മീഥിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ പ്രഭാവങ്ങൾ അളക്കൽ: ഓക്സിജൻ, ATP, സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ

ശ്വസനപ്രവർത്തനം തകരാറിലായ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിലേക്ക് ഒരു ലാബ് മീഥിലീൻ ബ്ലൂ ചേർക്കുകയും ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം ഉയരുന്നത് നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് കരുതുക. ഡൈ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ പ്രവർത്തനം പുനഃസ്ഥാപിച്ചു എന്നായിരിക്കും സ്വാഭാവികമായി എഴുതുക. ആ വാക്യം തെറ്റായിരിക്കാം. ഓക്സിജൻ ഫ്ലക്സ്, ATP സംശ്ലേഷണം, സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ എന്നിവ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത ആശയങ്ങളാണ്. ബാക്കപ്പ്, സമന്വയം, പങ്കിടൽ എന്നിവ ഒരേ ക്ലൗഡ് ഫോൾഡറുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതുപോലെ ഇവയും ഒരേ കോശാംഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു: പരസ്പരം ബന്ധമുണ്ടെങ്കിലും വ്യത്യസ്ത നിയമങ്ങളാണ് ഇവയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നത്. ഒന്നിനെ മറ്റൊന്നായി തെറ്റിദ്ധരിച്ചാൽ, ഓരോ അളവും സാങ്കേതികമായി ശരിയായിരിക്കുമ്പോഴും വ്യാഖ്യാനം പാളും.

മീഥിലീൻ ബ്ലൂ ഈ ആശയക്കുഴപ്പത്തിന് വഴിയൊരുക്കുന്നു, കാരണം അത് അളക്കുന്ന സംവിധാനത്തിൽ തന്നെ പങ്കെടുക്കുന്നു. ശൃംഖലയുടെ മുൻഭാഗത്ത് ഇലക്ട്രോണുകൾ സ്വീകരിച്ച് പിന്നീടുള്ള ഭാഗത്ത് അവ നൽകുന്ന ഒരു റെഡോക്സ് സൈക്ലറാണ് അത്; ഊർജിതമായ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിൽ അടിഞ്ഞുകൂടുന്ന ഒരു ലിപോഫിലിക് കാറ്റയോണും സാധാരണ പ്രോബുകളുടെ അതേ തരംഗദൈർഘ്യ ബാൻഡുകളിൽ പ്രകാശം ആഗിരണം ചെയ്യുകയും പുറപ്പെടുവിക്കുകയും ചെയ്യുന്ന കടുംനീല സംയുക്തവുമാണ്. ഒരൊറ്റ അളവിന് ഇത്രയും സങ്കീർണ്ണത കൈകാര്യം ചെയ്യാനാകില്ല. ബുഡാപെസ്റ്റിലെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ പഠനങ്ങളിലുടനീളം കാണുന്ന വിശ്വസനീയമായ സമീപനം, ഓരോ ഘട്ടത്തിലും ഡൈയ്ക്ക് പ്രത്യേകമായ നിയന്ത്രണപരിശോധനകളോടെ ഓക്സിജൻ ഫ്ലക്സ്, ATP സംശ്ലേഷണ നിരക്ക്, സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ, ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് പുറത്തുവിടൽ എന്നിവ ഒരുമിച്ച് അളക്കുക എന്നതാണ്.

റെസ്പിറോമെട്രി അളക്കുന്നത് ഓക്സിജൻ ഫ്ലക്സാണ്, ഊർജോൽപാദനമല്ല

Oroboros Oxygraph ഉപയോഗിച്ചായാലും Seahorse എക്സ്ട്രാസെല്ലുലാർ ഫ്ലക്സ് അനലൈസർ ഉപയോഗിച്ചായാലും, ഉയർന്ന റെസല്യൂഷനുള്ള റെസ്പിറോമെട്രി ഒരു കാര്യം മാത്രമാണ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നത്: ഓക്സിജൻ എത്ര വേഗത്തിൽ നിരോക്സീകരിക്കപ്പെടുന്നു എന്നത്. ഓരോ ഇലക്ട്രോണിനും എത്ര പ്രോട്ടോണുകൾ പമ്പ് ചെയ്യപ്പെട്ടു, എത്ര ഗ്രേഡിയന്റ് സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, അല്ലെങ്കിൽ ATP സിന്തേസ് അത് ഉപയോഗിച്ചോ എന്നൊന്നും അത് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നില്ല.

പദപ്രയോഗം പ്രധാനമാണ്. വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിൽ, ADP ഇല്ലാത്ത സബ്സ്ട്രേറ്റ് ലീക്ക് ശ്വസനവും, സാച്ചുറേറ്റിംഗ് അളവിലുള്ള ADP-യോടുകൂടിയ സബ്സ്ട്രേറ്റ് ഓക്സിഡേറ്റീവ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ശേഷിയും, അൺകപ്ലർ ടൈറ്റ്രേഷൻ പരമാവധി ഇലക്ട്രോൺ കൈമാറ്റ ശേഷിയും നൽകുന്നു. അക്ഷത കോശങ്ങളിലെ അനുബന്ധ Seahorse അളവുകൾ അടിസ്ഥാന ശ്വസനം, ഒലിഗോമൈസിനോട് സംവേദനക്ഷമമായ ATP-ബന്ധിത ശ്വസനം, പ്രോട്ടോൺ ലീക്ക്, FCCP നിർവചിക്കുന്ന പരമാവധി ശ്വസനം, റോട്ടെനോൺ, ആന്റിമൈസിൻ എന്നിവയെ പ്രതിരോധിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺഡ്രിയേതര ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം എന്നിവയാണ്. Agilent Mito Stress Test ചട്ടക്കൂട് വ്യക്തമാക്കുന്നതുപോലെ, Seahorse ഫലങ്ങളെ State 3 എന്നും State 4 എന്നും വിളിക്കുന്നത് ആ സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കൽ പിന്തുണയ്ക്കാത്ത കൃത്യത അവയ്ക്ക് ചാർത്തുന്നതാണ്.

കൂടുതൽ ഓക്സിജൻ എന്നാൽ കൂടുതൽ ഊർജം എന്ന സഹജമായ ബന്ധത്തെ മീഥിലീൻ ബ്ലൂ തകർക്കുന്നു. വേർതിരിച്ചെടുത്ത മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിലെ പഠനം അനുസരിച്ച്, ഗിനിപ്പന്നിയുടെ മസ്തിഷ്കത്തിൽനിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിൽ 100 nM മുതൽ 1 uM വരെ ഡൈ, ഗ്ലൂട്ടമേറ്റ്, മാലേറ്റ് എന്നിവ ചേർന്ന സബ്സ്ട്രേറ്റ്, സക്സിനേറ്റ്, ആൽഫ-ഗ്ലിസറോഫോസ്ഫേറ്റ് എന്നീ സബ്സ്ട്രേറ്റുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ വിശ്രമാവസ്ഥയിലെ ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം ഉയർത്തി. ആൽഫ-ഗ്ലിസറോഫോസ്ഫേറ്റിൽ ഏകദേശം 64 ശതമാനം വർധനയുണ്ടായി. എന്നിരുന്നാലും, ആരോഗ്യകരമായ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിലെ ADP-ഉത്തേജിത ശ്വസനത്തിൽ കാര്യമായ മാറ്റമുണ്ടായില്ല. ലീക്ക് ഉയരുകയും ADP-ഉത്തേജിത ഫ്ലക്സ് മാറ്റമില്ലാതെ തുടരുകയും ചെയ്തതിനാൽ, കണക്കാക്കുന്ന ശ്വസന നിയന്ത്രണ അനുപാതം കുറയുന്നു. ആ കുറവ് ഡൈ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളെ നശിപ്പിച്ചു എന്നല്ല അർത്ഥമാക്കുന്നത്. സാധാരണ ശ്വസനത്തിനുപുറമേ ഓക്സിജൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു റെഡോക്സ് ചക്രം ഡൈ ചേർത്തു എന്നാണ് അതിന്റെ അർത്ഥം. വർധന മാത്രം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്ന ഒരു മീഥിലീൻ ബ്ലൂ ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗ അസ്സേ യഥാർത്ഥ രാസപ്രവർത്തനം അളന്നിട്ടുണ്ടെങ്കിലും ഊർജസംരക്ഷണത്തെക്കുറിച്ച് ഒന്നും പറഞ്ഞിട്ടില്ല.

പ്രവർത്തനം വീണ്ടെടുക്കുന്നതിനുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾ ഇതേ വിടവ് കൂടുതൽ വലിയ തോതിൽ കാണിക്കുന്നു. Complex I തടഞ്ഞപ്പോൾ, ഓക്സിജൻ ഫ്ലക്സ് ഏകദേശം മൂന്നുമടങ്ങായി വീണ്ടെടുത്തെങ്കിലും ATP സംശ്ലേഷണം ഏകദേശം 1.5-മടങ്ങ് മാത്രമാണ് വീണ്ടെടുത്തത്. കൂടുതൽ ഓക്സിജൻ ഇലക്ട്രോഡിലെത്തി. അതിൽ കുറഞ്ഞൊരു പങ്കുമാത്രമാണ് ATP ഉൽപാദനത്തിന് സംഭാവന നൽകിയത്. ഓക്സിഡേറ്റീവ് ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ മെച്ചപ്പെട്ടു എന്ന ഏതൊരു അവകാശവാദത്തിനും ATP-യുടെ ഭാഗത്തെ കണക്കുകളും ആവശ്യമാണ്; ഹരം എങ്ങനെ നിർവചിച്ചുവെന്ന് വ്യക്തമാക്കുന്ന, ഓക്സിജനോട് ആപേക്ഷികമായ ATP അനുപാതമായി അത് രേഖപ്പെടുത്തുന്നതാണ് ഉത്തമം.

ATP അസ്സേകൾ സംശ്ലേഷണ നിരക്ക് അളക്കുന്നു; ആകെ അളവ് അതിന് പകരമാകില്ല

ഒരു ATP അസ്സേ വ്യത്യസ്തമായ ചോദ്യത്തിനാണ് ഉത്തരം നൽകുന്നത്: ഓരോ സമയ യൂണിറ്റിലും എത്ര ATP ഉൽപാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു? മിനിറ്റുകളോളം നിരീക്ഷിക്കുന്ന മിന്നാമിനുങ്ങിന്റെ ലൂസിഫറേസ് ലൂമിനസൻസോ, 340 nm-ൽ വായിക്കുന്ന ഹെക്സോകൈനേസും ഗ്ലൂക്കോസ്-6-ഫോസ്ഫേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസും ചേർന്ന സംയോജിത അസ്സേയോ പോലുള്ള ഗതിക അളവ് ഒരു നിരക്ക് നൽകുന്നു. ഒരൊറ്റ അന്തിമ സമയബിന്ദുവിൽ ആകെ ATP അളക്കുന്നത് അതിന്റെ അളവാണ് നൽകുന്നത്. അത് സംശ്ലേഷണത്തിൽനിന്ന് ഉപഭോഗം കുറച്ചുള്ള ഫലത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു; ഓക്സിഡേറ്റീവ് ഫോസ്ഫോറിലേഷനെക്കുറിച്ച് അതുമാത്രമായി വളരെ കുറച്ചേ പറയുന്നുള്ളൂ.

ബുഡാപെസ്റ്റ് സംഘം അഡിനൈലേറ്റ് കൈനേസ് പ്രവർത്തനം അടക്കിക്കൊണ്ട് സംയോജിത എൻസൈമാറ്റിക് രീതി ഉപയോഗിച്ചു. റോട്ടെനോൺ നൽകിയതും ആന്റിമൈസിൻ നൽകിയതുമായ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിൽ 1 മുതൽ 2 uM വരെ മീഥിലീൻ ബ്ലൂ ATP ഉൽപാദനം മിതമായ തോതിലെങ്കിലും ഗണ്യമായി ഉയർത്തുന്നതായി കണ്ടെത്തി. അത് യഥാർത്ഥ പ്രവർത്തന വീണ്ടെടുപ്പാണ്, എന്നാൽ ഭാഗികമാണ്. TEGDMA വിഷബാധാ പഠനം മറ്റൊരു മാതൃകയിലും സമാനമായ ഉത്തരം കണ്ടെത്തി: 5 mM ദന്തചികിത്സാ മോണോമറായ TEGDMA, Complex I-ബന്ധിത ശ്വസനത്തെ ഏകദേശം 286 ഫ്ലക്സ് യൂണിറ്റുകളിൽനിന്ന് 28 ആയി താഴ്ത്തി; 2 uM ഡൈ അത് ഏകദേശം 86 ആയി വീണ്ടെടുത്തു.

നിറമുള്ള ഒരു റെഡോക്സ് സംയുക്തം ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ രണ്ട് നിയന്ത്രണപരിശോധനകൾ ഒഴിവാക്കാനാവില്ല. ആദ്യം, അളന്ന ATP സംശ്ലേഷണത്തിൽ എത്രത്തോളം ATP സിന്തേസിനെ ആശ്രയിക്കുന്നു എന്ന് സ്ഥാപിക്കാൻ ഒലിഗോമൈസിൻ ഉപയോഗിക്കുക. രണ്ടാമതായി, അറിയാവുന്ന അളവിലുള്ള ATP, സമ്പൂർണ്ണ റീഏജന്റ്, പരീക്ഷണത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച അതേ ഡൈ സാന്ദ്രതകൾ എന്നിവ ചേർത്ത് കോശരഹിത സ്പൈക്ക് റിക്കവറി പരിശോധന നടത്തുക; കുറഞ്ഞത് 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, 2 uM എന്നിവ ഉൾപ്പെടുത്തണം. ഡൈയ്ക്ക് പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന പ്രകാശം ആഗിരണം ചെയ്യാനോ, റിപ്പോർട്ടർ എൻസൈമിനെ തടയാനോ, റീഏജന്റിന്റെ റെഡോക്സ് രസതന്ത്രം മാറ്റാനോ കഴിയും. പൊതുവായ ലൂസിഫറേസ് അസ്സേ മാർഗ്ഗനിർദേശം കൃത്യമായി ഇത്തരം ഇടപെടലുകൾക്കായി ജൈവരാസ പ്രതിപരിശോധനകൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. ഉയർന്ന സാന്ദ്രതകളിൽ സാധാരണയായി ക്വെഞ്ചിംഗ് കൂടുതൽ മോശമാണെന്നതുകൊണ്ട് 1 uM കൃത്രിമ അളവുപിശകുകളില്ലാത്തതാണെന്ന് കരുതരുത്.

സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ പ്രോബുകൾ അളക്കുന്നത് ഡൈയുടെ വിതരണമാണ്, ഫ്ലക്സല്ല

സാഫ്രാനിൻ O, TMRM, TMRE, റോഡാമിൻ 123, JC-1 എന്നിവയെല്ലാം സ്തരത്തിലൂടെ കടക്കാൻ കഴിയുന്ന കാറ്റയോണുകളാണ്. വൈദ്യുതരാസ സന്തുലിതാവസ്ഥയ്ക്ക് അനുസരിച്ച് അവ നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള മാട്രിക്സിൽ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നു. അതിനാൽ സാമ്പിളിന്റെ മൊത്തം ഫ്ലൂറസൻസ്, പ്രോബ് എവിടെ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു എന്നതിലൂടെ പൊട്ടൻഷ്യലിനെ പരോക്ഷമായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. ഇവയിലൊന്നും ATP-യോ ഇലക്ട്രോൺ ഫ്ലക്സോ അളക്കുന്നില്ല.

ഓരോ പ്രോബിനും കൂടുതൽ അനുയോജ്യമായ സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കൽ രീതിയുണ്ട്. വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകൾക്കും സ്തരത്തിന്റെ കടന്നുപോകൽ ശേഷി വർധിപ്പിച്ച കോശങ്ങൾക്കും സാഫ്രാനിൻ O അനുയോജ്യമാണ്. സാധാരണയായി ഏകദേശം 2 uM സാന്ദ്രതയിൽ, ഏകദേശം 495 nm ഉത്തേജനവും 585 nm ഉത്സർജനവും ഉപയോഗിക്കുന്നു. പ്രോബ് ഉള്ളിലേക്ക് എടുക്കുന്നത് മൊത്തം ഫ്ലൂറസൻസിനെ മാറ്റുന്ന ക്വെഞ്ചിംഗ് രീതിയിലാണ് ഇത് പ്രവർത്തിക്കുന്നത്. അക്ഷത കോശങ്ങളിൽ കുറഞ്ഞ നാനോമോളാർ ലോഡിംഗോടെ, ക്വെഞ്ചിംഗ് ഇല്ലാത്ത രീതിയിൽ TMRM, TMRE എന്നിവ അനുയോജ്യമാണ്. ഈ രീതിയിൽ ഡീപോളറൈസേഷൻ ഡൈയെ പുറത്തുവിടുകയും മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഫ്ലൂറസൻസ് കുറയുകയും ചെയ്യുന്നു; ഉയർന്ന ലോഡിംഗിൽ സ്വയം-ക്വെഞ്ചിംഗ് മൂലം സിഗ്നലിന്റെ ദിശ മറിഞ്ഞേക്കാം. JC-1 സൗകര്യപ്രദമായ പച്ച-ചുവപ്പ് അനുപാതം നൽകുന്നുണ്ടെങ്കിലും അത് ലോഡിംഗിനെയും മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ദ്രവ്യമാനത്തെയും ആശ്രയിക്കുന്നു. അതിനാൽ അളവുപരമായ പഠനങ്ങൾക്ക് ശ്രദ്ധാപൂർവം നിയന്ത്രിച്ച TMRM-നെക്കാൾ അത് ദുർബലമാണ്. വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ പ്രോബുകളുടെ അവലോകനം ഈ ഗുണദോഷങ്ങൾ സംഗ്രഹിക്കുന്നു.

മീഥിലീൻ ബ്ലൂ പരീക്ഷണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന സാന്ദ്രതകളിൽ തന്നെ പ്രകാശപരമായ ഇടപെടൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നു. ഏകദേശം 600 മുതൽ 665 nm വരെയുള്ള അതിന്റെ ആഗിരണ ബാൻഡുകൾ ചുവന്ന പ്രോബുകളുടെ ഉത്സർജനവുമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ ഇന്നർ-ഫിൽറ്റർ പ്രഭാവങ്ങൾ, ക്വെഞ്ചിംഗ്, ഉത്തേജനപ്രകാശത്തിന്റെ ആഗിരണം എന്നിവയെല്ലാം സംഭവിക്കാവുന്നതാണ്. ഡൈ ഒരു രണ്ടാമത്തെ ലിപോഫിലിക് കാറ്റയോണുമാണ്; അളക്കുന്ന പൊട്ടൻഷ്യലിനനുസരിച്ച് അതിന്റെ സ്വന്തം വിതരണവും മാറുന്നു. ഒന്നിലധികം സ്വതന്ത്ര അളവുകളും ബ്ലാങ്ക് പരിശോധനകളുമാണ് ഇതിനെ നേരിടാനുള്ള മാർഗ്ഗം: പ്രോബ് മാത്രം, ഡൈ മാത്രം, ഓരോ ഡൈ സാന്ദ്രതയോടും കൂടിയ പ്രോബ്, പൂജ്യ റഫറൻസായി FCCP ഉപയോഗിച്ചുള്ള പൂർണ്ണ ഡീപോളറൈസേഷൻ, സാധ്യമെങ്കിൽ പ്രകാശപരമായി വ്യത്യസ്തമായ രണ്ടാമത്തെ പ്രോബ് എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുക. ആന്റിമൈസിൻ, മിക്സോത്തയസോൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് തടഞ്ഞശേഷം സാഫ്രാനിൻ O, TMRM എന്നിവ രണ്ടും ഉപയോഗിച്ച് സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ വീണ്ടെടുക്കൽ ആവർത്തിക്കുകയും ഒരേ തരത്തിലുള്ള വീണ്ടെടുപ്പ് കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തതിലൂടെ Complex III ബൈപാസ് പഠനം അതിന് മാതൃകയായി. ഒരു പ്രകാശാധിഷ്ഠിത റിപ്പോർട്ടർ ഒരു സൂചനയാണ്. രണ്ട് സ്വതന്ത്ര റിപ്പോർട്ടറുകൾ തെളിവാണ്.

മൂന്ന് സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കലുകൾ, മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത ചോദ്യങ്ങൾ

വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകൾ, സ്തരത്തിന്റെ കടന്നുപോകൽ ശേഷി വർധിപ്പിച്ച കോശങ്ങൾ, അക്ഷത കോശങ്ങൾ എന്നിവ ഒരേ അസ്സേയിലെ പരസ്പരം മാറ്റാവുന്ന സംവേദനക്ഷമതാ ക്രമീകരണങ്ങളല്ല. വ്യത്യസ്ത പ്രവർത്തന തത്വങ്ങളുള്ള വ്യത്യസ്ത ആശയങ്ങളാണവ.

വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകൾ ഇലക്ട്രോൺ ഗതാഗത ശൃംഖല, ആന്തരിക സ്തരം, മാട്രിക്സിലെ പ്രവർത്തന സംവിധാനങ്ങൾ എന്നിവ നിലനിർത്തുന്നു; അതേസമയം പ്ലാസ്മ സ്തരം, സൈറ്റോസോൾ, ശൃംഖലാ ഘടന എന്നിവ നീക്കം ചെയ്യുന്നു. ആ നീക്കം തന്നെയാണ് ലക്ഷ്യം: സബ്സ്ട്രേറ്റുകൾ, ADP, ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ, ഡൈ സാന്ദ്രതകൾ എന്നിവ കൃത്യമായി നിർവചിക്കുന്നതിനാൽ ഒരു പ്രവർത്തനപാത തിരിച്ചറിയാനാകും. സ്വാഭാവിക സബ്സ്ട്രേറ്റ് വിതരണം, സിഗ്നലിംഗ്, ആവശ്യകത എന്നിവ നഷ്ടപ്പെടുന്നതാണ് ഇതിന്റെ പരിമിതി.

സ്തരത്തിന്റെ കടന്നുപോകൽ ശേഷി വർധിപ്പിച്ച കോശങ്ങൾ, തുറന്ന പ്ലാസ്മ സ്തരത്തിലൂടെ പുറത്തുനിന്നുള്ള സബ്സ്ട്രേറ്റുകളും ADP-യും കടത്തിവിടുമ്പോഴും, മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളെ അവയുടെ കോശഘടനയുടെ വലിയൊരു ഭാഗത്തിനുള്ളിൽ നിലനിർത്തുന്നു. ഒരു കോശീയ സാഹചര്യത്തിനുള്ളിൽ സബ്സ്ട്രേറ്റ്-പാതയിലെ തകരാർ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള ശരിയായ ഉപകരണമാണവ. സ്തരത്തിന്റെ കടന്നുപോകൽ ശേഷി അമിതമായി വർധിപ്പിക്കുന്നത് ബാഹ്യ സ്തരത്തെ നശിപ്പിക്കുന്നു; സൈറ്റോസോളിലെ നിയന്ത്രണ ഘടകങ്ങൾ കഴുകിപ്പോകുകയും ചെയ്യുന്നു.

അക്ഷത കോശങ്ങൾ എല്ലാം നിലനിർത്തുന്നു: പ്ലാസ്മ സ്തര തടസ്സം, സൈറ്റോസോളിലെ നിരോക്സീകാരകങ്ങൾ, ആന്തരിക സബ്സ്ട്രേറ്റ് ഗതാഗതം, മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ശൃംഖല, ATP ആവശ്യകത എന്നിവ. അവ ശരീരക്രിയാശാസ്ത്രത്തോട് ഏറ്റവും അടുത്തും പ്രവർത്തനയന്ത്രണത്തെ വേർതിരിച്ചറിയുന്നതിൽ ഏറ്റവും അകലെയുമാണ്. കാരണം ഡൈയുടെ ആഗിരണം, നിരോക്സീകരണം, വേർതിരിച്ച് ശേഖരിക്കൽ എന്നിവയെല്ലാം മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകൾക്ക് ഫലത്തിൽ ലഭിക്കുന്ന ഡൈ സമ്പർക്കത്തെ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു.

TEGDMA പഠനം ഈ മൂന്ന് തലങ്ങളും ബോധപൂർവം ഉപയോഗിച്ചു: ഡൈ ഓക്സിഡേഷനും പൊട്ടൻഷ്യലും വീണ്ടെടുക്കുന്നത് പരിശോധിക്കാൻ വേർതിരിച്ചെടുത്ത മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകൾ; തകരാർ പ്രധാനമായും Complex I-ബന്ധിത സബ്സ്ട്രേറ്റ് ഓക്സിഡേഷനിലാണെന്ന് കണ്ടെത്താൻ സ്തരത്തിന്റെ കടന്നുപോകൽ ശേഷി വർധിപ്പിച്ച ദന്തപൾപ്പ് സ്റ്റെം കോശങ്ങൾ; താഴ്ന്ന ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗത്തിൽ 2 uM ഡൈ ഉണ്ടാക്കുന്ന ശരീരക്രിയാശാസ്ത്രപരമായ മൊത്തം ഫലം പരിശോധിക്കാൻ അക്ഷത സ്റ്റെം കോശങ്ങൾ. വിവിധ സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കലുകളിലെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ അളവുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന വായനക്കാർക്ക്, മീഥിലീൻ ബ്ലൂ ശ്വസനശൃംഖലയിലൂടെ ഇലക്ട്രോണുകളെ എങ്ങനെ നീക്കുന്നു എന്ന അനുബന്ധ വിശദീകരണ ലേഖനം പ്രവർത്തനപാതയുടെ പശ്ചാത്തലം നൽകുന്നു. മീഥിലീൻ ബ്ലൂ ശ്വസനപഠനങ്ങൾ വായിക്കുന്നതിനുള്ള മാർഗ്ഗദർശി ഡോസിന്റെയും ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെയും യുക്തി വിശദീകരിക്കുന്നു.

റെഡോക്സ്-സജീവമായ ഡൈയ്ക്ക് ആവശ്യമായ നിയന്ത്രണപരിശോധനകൾ

ഒരു സാധാരണ ഇൻഹിബിറ്ററിനെക്കാൾ നീണ്ട നിയന്ത്രണപരിശോധനാ പട്ടിക ഒരു റെഡോക്സ് സൈക്ലറിന് ആവശ്യമാണ്. കാരണം ഡൈ മാത്രം ഉൾപ്പെട്ട രാസപ്രവർത്തനങ്ങൾക്ക് ജൈവപ്രവർത്തനങ്ങളെ അനുകരിക്കാനാകും.

റെസ്പിറോമെട്രിക്കായി, അളവിലെ ഡ്രിഫ്റ്റ് പരിശോധിക്കാൻ ബഫർ മാത്രമുള്ള ഒരു ചേംബർ, ജൈവസാമഗ്രികളില്ലാതെ ബഫറും ഡൈയും മാത്രമുള്ള ഒരു ചേംബർ, ഡൈയും അസ്സേയിൽ ഉള്ള ഏതെങ്കിലും കോശബാഹ്യ നിരോക്സീകാരകവും ചേർന്ന പരിശോധന, അക്ഷത കോശങ്ങളിലെ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയേതര ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗം നിർവചിക്കാൻ അവസാനഘട്ടത്തിൽ റോട്ടെനോണും ആന്റിമൈസിനും ചേർക്കുന്ന പരിശോധന എന്നിവ നടത്തുക. നിരോക്സീകരിക്കപ്പെട്ട ഡൈ, ഓക്സിജനിലേക്ക് ഇലക്ട്രോണുകൾ കൈമാറി ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് രൂപപ്പെടുത്തിക്കൊണ്ട് വീണ്ടും ഓക്സീകരിക്കപ്പെടുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുക. അതിനാൽ ഇലക്ട്രോൺ ദാതാവില്ലാത്ത, ഡൈ മാത്രമുള്ള ബ്ലാങ്ക് പരിശോധന, NADH അല്ലെങ്കിൽ NADPH ലഭ്യമാകുമ്പോൾ ഉണ്ടാകുന്ന കോശരഹിത ഓക്സിജൻ ഉപഭോഗത്തെ കുറച്ചുകാണിക്കും.

ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡിനായി, തിരഞ്ഞെടുപ്പില്ലാത്ത DCFDA ഡൈകളെക്കാൾ കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത Amplex UltraRed-ഉം ഹോഴ്സ്റാഡിഷ് പെറോക്സിഡേസും ചേർന്ന രീതി തിരഞ്ഞെടുക്കുക. കാറ്റലേസ് ഉപയോഗിച്ച് സ്ഥിരീകരിക്കുകയും പ്രകാശത്തെ ആശ്രയിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്യുക, കാരണം ഡൈ ഒരു ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറാണ്. മസ്തിഷ്ക മൈറ്റോകോൺഡ്രിയകളിലെ പഠനം, വെറും 100 nM ഡൈയിൽ പെറോക്സൈഡ് ഭാരം നാലുമടങ്ങിലധികം ഉയരുകയും അതിന്റെ നീക്കം മന്ദഗതിയിലാകുകയും ചെയ്തതായി കണ്ടെത്തി. സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഇടനിലയില്ലാതെ നിരോക്സീകരിക്കപ്പെട്ട ഡൈയിൽനിന്ന് നേരിട്ടാണ് പെറോക്സൈഡ് രൂപപ്പെട്ടത്. പ്രോബ് തിരഞ്ഞെടുപ്പിന്റെയും പ്രകാശ നിയന്ത്രണപരിശോധനകളുടെയും വിശദാംശങ്ങൾ ഡൈ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസിനെ അളക്കുന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള അനുബന്ധ ലേഖനത്തിലുണ്ട്. പെറോക്സൈഡ് എപ്പോഴാണ് സിഗ്നലായും എപ്പോഴാണ് ഭാരമായും പ്രവർത്തിക്കുന്നത് എന്ന വിശാലമായ ചോദ്യം കോശീയ റെഡോക്സ് സന്തുലിതാവസ്ഥയും ആന്റിഓക്സിഡന്റ് അവകാശവാദങ്ങളും എന്ന വിഷയത്തോടൊപ്പം ചർച്ച ചെയ്യുന്നു.

പ്രവർത്തനപാതയെക്കുറിച്ചുള്ള അവകാശവാദങ്ങൾക്ക്, Complex III-യിലെ രണ്ട് ഇൻഹിബിറ്റർ സ്ഥാനങ്ങളും പരിശോധിക്കുക: Qi സ്ഥാനത്ത് ആന്റിമൈസിൻ A, Qo സ്ഥാനത്ത് മിക്സോത്തയസോൾ എന്നിവയും, സയനൈഡ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള Complex IV അന്തിമപരിശോധനയും ഉൾപ്പെടുത്തുക. നേരത്തെയുള്ള ഒരു എലി മസ്തിഷ്ക പഠനം റോട്ടെനോൺ തടഞ്ഞ ശ്വസനം ഡൈ വീണ്ടെടുത്തെങ്കിലും ആന്റിമൈസിൻ തടഞ്ഞ ശ്വസനം വീണ്ടെടുത്തില്ലെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. എന്നാൽ പിന്നീട് മൂന്ന് ജീവിവർഗങ്ങളിൽ നടത്തിയ പഠനം രണ്ട് ഇൻഹിബിറ്ററുകളിലും ഭാഗിക വീണ്ടെടുപ്പും നേരിട്ടുള്ള സൈറ്റോക്രോം c നിരോക്സീകരണത്തിനുള്ള തെളിവും കണ്ടെത്തി. ബൈപാസ് സ്ഥിരീകരിക്കപ്പെട്ട ഒന്നായി കാണാതെ, പുതിയ ഡാറ്റയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ഒന്നായി കാണുക. കാരണം ഡൈ സാന്ദ്രത, ഇൻഹിബിറ്റർ സ്ഥാനം, സബ്സ്ട്രേറ്റിന്റെ അവസ്ഥ, ഡൈയുടെ വിതരണം എന്നിവയെല്ലാം നിരീക്ഷിക്കുന്ന പാതയെ മാറ്റുന്നു.

അസ്സേ-തിരഞ്ഞെടുപ്പ് മാട്രിക്സ്

ചോദ്യത്തിനനുസരിച്ച് അളവ് തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ ഈ പട്ടിക ഉപയോഗിക്കുക; അളവിനനുസരിച്ച് ചോദ്യം തിരഞ്ഞെടുക്കരുത്.

ബോധ്യപ്പെടുത്തുന്ന ഒരു അവകാശവാദത്തിന് കുറഞ്ഞത് ഇത്രയെങ്കിലും വേണം: ഒരേ ഡൈ സാന്ദ്രതകളായ 100 nM, 300 nM, 1 uM, 2 uM എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ലീക്ക്, ADP, ഒലിഗോമൈസിൻ, അൺകപ്ലർ സാഹചര്യങ്ങളിലെ ഓക്സിജൻ ഫ്ലക്സ്, ATP സംശ്ലേഷണ നിരക്ക്, സാധ്യമെങ്കിൽ രണ്ട് പ്രോബുകളുള്ള സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ, കാറ്റലേസും കോശരഹിത നിയന്ത്രണപരിശോധനകളും ഉൾപ്പെടുത്തിയ കാലിബ്രേറ്റ് ചെയ്ത പെറോക്സൈഡ് പുറത്തുവിടൽ എന്നിവ പരിശോധിക്കുക. ബന്ധിപ്പിച്ച ഈ അളവുകളുടെ കൂട്ടം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുക: ഓക്സിജൻ ഫ്ലക്സ്, ATP നിരക്ക്, ഓക്സിജനോട് ആപേക്ഷികമായ ATP, പൊട്ടൻഷ്യൽ, പെറോക്സൈഡ് എന്നിവ. ഇവയിൽ ഏതെങ്കിലും ഒരു സംഖ്യ ഒറ്റയ്ക്ക് എടുത്താൽ, അർത്ഥം തേടുന്ന ഒരു അളവ് മാത്രമാണ് അത്.