മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും നൈട്രിക് ഓക്സൈഡും: NOS, cGMP, രക്തക്കുഴലുകളിലെ സിഗ്നലിങ്

ചോദ്യം ലളിതമായി തോന്നാം: മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡിനെ തടയുമോ? ലബോറട്ടറിയിൽ ഇത് നാല് വ്യത്യസ്ത ചോദ്യങ്ങളായി വേർപിരിയുന്നു; ഓരോന്നിനും വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണ പരിശോധനയുമുണ്ട്. ഇവ തമ്മിൽ കലർത്തുന്നതാണ് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെയും നൈട്രിക് ഓക്സൈഡിനെയും കുറിച്ചുള്ള എഴുത്തുകൾ ഉറച്ചതെങ്കിലും അവ്യക്തമായതെന്നു തോന്നാനുള്ള പ്രധാന കാരണം.

നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിഗ്നലിനെ നാല് കണ്ണികളുള്ള ഒരു ശൃംഖലയായി കരുതുക. നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിന്തേസ് ഉണ്ടാക്കാൻ ഒരു ജീൻ ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു. ഈ എൻസൈം അർജിനിനെ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡാക്കി മാറ്റുന്നു. മറ്റെന്തെങ്കിലുമായി പ്രതികരിക്കുന്നതിനുമുമ്പ് ഈ വാതകം ലക്ഷ്യത്തിലേക്ക് വ്യാപിക്കുന്നു. ലയിക്കുന്ന ഗ്വാനിലേറ്റ് സൈക്ലേസ് അതിനെ തിരിച്ചറിഞ്ഞ് സൈക്ലിക് GMP ഉണ്ടാക്കുന്നു. ഓരോ കണ്ണിയിലും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ സ്വാധീനങ്ങൾ പ്രസിദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. എന്നാൽ തെളിവുകൾ വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണ സജ്ജീകരണങ്ങളിൽനിന്നും വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളിൽനിന്നും വ്യത്യസ്ത ഐസോഫോമുകളിൽനിന്നുമാണ് വരുന്നത്. ഒരു കണ്ണിയിലെ ഫലം മറ്റൊന്നിലെ പ്രവർത്തനത്തിന് തെളിവല്ല.

സാധാരണ ശൃംഖല, ലളിതമായി

രക്തക്കുഴലിന്റെ ഭിത്തിയിൽ സാധാരണ ക്രമം ഇങ്ങനെയാണ്. ഒരു ഉത്തേജനം എൻഡോതീലിയൽ കോശത്തിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു. eNOS അഥവാ NOS3 എന്നറിയപ്പെടുന്ന എൻഡോതീലിയൽ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിന്തേസ് ചെറിയൊരു നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സ്പന്ദനം സൃഷ്ടിക്കുന്നു. ഈ വാതകം സമീപത്തെ മിനുസപേശി കോശത്തിലേക്ക് വ്യാപിച്ച്, ലയിക്കുന്ന ഗ്വാനിലേറ്റ് സൈക്ലേസിലെ നിരോക്സീകരിക്കപ്പെട്ട ഇരുമ്പ് അടങ്ങിയ ഹീമുമായി ബന്ധപ്പെടുന്നു; തുടർന്ന് GTP സൈക്ലിക് GMP ആയി മാറുന്നത് വേഗത്തിലാക്കുന്നു. സൈക്ലിക് GMP പ്രോട്ടീൻ കൈനേസ് G സജീവമാക്കുന്നു, കാൽസ്യം കൈകാര്യം ചെയ്യുന്ന രീതി മാറുന്നു, പേശി അയയുന്നു.

വേർതിരിച്ചുതന്നെ പരിഗണിക്കേണ്ട രണ്ടാമതൊരു ശൃംഖലയുമുണ്ട്. അണുബാധയോ സൈറ്റോകൈനുകളുമായുള്ള സമ്പർക്കമോ ഉണ്ടാകുമ്പോൾ, കോശങ്ങൾ മറ്റൊരു എൻസൈമിനായുള്ള ജീൻ ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യുന്നു: ഇൻഡ്യൂസിബിൾ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിന്തേസ് അഥവാ iNOS, NOS2 എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു. eNOS-നെക്കാൾ കൂടുതലും കൂടുതൽ നേരം നിലനിൽക്കുന്നതുമായ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് പ്രവാഹങ്ങളാണ് ഇത് സൃഷ്ടിക്കുന്നത്. മൂന്നാമത്തെ ഐസോഫോമായ ന്യൂറോണൽ NOS അഥവാ nNOS മറ്റൊരു പശ്ചാത്തലത്തിലാണ് വരുന്നത്. ഒരു പ്രബന്ധത്തിൽ ഐസോഫോം വ്യക്തമാക്കാതെ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിന്തേസ് എന്നു പറഞ്ഞാൽ, ഏതാണ് അളന്നതെന്ന് ആദ്യം പരിശോധിക്കുക. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഇലക്ട്രോണുകൾ കൈമാറുന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള അവലോകനവും റെഡോക്സ് ലക്ഷ്യങ്ങളെ സംബന്ധിച്ച് പൊതുവായി ഇതേ കാര്യം പറയുന്നു: കൈമാറ്റ സംവിധാനം തനിയെ ഒന്നും ചെയ്യുന്നില്ല; ഓരോ അറ്റത്തുമുള്ള പങ്കാളിയാണ് ഫലം നിർണയിക്കുന്നത്.

അളക്കുന്ന സൈക്ലിക് GMP ഒരു സംയോജിത സൂചകവുമാണ്; നേരിട്ടുള്ള എൻസൈം പരിശോധനയല്ല. അതിന്റെ നില, സൈക്ലേസ് വഴിയുള്ള ഉൽപ്പാദനത്തിൽനിന്ന് ഫോസ്ഫോഡൈഎസ്റ്ററേസുകൾ വഴിയുള്ള വിഘടനം കുറച്ചുള്ള ഫലമാണ്; രക്തക്കുഴലുകളിലെ മിനുസപേശിയിൽ പ്രത്യേകിച്ച് PDE5 വഴിയുള്ള വിഘടനം. അതിനാൽ സൈക്ലിക് GMP കുറയുന്നു എന്നത് സിഗ്നൽ തിരിച്ചറിയുന്ന ഘടകത്തിൽ കുറച്ച് സിഗ്നൽ മാത്രമേ എത്തിയുള്ളൂ എന്നാണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. ഏത് കണ്ണിയാണ് പരാജയപ്പെട്ടതെന്ന് അതുമാത്രം വ്യക്തമാക്കുന്നില്ല.

കണ്ണി 1: iNOS എൻസൈം കുറച്ച് മാത്രം ഉണ്ടാകുന്നു

ബാക്ടീരിയൽ ലിപ്പോപോളിസാക്കറൈഡ്, ഇന്റർഫെറോൺ ഗാമ, അല്ലെങ്കിൽ ഇവ രണ്ടും ഉപയോഗിച്ച് ഉത്തേജിപ്പിച്ച എലികളുടെ മാക്രോഫേജുകളിൽ, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ iNOS പ്രോട്ടീനിൽ പ്രതീക്ഷിച്ച വർധന തടയുകയും iNOS മെസഞ്ചർ RNA ശക്തമായി കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്തതായി മാക്രോഫേജ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ കണ്ടെത്തി. എന്തൊക്കെയാണ് മാറാതിരുന്നത് എന്നതാണ് ഇവിടെ പ്രധാന വിവരം. ഇൻഹിബിറ്ററായ I കപ്പ B ആൽഫയുടെ വിഘടനം, NF കപ്പ B-യുടെയും STAT1-ന്റെയും ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ, ഈ ഘടകങ്ങൾ ന്യൂക്ലിയസിലേക്കു നീങ്ങുന്നത് എന്നിവ വലിയ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു. കുറഞ്ഞത് അവ DNA-യുമായി ബന്ധപ്പെടുന്നതാണ്. iNOS പ്രൊമോട്ടറിൽ അവയുടെ സാന്നിധ്യം കുറഞ്ഞതായി കാണിച്ച ക്രോമാറ്റിൻ ഇമ്യൂണോപ്രെസിപ്പിറ്റേഷൻ ഇത് സ്ഥിരീകരിച്ചു.

ഇത് എൻസൈമിന്റെ അളവ് നിർണയിക്കുന്ന ഘട്ടത്തിനു മുമ്പുള്ള ജീൻ നിയന്ത്രണ സ്വാധീനമാണ്; നിലവിലുള്ള എൻസൈമിനെ ഉടനടി തടയുന്നതല്ല. പ്രോട്ടീൻ രൂപപ്പെടുന്നതിനുമുമ്പ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ ഒരു പ്രൊമോട്ടറുമായി ബന്ധപ്പെടേണ്ടിവരുന്ന ഇൻഫ്ലമേറ്ററി സിഗ്നലിങ്ങിലാണ് ഇത് ഉൾപ്പെടുന്നത്. വിശ്രമാവസ്ഥയിലുള്ള രക്തക്കുഴലിൽ സ്ഥിരമായി പ്രവർത്തിക്കുന്ന eNOS-നെക്കുറിച്ച് ഇത് നേരിട്ട് ഒന്നും പറയുന്നില്ല; അതിനാൽ അങ്ങനെ തന്നെയാണ് ഇതിനെ വിവരിക്കേണ്ടത്.

കണ്ണി 2: നിലവിലുള്ള NOS എൻസൈം മന്ദഗതിയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു

എലികളിൽ നടത്തിയ ഒരു പഠനം മറ്റൊരു തലമാണ് പരിശോധിച്ചത്. ബോധാവസ്ഥയിലുള്ള ആൺ എലികൾക്ക് ലിപ്പോപോളിസാക്കറൈഡ് ശിരയിലൂടെ നൽകി. മൂന്ന് മണിക്കൂറിനു ശേഷം സലൈൻ അല്ലെങ്കിൽ 3 mg per kg മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ശിരയിലൂടെ നൽകി. തുടർന്ന് മീഡിയൽ ബേസൽ ഹൈപ്പോതലാമസിലെ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിന്തേസ് പ്രവർത്തനം, അടയാളപ്പെടുത്തിയ അർജിനിൻ സിട്രുലിനായി മാറുന്നത് അളന്ന് വിലയിരുത്തി; ഇതാണ് ഹൈപ്പോതലാമസിലെ NOS പ്രവർത്തന പഠനം. സമ്മർദവും സലൈനും മാത്രം ചേർന്നപ്പോൾ കാൽസ്യത്തെ ആശ്രയിക്കാത്ത കുറച്ച് പ്രവർത്തനം പ്രേരിപ്പിക്കപ്പെട്ടു; ലിപ്പോപോളിസാക്കറൈഡ് അതിനെ നിയന്ത്രണ നിലയുടെ ഏകദേശം പത്തിരട്ടിയാക്കി. പ്രേരിപ്പിക്കപ്പെട്ട ഈ രണ്ട് ഘടകങ്ങളും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഇല്ലാതാക്കി. ആ ടിഷ്യുവിൽ, ആ ഡോസിലും ആ സമയബിന്ദുവിലും, കാൽസ്യത്തെ ആശ്രയിക്കുന്ന സ്ഥിരമായ പ്രവർത്തനത്തിൽ മാറ്റമുണ്ടായില്ല.

ആ ഫലത്തെ പറഞ്ഞിരിക്കുന്നതുപോലെതന്നെ വായിക്കുക: ആ സാഹചര്യങ്ങളിൽ അളന്ന iNOS തരത്തിലുള്ള പ്രവർത്തനം കുറഞ്ഞു. ഇത് ജീൻ പ്രകടനത്തിന്റെ അളവല്ല; eNOS-നെയോ nNOS-നെയോ അപേക്ഷിച്ച് iNOS-നെ മാത്രമേ എല്ലായ്പ്പോഴും ബാധിക്കൂ എന്നതിനുള്ള തെളിവുമല്ല. ശുദ്ധീകരിച്ച എൻസൈമുകളിലെ പഠനങ്ങൾ ഈ ജാഗ്രത കൂടുതൽ ശക്തമാക്കുന്നു. ശുദ്ധീകരിച്ച നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിന്തേസിന്റെ നേരിട്ടുള്ള പരിശോധനകളിൽ, 30 micromolar മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സിട്രുലിൻ രൂപീകരണം പൂർണമായി തടഞ്ഞു. സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മ്യൂട്ടേസ് ഇല്ലാത്തപ്പോൾ പകുതി തടയലിനുള്ള സാന്ദ്രത ഏകദേശം 5.3 micromolar ആയിരുന്നു; അതുള്ളപ്പോൾ 9.2 micromolar ആയിരുന്നു. ഇത് ശുദ്ധീകരിച്ച NOS-ഉം ഗ്വാനിലേറ്റ് സൈക്ലേസും തമ്മിലുള്ള താരതമ്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. ശുദ്ധീകരിച്ച nNOS-ൽ നടത്തിയ മറ്റൊരു പഠനം എൻസൈമുമായി ബന്ധിച്ചിരിക്കുന്ന ഹീമിന്റെ ഓക്സീകരണത്തിന് പങ്കുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിച്ചു. ഒറ്റപ്പെടുത്തിയ സംവിധാനങ്ങളിൽ NOS-നെ നേരിട്ട് തടയുന്നത് യഥാർഥമാണെന്നതാണ് പ്രായോഗികമായി മനസ്സിലാക്കേണ്ടത്. എന്നാൽ ഹൈപ്പോതലാമസിലെ ഫലത്തെ, എല്ലായിടത്തുമുള്ള സ്ഥിരമായി പ്രവർത്തിക്കുന്ന എല്ലാ NOS-കളെയും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ബാധിക്കാതെ വിടുന്നു എന്ന പൊതുവാദമായി വിപുലീകരിക്കാനാവില്ല.

കണ്ണി 3: എത്തുന്നതിനുമുമ്പ് നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് നഷ്ടപ്പെടുന്നു

എൻസൈം തടയൽ അല്ലാത്ത മറ്റൊന്നും സൈക്ലിക് GMP കുറയുന്നതിനെ വിശദീകരിക്കാമെന്നതിന്റെ ഏറ്റവും വ്യക്തമായ തെളിവ് ലഭിച്ചത് കൾച്ചറിൽ വളർത്തിയ മുയലിന്റെ ശ്വാസകോശ ധമനിയിലെ മിനുസപേശി കോശങ്ങളിൽനിന്നാണ്. പരീക്ഷണത്തിൽ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് ദാതാക്കളെ നേരിട്ട് ചേർത്ത്, കോശത്തിനുള്ളിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന NOS-നെ പൂർണമായി മറികടന്നു. എന്നിട്ടും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സൈക്ലിക് GMP പ്രതികരണം കുറയ്ക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് രക്തക്കുഴൽ മിനുസപേശിയിലെ സൂപ്പർഓക്സൈഡ് പഠനത്തിൽ പരിശോധിച്ചു.

1 മുതൽ 100 micromolar വരെ മൂന്ന് ദാതാക്കളെ പരീക്ഷിച്ചു: S നൈട്രോസോ L സിസ്റ്റീൻ, സോഡിയം നൈട്രോപ്രുസൈഡ്, MPANO എന്ന സ്ഥിരതയുള്ള ഡീഅമിനേറ്റഡ് അനലോഗ്. എല്ലാം സൈക്ലിക് GMP ഏകദേശം 1.5 മടങ്ങിനും 12 മടങ്ങിനും ഇടയിൽ വർധിപ്പിച്ചു. 10 micromolar മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ആദ്യത്തെ രണ്ടിന്റെയും പ്രതികരണം 51 മുതൽ 100 ശതമാനം വരെ തടഞ്ഞു; MPANO പ്രതികരണത്തിൽ മാറ്റമുണ്ടാക്കിയില്ല. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സൈക്ലേസിന്റെ കാറ്റലിറ്റിക് സ്ഥാനം മാത്രം തടയുകയായിരുന്നെങ്കിൽ, ദാതാക്കളോടുള്ള ഈ തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെട്ട പ്രതികരണം വിശദീകരിക്കാൻ ബുദ്ധിമുട്ടാകുമായിരുന്നു. കാരണം മൂന്നും ഒടുവിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നത് ഒരേ എൻസൈമിലൂടെയാണ്.

തുടർന്ന് മൂന്ന് നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണങ്ങൾ ഈ പ്രവർത്തനരീതിക്ക് സൂപ്പർഓക്സൈഡുമായുള്ള ബന്ധം ഉറപ്പിച്ചു. ഒന്നാമതായി, സാന്തിനും സാന്തിൻ ഓക്സിഡേസും ഉപയോഗിച്ച് കോശത്തിന് പുറത്ത് സൂപ്പർഓക്സൈഡ് സൃഷ്ടിച്ചപ്പോൾ ഇതേ മാതൃക ആവർത്തിച്ചു: CYSNO-യുടെയും നൈട്രോപ്രുസൈഡിന്റെയും പ്രതികരണങ്ങൾ തടയപ്പെട്ടു; MPANO-യുടെ പ്രതികരണം ബാധിക്കപ്പെട്ടില്ല. രണ്ടാമതായി, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ മിനുസപേശി കോശങ്ങളിൽനിന്നുള്ള സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദനം ഡോസിനെയും സമയത്തെയും ആശ്രയിച്ച് വർധിപ്പിച്ചു; ഇത് സൈറ്റോക്രോം c-യുടെ നിരോക്സീകരണത്തിലൂടെ അളന്നു. മൂന്നാമതായി, സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മ്യൂട്ടേസ് ഈ തടയൽ പൂർണമായി ഒഴിവാക്കി, എന്നാൽ കാറ്റലേസ് അങ്ങനെ ചെയ്തില്ല. ആ പരീക്ഷണ സജ്ജീകരണത്തിൽ ഉടനടി കാരണമാകുന്ന രാസഘടകം ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡല്ല, സൂപ്പർഓക്സൈഡാണെന്നാണ് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്.

ഈ പരീക്ഷണത്തിന്റെ സഹ-കൾച്ചർ രൂപവും വിവരിക്കേണ്ടതാണ്; കാരണം അത് സ്വാധീനം എവിടെയാണ് സംഭവിക്കുന്നതെന്ന് വ്യക്തമാക്കുന്നു. കവർസ്ലിപ്പുകളിലെ എൻഡോതീലിയൽ കോശങ്ങളെ മിനുസപേശി കോശങ്ങളോടൊപ്പം കുറച്ചുനേരം കൾച്ചർ ചെയ്തു. ഇതിലൂടെ അടിസ്ഥാന നിലയിൽ പുറത്തുവിടുന്ന എൻഡോതീലിയൽ ഘടകം മിനുസപേശിയിലെ സൈക്ലിക് GMP മൂന്ന് മുതൽ എട്ട് മടങ്ങുവരെ വർധിപ്പിച്ചു. ഏതെങ്കിലും ഒരു കോശവിഭാഗത്തിൽ മുൻകൂട്ടി മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ പ്രയോഗിച്ചപ്പോൾ ആ സിഗ്നൽ കുറഞ്ഞു. എൻഡോതീലിയൽ കോശങ്ങളിൽ മുൻകൂട്ടി പ്രയോഗിച്ചതിന്റെ സ്വാധീനം സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മ്യൂട്ടേസ് ഭാഗികമായി തിരിച്ചെടുത്തു. മറ്റൊരു വിധത്തിൽ പറഞ്ഞാൽ, സിഗ്നൽ തിരിച്ചറിയുന്ന മിനുസപേശി കോശത്തിനുള്ളിൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ പ്രവർത്തിക്കണമെന്നില്ല. വഴിമധ്യേ സന്ദേശവാഹകത്തെ നീക്കം ചെയ്തും അതിന് സിഗ്നൽ കുറയ്ക്കാനാകും. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഗവേഷണം വായിക്കുന്നതിനുള്ള മാർഗദർശിക ഇതിനെ ഒരു പൊതുനിയമമായി കാണുന്നു: ഒരു തന്മാത്രാ ലക്ഷ്യം പറയുന്നതിനുമുമ്പ് ഇടപെടൽ നടന്ന കോശവിഭാഗമോ ഇടമോ വ്യക്തമാക്കുക.

ഇതിനെ NOS തടയൽ എന്നു വിളിക്കുന്നത് തെറ്റായിരിക്കും. ദാതാക്കൾ പ്രവർത്തിക്കാൻ സിന്തേസ് ഘട്ടം ആവശ്യമില്ലായിരുന്നു; എന്നിട്ടും സിഗ്നൽ കുറഞ്ഞു.

കണ്ണി 4: സിഗ്നൽ തിരിച്ചറിയുന്ന ഘടകം തന്നെ കുറച്ച് പ്രതികരിക്കുന്നു

ലയിക്കുന്ന ഗ്വാനിലേറ്റ് സൈക്ലേസിൽ നേരിട്ടുള്ള സ്വാധീനങ്ങൾ ഉണ്ടെങ്കിലും, സാന്ദ്രതകൾ പ്രധാനമാണ്. മുകളിൽ പരാമർശിച്ച ശുദ്ധീകരിച്ച എൻസൈം താരതമ്യത്തിൽ, നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് ഉത്തേജിപ്പിച്ച സൈക്ലേസിനെ പകുതിയായി തടയാൻ ഏകദേശം 60 micromolar മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ആവശ്യമായി വന്നു. അതേസമയം NOS-നെ പകുതിയായി തടയാനുള്ള സാന്ദ്രത ഏകദേശം 5 മുതൽ 9 micromolar വരെയായിരുന്നു. 1 millimolar പോലും പരമാവധി തടയലിന്റെ ഒരു ഭാഗം മാത്രമേ ഉണ്ടാക്കിയുള്ളൂ. ഇത് ഏകദേശം ആറ് മുതൽ പതിനൊന്ന് മടങ്ങുവരെയുള്ള വ്യത്യാസമാണ്. അതിനാൽ കുറഞ്ഞ micromolar സാന്ദ്രതയിലുള്ള ഒരു കോശപരീക്ഷണത്തിൽ സൈക്ലിക് GMP കുറയുന്നു എന്നതുകൊണ്ടുമാത്രം അതിനെ തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെട്ട സൈക്ലേസ് തടയൽ എന്നു വിശേഷിപ്പിക്കാനാവില്ല.

പിന്നീട് നടത്തിയ ഒരു റെഡോക്സ് പഠനം മറ്റൊരു ജാഗ്രതയും മുന്നോട്ടുവച്ചു: ഹീമിലെ ഇരുമ്പ് വായുവിലൂടെ ലളിതമായി ഓക്സീകരിക്കപ്പെടുന്നതിൽനിന്ന് വ്യത്യസ്തമായ ഒരു പ്രവർത്തനരീതിയിലൂടെയാണ് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ, നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സജീവമാക്കിയ സൈക്ലേസിനെ നിർജ്ജീവമാക്കിയത്. അതിനാൽ സിഗ്നൽ തിരിച്ചറിയുന്ന ഘടകത്തിന്റെ പ്രവർത്തനം തകരാറിലാകാം; എന്നാൽ അതിന്റെ രസതന്ത്രം ഇനിയും തീർച്ചപ്പെട്ടിട്ടില്ല. സാന്ദ്രതകളിലെ വ്യത്യാസം കാരണം, കുറഞ്ഞ micromolar സമ്പർക്കനിലകളിൽ സൂപ്പർഓക്സൈഡിന്റെയും NOS-ന്റെയും സ്വാധീനങ്ങൾ ആദ്യം ഒഴിവാക്കേണ്ടതുണ്ട്. ഫോസ്ഫോഡൈഎസ്റ്ററേസ് നിയന്ത്രണവും ഇവിടെ പ്രസക്തമാണ്. വിഘടനം അളക്കുകയോ തടയുകയോ ചെയ്തിട്ടില്ലെങ്കിൽ, സൈക്ലിക് GMP അടിഞ്ഞുകൂടുന്നത് കുറയുന്നത് ഉൽപ്പാദനം കുറഞ്ഞതുകൊണ്ടോ വിഘടനം വേഗത്തിലായതുകൊണ്ടോ രണ്ടും കൊണ്ടോ ആകാം.

ഇതിനെ രക്തസമ്മർദത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരൊറ്റ വാദമായി ചുരുക്കാനാവാത്തത് എന്തുകൊണ്ട്

ഓരോ കണ്ണിയും വ്യത്യസ്തമായൊരു സംവിധാനത്തിലാണ് സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടത്. മാക്രോഫേജുകളിലെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഹൈപ്പോതലാമസിലെ എൻസൈം പ്രവർത്തനമല്ല. ലിപ്പോപോളിസാക്കറൈഡിനു ശേഷമുള്ള ഹൈപ്പോതലാമസ് പ്രവർത്തനം വിശ്രമാവസ്ഥയിലെ എൻഡോതീലിയൽ ടോണല്ല. സഹ-കൾച്ചറിൽ അടിസ്ഥാന നിലയിൽ പുറത്തുവിടുന്ന എൻഡോതീലിയൽ ഘടകം അഗോണിസ്റ്റ് ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്ന രക്തക്കുഴൽ വികാസമല്ല. 10 micromolar മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിലുള്ള കൾച്ചർ ചെയ്ത ശ്വാസകോശ ധമനി കോശങ്ങൾ മനുഷ്യന്റെ രക്തചംക്രമണവുമല്ല. ഇവയെല്ലാം ചേർത്ത്, നൈട്രിക് ഓക്സൈഡിനെ തടഞ്ഞുകൊണ്ട് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ രക്തസമ്മർദം ഉയർത്തുന്നു എന്നൊരു പ്രസ്താവനയാക്കി ചുരുക്കുന്നത്, നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണങ്ങൾ സംരക്ഷിക്കാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത വ്യത്യാസങ്ങളെത്തന്നെ ഉപേക്ഷിക്കുന്നതാണ്.

മൂന്ന് പരിശോധനകൾ വിശദീകരണത്തിന്റെ കൃത്യത നിലനിർത്തുന്നു. ഒന്നാമതായി, ഐസോഫോം വ്യക്തമാക്കുക: വിശ്രമാവസ്ഥയിലെ രക്തക്കുഴൽ ടോണിന് eNOS, പ്രേരിപ്പിക്കപ്പെട്ട ഇൻഫ്ലമേറ്ററി പ്രവാഹത്തിന് iNOS, ന്യൂറോണൽ പശ്ചാത്തലങ്ങളിലും ചില ശുദ്ധീകരിച്ച എൻസൈം പരീക്ഷണങ്ങളിലും nNOS. രണ്ടാമതായി, നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സിഗ്നൽ എങ്ങനെ ലഭ്യമാക്കിയെന്ന് വ്യക്തമാക്കുക: കോശത്തിനുള്ളിലെ ഉൽപ്പാദനം, എൻഡോതീലിയത്തിൽനിന്നുള്ള അടിസ്ഥാനനിലയിലെ പുറന്തള്ളൽ, അല്ലെങ്കിൽ CYSNO, നൈട്രോപ്രുസൈഡ്, MPANO പോലുള്ള ഒരു പ്രത്യേക ദാതാവ്. കാരണം സ്ഥിരതയുള്ള ദാതാവ് മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ പ്രതിരോധിച്ചപ്പോൾ അസ്ഥിരമായവ അങ്ങനെ ചെയ്തില്ല. മൂന്നാമതായി, സാന്ദ്രതയും പുനഃസ്ഥാപന പരിശോധനയും വ്യക്തമാക്കുക: സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മ്യൂട്ടേസ് വഴിയുള്ള പുനഃസ്ഥാപനം സൂപ്പർഓക്സൈഡിന്റെ പങ്കിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു; കാറ്റലേസിന്റെ പരാജയം ആ സജ്ജീകരണത്തിൽ ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡിന്റെ പങ്കിനെതിരായ സൂചനയാണ്; സാന്തിൻ ഓക്സിഡേസ് അതേ ഫലം അനുകരിക്കുന്നത് ആ ഫലം ഉണ്ടാക്കാൻ അത് മതിയെന്ന് കാണിക്കുന്നു; ശുദ്ധീകരിച്ച എൻസൈം പരിശോധനകൾ നേരിട്ടുള്ള ഉൽപ്രേരണ സ്വാധീനങ്ങളെ വഴിമധ്യേയുള്ള നഷ്ടങ്ങളിൽനിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നു.

ചുരുക്കത്തിൽ ഇതാണ് നിഗമനം. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനെ തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെട്ട ഒരു സൈക്ലേസ് തടയുന്ന ഘടകമായി കാണുന്നതിനെക്കാൾ, നൈട്രിക് ഓക്സൈഡിൽനിന്ന് സൈക്ലിക് GMP-യിലേക്കുള്ള സിഗ്നലിങ്ങിനെ പല സ്ഥാനങ്ങളിൽ മാറ്റുന്ന ഘടകമായി കാണുന്നതാണ് ഉചിതം. പരീക്ഷണ സജ്ജീകരണവും സാന്ദ്രതയും അനുസരിച്ച്, അതിന് iNOS ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ ബന്ധനം കുറയ്ക്കാനും NOS എൻസൈമുകളെ നേരിട്ട് തടയാനും സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദനത്തിലൂടെ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡിന്റെ ലഭ്യത കുറയ്ക്കാനും നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് സജീവമാക്കിയ സൈക്ലേസിന്റെ പ്രവർത്തനം തകരാറിലാക്കാനും കഴിയും. രക്തക്കുഴൽ പഠനങ്ങളിൽ സൈക്ലിക് GMP സിഗ്നലിങ്ങിന്റെ പങ്ക്, കോശപരിശോധനകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് ദാതാക്കളുടെ താരതമ്യം എന്നിവ ഓരോന്നും ഈ ശാഖകളിലൊന്നിനെ കൂടുതൽ വിശദമായി അവതരിപ്പിക്കുന്നു. റെഡോക്സ് സ്വാധീനങ്ങളെ എൻസൈം സ്വാധീനങ്ങളിൽനിന്ന് വേർതിരിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതികൾ എന്ന ലേഖനം, സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഡിസ്മ്യൂട്ടേസ്, കാറ്റലേസ്, സ്ഥിരതയുള്ള ഒരു ദാതാവിനെ ഉപയോഗിച്ചുള്ള നിയന്ത്രണ പരിശോധന എന്നിവ ഈ ഗവേഷണ സാഹിത്യത്തിൽ പതിവായി ഒരുമിച്ചു വരുന്നത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് വിശദീകരിക്കുന്നു.

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനു ശേഷം സൈക്ലിക് GMP മൂല്യം കുറയുന്നത് ശൃംഖല തകർന്നതായി കാണിക്കുന്നു. ഏത് കണ്ണിയാണ് തകർന്നതെന്ന് പറയുന്നത് നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണങ്ങൾ മാത്രമാണ്.