേഷൻ വഴി അധിക പെറോക്സൈഡായി മാറുകയും ചെയ്യുന്നു. അളവുഫലം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്ന രാസപ്രക്രിയയുടെ ഒരു ഭാഗം അളക്കൽ സംവിധാനം തന്നെ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.

ഇതൊന്നും DCFDA ഉപയോഗശൂന്യമാക്കുന്നില്ല. തിരിച്ചറിയലിനുള്ള മാർഗമല്ല, ഒരു പ്രാഥമിക പരിശോധനയാണ് അതെന്ന് വ്യക്തമാക്കുന്നു. DCF ഫ്ലൂറസൻസ് ഉയരുന്നു എന്നത് ഓക്സിഡന്റിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള പ്രോബ് ഓക്സീകരണം വർധിച്ചു എന്നാണ് അർഥം. പെറോക്സൈഡ് വർധിച്ചു എന്ന് അതിന് അർഥമില്ല. മൊത്തം ROS വർധിച്ചു എന്ന് തീർച്ചയായും അർഥമില്ല; ഒരു പ്രോബിനും ഒറ്റയ്ക്ക് അളക്കാനാകാത്ത ഒരു അളവാണത്. ഒരു മൈക്രോമോളാറിന് മുകളിലുള്ള സാന്ദ്രതകളിൽ DCF ഓക്സീകരണത്തെ ആശ്രയിച്ച മുൻകാല മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ പഠനങ്ങൾ പ്രോഓക്സിഡന്റ് ഫലങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. അതേ കാലഘട്ടത്തിലെ മറ്റ് സംവിധാനങ്ങൾ പെറോക്സൈഡ് മൂലമുള്ള കോശമരണത്തിനെതിരായ സംരക്ഷണം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. വ്യത്യസ്ത റെഡോക്സ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഒരേ ഡൈയെക്കുറിച്ചുള്ള ഈ രണ്ട് നിരീക്ഷണങ്ങളും ശരിയാകാം. ഏത് ഓക്സിഡന്റാണ് സിഗ്നലിന് കാരണമായതെന്ന് DCF ഫലം മാത്രം പറയില്ല. മുൻകാല മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോണ്ട്രിയ പഠനത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം, ഈ പ്രാഥമിക പരിശോധനയ്ക്ക് പകരം കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത പെറോക്സൈഡ് അളക്കൽ ഉപയോഗിക്കുകയും പെറോക്സൈഡ് ഭാരം നേരിട്ട് കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തതിലാണ്: നൂറ് നാനോമോളാർ ഡൈ പോലും പരീക്ഷിച്ച എല്ലാ സബ്‌സ്ട്രേറ്റുകളിലും ശ്വസനാവസ്ഥകളിലും പെറോക്സൈഡ് പുറന്തള്ളൽ പലമടങ്ങ് വർധിപ്പിച്ചു.

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് പ്രത്യേകമായ മറ്റൊരു കെണിയും DCFDA-യ്ക്കുണ്ട്. ഡൈയ്ക്ക് തീവ്രമായ നിറമുണ്ട്; അത് റെഡോക്സ് പ്രവർത്തനക്ഷമവുമാണ്. അതിനാൽ കോശങ്ങളിലെ ROS-ൽനിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി ഫ്ലൂറസൻസ് മങ്ങിക്കാനോ പ്രകാശോത്സർജനം ശമിപ്പിക്കാനോ പ്രോബിന്റെ രാസഘടകങ്ങളെ ഓക്സീകരിക്കാനോ അതിന് കഴിയും. ഡൈയും പ്രോബും മാത്രമുള്ള, കോശങ്ങളില്ലാത്ത ഒരു കൺട്രോൾ ഐച്ഛികമായ അലങ്കാരമല്ല. ഡൈ പ്രോബുമായി ഇടപെടുന്നുണ്ടോ എന്ന് പറഞ്ഞുതരുന്ന പരീക്ഷണമാണത്.

സ്പിൻ ട്രാപ്പിങ്ങും ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗവും: തിരിച്ചറിയലും ഫ്ലക്സും

ഓക്സീകരിക്കാവുന്ന എന്തോ ഒന്ന് പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു എന്ന് ഫ്ലൂറസന്റ് പ്രോബുകൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുമ്പോൾ, സ്പിൻ ട്രാപ്പുകളോടുകൂടിയ ഇലക്ട്രോൺ സ്പിൻ റെസൊണൻസ് അത് എന്തായിരുന്നു എന്നതിന് കൂടുതൽ അടുത്ത ഉത്തരം നൽകുന്നു. ക്ലാസിക് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഫോട്ടോകെമിസ്ട്രി പഠനം ഡൈ, അസ്കോർബേറ്റ്, പ്രകാശം എന്നിവയിൽനിന്നുള്ള അസ്കോർബേറ്റ് റാഡിക്കൽ കണ്ടെത്താൻ ESR ഉപയോഗിച്ചു. തുടർന്ന് ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ പെറോക്സൈഡ് രൂപീകരണവും, സ്പിൻ ട്രാപ്പിങ് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഇരുമ്പ് ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്ന ഹൈഡ്രോക്സിൽ റാഡിക്കൽ രൂപീകരണവും കാണിച്ചു. മറ്റുള്ളവയ്ക്ക് ഉത്തരം നൽകാനാകാത്ത ചോദ്യത്തിനാണ് ഓരോ രീതിയും ഉത്തരം നൽകിയത്: ESR റാഡിക്കലിന്റെ തിരിച്ചറിയൽ നൽകി; ഏതെങ്കിലും ഫ്ലൂറസന്റ് പ്രോബിനെ ആശ്രയിക്കാതെ ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം പ്രതികരണ ഫ്ലക്സ് നൽകി; ഒരേ പ്രകാശിത സംവിധാനത്തിൽ സിംഗ്ലെറ്റ് ഓക്സിജൻ പാതകളും റാഡിക്കൽ പാതകളും പ്രവർത്തിക്കുന്നതായി ഇവയുടെ സംയോജനം കാണിച്ചു.

1984-ലെ ആ ഫലം ഇന്നും ഒരു മുന്നറിയിപ്പായി വായിക്കാം. പ്രകാശവും ഒരു നിരോക്സീകാരിയും ഉണ്ടായിരുന്നപ്പോൾ ഡൈ പെറോക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ചു. ഇരുമ്പ് ഉണ്ടായിരുന്നപ്പോൾ ആ സംവിധാനത്തിൽ, ആ കൂട്ടത്തിലെ ഏറ്റവും പ്രതിക്രിയാശീലമായ സ്പീഷീസായ ഹൈഡ്രോക്സിൽ റാഡിക്കൽ രൂപപ്പെട്ടു. ഗവേഷകർ ഇതിനെ കണ്ണിലെ അസ്കോർബേറ്റുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും കണ്ണിൽ വിവേചനമില്ലാതെ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനെ ചോദ്യം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഇന്നത്തെ വായനക്കാർ സാഹചര്യങ്ങൾ ശ്രദ്ധിക്കണം: പ്രകാശം കൂടാതെ നിരോക്സീകാരി കൂടാതെ ഇരുമ്പ്. ഇവയിൽ ഏതെങ്കിലും ഒന്ന് നീക്കിയാൽ ആ പാത ദുർബലമാകുകയോ ഇല്ലാതാകുകയോ ചെയ്യും.

ഓക്സിജൻ ഇലക്ട്രോഡുകളുടെ പ്രാധാന്യം മറ്റൊരു തരത്തിലാണ്. ക്ലാർക്ക്-തരത്തിലുള്ള ഒരു ഇലക്ട്രോഡ് മൊത്തം ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം അളക്കുന്നു. ഡൈ നയിക്കുന്ന റെഡോക്സ് രാസപ്രക്രിയ തന്മാത്രാതല ഓക്സിജൻ ഉപയോഗിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ഇത് സ്ഥാപിക്കുകയും, ഒരു ഫ്ലൂറസൻസ് ആർട്ടിഫാക്റ്റിനും വ്യാജമായി സൃഷ്ടിക്കാനാകാത്ത പ്രതികരണഗതിവിവരങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു. ഇത് ഉൽപ്പന്നത്തെ തിരിച്ചറിയുന്നില്ല. പെറോക്സൈഡ്, സൂപ്പർഓക്സൈഡ്, ജലം എന്നിവയുടെ രൂപീകരണത്തിലും സിംഗ്ലെറ്റ് ഓക്സിജന്റെ ക്ഷയത്തിലുമെല്ലാം ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം സംഭവിക്കുന്നു. തിരിച്ചറിയലില്ലാത്ത ഫ്ലക്സ്, ഫ്ലക്സില്ലാത്ത തിരിച്ചറിയൽ പോലെതന്നെ അപൂർണമാണ്. അതുകൊണ്ടാണ് ശക്തമായ പഠനങ്ങൾ ഇലക്ട്രോഡിനൊപ്പം കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത പെറോക്സൈഡ് അസേയോ ഒരു ട്രാപ്പോ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.

ആന്റിഓക്സിഡന്റ് ഫലങ്ങൾ പരസ്പരവിരുദ്ധമാകുന്നത് എന്തുകൊണ്ട്

ഈ മൂന്ന് അളവുഫലങ്ങളും ഒപ്പമൊപ്പമാക്കി നോക്കുമ്പോൾ, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഗവേഷണസാഹിത്യത്തിലെ പ്രത്യക്ഷ വൈരുധ്യങ്ങൾ രീതികളിലെ വ്യത്യാസങ്ങളും മൂന്ന് ജൈവ വസ്തുതകളും ചേർന്നതാണെന്ന് വ്യക്തമാകും.

ഒന്നാമതായി, ഡൈ ഒരു ഇലക്ട്രോൺ വാഹകവും പെറോക്സൈഡ് ഉറവിടവുമാണ്. ഓക്സിജൻ സൂപ്പർഓക്സൈഡായി മാറുമായിരുന്ന ശ്വസനപ്രക്രിയയിലെ സ്ഥാനങ്ങളിൽനിന്ന് ഇലക്ട്രോണുകളെ വഴിതിരിച്ചുവിട്ട് ഒരു ROS കുറയ്ക്കാൻ അതിന് കഴിയും. അതേസമയം അതിന്റെ നിരോക്സീകരിച്ച രൂപം ഓക്സിജനെ നേരിട്ട് പെറോക്സൈഡാക്കി നിരോക്സീകരിച്ച് മറ്റൊരു ROS വർധിപ്പിക്കുന്നു. അതിനാൽ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയിലെ റെഡോക്സ് രാസപ്രക്രിയയും അതിൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ ബൈപാസ് പങ്കും പരിശോധിക്കുന്ന ഒരു ലബോറട്ടറി, പ്രോബിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഉത്തരങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കണം: ഒരേ ക്യൂവെറ്റിൽ സൂപ്പർഓക്സൈഡിനോട് സംവേദനക്ഷമമായ അളവുഫലം കുറയുമ്പോൾ പെറോക്സൈഡ് അളവുഫലം ഉയരുന്നു.

രണ്ടാമതായി, കുറഞ്ഞ ഡോസുകളിൽ പെറോക്സൈഡ് കേവലം കേടുപാടല്ല, ഒരു സിഗ്നലാണ്. മുൻകാല പഠനത്തെ പിന്തുടർന്ന എലിയുടെ മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോണ്ട്രിയ പഠനത്തിൽ, അമ്പത് നാനോമോളാർ എന്ന കുറഞ്ഞ ഡൈ സാന്ദ്രതയിൽനിന്നുപോലും പെറോക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദനം ഉണ്ടാകുന്നതായും ചികിത്സാതലങ്ങളിൽ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ DNA-യിൽ ക്ഷതങ്ങൾ ഇല്ലാത്തതായും കണ്ടെത്തി. മുൻകൂർ ചികിത്സ നൽകിയശേഷം റോട്ടെനോൺ മൂലമുള്ള ക്ഷതങ്ങൾക്കെതിരായ സംരക്ഷണവും കണ്ടെത്തി. ചികിത്സാ പരിധിയേക്കാൾ വളരെ ഉയർന്ന നൂറ് മൈക്രോമോളാറിൽ മാത്രമാണ് ഡൈ തിരഞ്ഞെടുത്ത DNA ഖണ്ഡങ്ങൾക്ക് കേടുവരുത്തിയത്. ചുവപ്പ് പ്രകാശവും ഇരുപത് മൈക്രോമോളാർ ഡൈയും ചേർന്നപ്പോൾ ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ച സിംഗ്ലെറ്റ് ഓക്സിജൻ പരീക്ഷിച്ച എല്ലാ ഖണ്ഡങ്ങൾക്കും കേടുവരുത്തി. നിർദേശിക്കപ്പെട്ട പ്രവർത്തനരീതി ഹോർമറ്റിക്കാണ്: മിതമായ പെറോക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദനം Nrf2-യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ആന്റിഓക്സിഡന്റ് പ്രതിരോധങ്ങളും മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ബയോജനസിസും ഉണർത്തുന്നു. അതിനാൽ ഹ്രസ്വകാല പ്രോഓക്സിഡന്റ് അളവുഫലം ദീർഘകാല ആന്റിഓക്സിഡന്റ് ഫലത്തിന് മുമ്പായി പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു. ഒരു മണിക്കൂറിൽ വായിക്കുന്ന അസേയും ഒരു ദിവസത്തിൽ വായിക്കുന്ന അസേയും തമ്മിൽ പൊരുത്തപ്പെടാതിരിക്കാം; ഇടയ്ക്കുള്ള സമയത്ത് ജൈവപ്രക്രിയ മാറിയതാണ് കാരണം.

മൂന്നാമതായി, ഏത് തന്മാത്രയാണ് ഉള്ളതെന്നുപോലും പ്രകാശം നിർണയിക്കുന്നു. പ്രകാശം ഡൈയെ ഡീമെത്തിലേറ്റ് ചെയ്ത് Azure B-യിലേക്കും അനുബന്ധ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിലേക്കും മാറ്റുന്നു. ഒരു ഡിഷിനു മുകളിലുള്ള മൈക്രോസ്കോപ്പ് വിളക്കുതന്നെ അതിനെ ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസ് ചെയ്യാൻ മതിയാകും. ഇരുട്ടിലെയും പ്രകാശത്തിലെയും പരീക്ഷണങ്ങൾ വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണങ്ങളാണ്. ഏതൊരു പ്രോട്ടോക്കോളിലെയും പ്രകാശത്തിനും ഡൈ കൈകാര്യം ചെയ്യലിനുമുള്ള കൺട്രോളുകൾ എന്ന വിഭാഗം അവയെ അങ്ങനെതന്നെ പരിഗണിക്കണം.

ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ കൺട്രോൾ സെറ്റും ഏതൊരു അവകാശവാദവും എങ്ങനെ വായിക്കണമെന്നതും

താഴെയുള്ള താരതമ്യം ഈ ലേഖനത്തിനായി തയ്യാറാക്കിയ മൂല റഫറൻസ് സാമഗ്രിയാണ്. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ROS സംബന്ധിച്ച ഏതൊരു ഫലവും അംഗീകരിക്കുന്നതിനുമുമ്പ്, ഗവേഷകർ ഏത് വരിയിലെ പരിശോധന നടത്തി, ഏത് ഒഴിവാക്കി എന്ന് പരിശോധിക്കുക.

ഇതിൽനിന്ന് ഒരു പ്രായോഗിക വായനാനിയമം ലഭിക്കുന്നു. പെറോക്സിഡേസിനൊപ്പം ഉപയോഗിക്കുന്ന, കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത, കാറ്റലേസ് പരിശോധനയുള്ള Amplex പെറോക്സൈഡിനെക്കുറിച്ചുള്ള തെളിവാണ്. DCFDA നിർദ്ദിഷ്ടതയില്ലാത്ത പ്രോബ് ഓക്സീകരണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള തെളിവാണ്; അതിൽ കൂടുതലൊന്നുമല്ല. സ്കാവഞ്ചർ കൺട്രോളുകളോടെയുള്ള സ്പിൻ ട്രാപ്പിങ് റാഡിക്കലിന്റെ തിരിച്ചറിയലിനെക്കുറിച്ചുള്ള തെളിവാണ്. ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം ഫ്ലക്സിനെക്കുറിച്ചുള്ള തെളിവാണ്. ഒരു അസേയ്ക്ക് പിന്തുണയ്ക്കാനാകുന്നതിലും അധികം അവകാശപ്പെടുന്ന വാക്യം, എത്ര ആത്മവിശ്വാസത്തോടെ എഴുതിയാലും, ഡൈയെക്കുറിച്ചല്ല, പ്രോബിനെക്കുറിച്ചുള്ള വാക്യമാണ്. ഡോസിനെ ആശ്രയിക്കുന്ന സ്വഭാവവും ഹോർമറ്റിക് പരിധിയും, മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയിലെ ഇലക്ട്രോൺ പ്രവാഹം, സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത സാമ്പിളുകളിലെ അസേ ഇടപെടൽ, മൈക്രോസ്കോപ്പിയിലെ പ്രകാശം മൂലമുള്ള ആർട്ടിഫാക്റ്റുകൾ എന്നിവയെക്കുറിച്ചുള്ള അനുബന്ധ ചർച്ചകൾ ഈ ഓരോ കാര്യവും കൂടുതൽ വിശദീകരിക്കുന്നു. അവയുടെ താൽക്കാലിക റഫറൻസുകൾക്ക് പകരം യഥാർത്ഥ റഫറൻസുകൾ നൽകിയ ശേഷവും ഓരോ കാര്യവും സാധുവായി തുടരും.