ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനായി മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉപയോഗിക്കുന്നത് എന്തുകൊണ്ട്

സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ മുഴുവൻ ഘട്ടങ്ങളും പൂർത്തിയാക്കിയ ശേഷം ഒരു ടെക്നീഷ്യൻ കഫത്തിന്റെ സ്മിയർ പരിശോധിക്കുന്നു. നീല പശ്ചാത്തലത്തിൽ ചുവന്ന ദണ്ഡാകൃതികൾ വേറിട്ടുകാണുന്നു; ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ബാസില്ലികളെ കണ്ടതായി റിപ്പോർട്ട് നൽകുന്നു. അടുത്ത ദിവസം മറ്റൊരു സ്ലൈഡിൽ ചുവന്ന ദണ്ഡാകൃതികളൊന്നുമില്ലാത്ത, ഒരേപോലുള്ള നീല പശ്ചാത്തലം കാണുന്നു; ക്ഷയരോഗത്തിന് നെഗറ്റീവ് എന്ന് റിപ്പോർട്ട് നൽകുന്നു. ഈ റിപ്പോർട്ടുകളിൽ ഒന്ന് സ്ലൈഡ് പിന്തുണയ്ക്കുന്നതിലും കൂടുതൽ അവകാശപ്പെടുന്നു; അത് ആദ്യത്തെ റിപ്പോർട്ടല്ല.

ആശയപരമായ ആശയക്കുഴപ്പമാണ് ഇവിടെ പ്രശ്നം. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ മൈകോബാക്ടീരിയയെ കണ്ടെത്താൻ സഹായിക്കുന്നതുപോലെ, നീല വർണ്ണകത്തെ കണ്ടെത്തലിന്റെ രാസപ്രക്രിയയുടെ ഭാഗമായി ടെക്നീഷ്യൻ കണക്കാക്കി. അത് അങ്ങനെ ചെയ്തില്ല. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സ്ലൈഡിൽ എത്തുമ്പോഴേക്കും പരിശോധന പൂർത്തിയായിക്കഴിഞ്ഞിരിക്കുന്നു. ഫലം വായിക്കാൻ കഴിയുന്ന വിധത്തിൽ പശ്ചാത്തലത്തിന് നിറം നൽകുക മാത്രമാണ് ഈ വർണ്ണകം ചെയ്യുന്നത്. ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റെയിനിംഗിൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം എന്താണെന്നും മറ്റേതെങ്കിലും നിറത്തിനു പകരം നീല ഉപയോഗിക്കുന്നത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്നും നീല പശ്ചാത്തലത്തിലെ ചുവപ്പ് എന്തെല്ലാം നിഗമനങ്ങളിൽ എത്താൻ അനുവദിക്കുന്നുവെന്നും ഈ ലേഖനം വിശദീകരിക്കുന്നു.

ചുരുക്കത്തിലുള്ള ഉത്തരം

മൂന്ന് ആശയങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വ്യത്യാസനിർണയ പരിശോധനയാണ് ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റെയിനിംഗ്. പ്രാഥമിക സ്റ്റെയിനായ കാർബോൾ ഫുക്സിൻ മെഴുകുപോലുള്ള ആവരണമുള്ള മൈകോബാക്ടീരിയ ഉൾപ്പെടെ എല്ലാ കോശങ്ങളിലേക്കും കടത്തിവിടുന്നു. നിറം നീക്കുന്ന ആസിഡ്-ആൽക്കഹോൾ സാധാരണ കോശങ്ങളിൽനിന്ന് ചുവന്ന വർണ്ണകം നീക്കുന്നു; എന്നാൽ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് കോശങ്ങളിൽനിന്ന് അത് പുറത്തെടുക്കാൻ കഴിയുന്നില്ല. തുടർന്ന് കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനായ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ, നിറം നീക്കിയ എല്ലാ ഘടകങ്ങൾക്കും നിറം നൽകുന്നു. അതിനാൽ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് അല്ലാത്ത കോശങ്ങളും ആതിഥേയ കോശങ്ങളും അവശിഷ്ടങ്ങളും നീലയായി കാണപ്പെടുമ്പോൾ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ബാസില്ലികൾ ചുവപ്പായി തുടരുന്നു. കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ വർണ്ണവ്യത്യാസം നൽകുന്നു. ഒരു കോശത്തെ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ആക്കുന്ന രാസപ്രക്രിയയിൽ അതിന് പങ്കില്ല.

ഓരോ ഘട്ടവും ചെയ്യുന്നത് എന്ത്

താഴെയുള്ള രേഖാചിത്രം ഓരോ ഘട്ടത്തിന്റെയും ചുമതല കാണിക്കുന്നു. നടപടിക്രമമായി ഇടത്തുനിന്ന് വലത്തേക്ക് വായിക്കുക. ഓരോ സ്റ്റെയിനിംഗ് വിഭാഗവും വ്യത്യസ്തമായ ചോദ്യമാണ് ഉന്നയിക്കുന്നതെന്ന ഓർമ്മപ്പെടുത്തലായി താഴെയുള്ള താരതമ്യഭാഗം വായിക്കുക.

ആദ്യം വർണ്ണകം അകത്തേക്ക് കടക്കണം. മൈകോബാക്ടീരിയയുടെ ആവരണം അസാധാരണമാംവിധം ജലവിരോധിയായതിനാൽ സാധാരണ ജലീയ വർണ്ണകങ്ങൾ അകത്തേക്ക് കടക്കുന്നത് തടയുന്നു; അതിനാൽ പ്രോട്ടോക്കോൾ നിർബന്ധിത പ്രവേശനം ഉറപ്പാക്കുന്നു. സീൽ-നീൽസൻ രീതിയിൽ ചൂടും ആവിയും ഉപയോഗിച്ച് ഫീനോൾ അടങ്ങിയ കാർബോൾ ഫുക്സിൻ മെഴുകുപോലുള്ള ഭിത്തിയിലൂടെ കടത്തിവിടുന്നു. കിൻയൂൺ ശീതരീതിയിൽ ചൂടിനു പകരം വളരെ കൂടുതൽ സാന്ദ്രതയുള്ള പ്രാഥമിക സ്റ്റെയിൻ മിശ്രിതം ഉപയോഗിക്കുന്നു; ചൂട് ഉപയോഗിക്കാത്ത ചില പരിഷ്കരിച്ച പതിപ്പുകളിൽ സർഫാക്റ്റന്റുകളും ചേർക്കുന്നു. അമേരിക്കൻ സൊസൈറ്റി ഫോർ മൈക്രോബയോളജിയുടെ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റെയിൻ പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ ഈ രണ്ട് മിശ്രിതങ്ങളും ഒപ്പത്തിനൊപ്പം രേഖപ്പെടുത്തുന്നു. സാന്ദ്രതയിലെ വ്യത്യാസം ശ്രദ്ധേയമാണ്: ചൂട് ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതിയിൽ 100 mL-ന് ഏകദേശം 0.3 g ബേസിക് ഫുക്സിൻ, ശീതരീതിയിൽ ഏകദേശം 4 g.

രണ്ടാമത്തേത് വ്യത്യാസപ്പെടുത്തലാണ്. സാധാരണയായി 97 mL 95 ശതമാനം എഥനോളിൽ 3 mL സാന്ദ്രീകൃത ഹൈഡ്രോക്ലോറിക് ആസിഡ് ചേർത്ത ആസിഡ്-ആൽക്കഹോൾ, പ്രത്യേക പ്രതിരോധശേഷിയില്ലാത്ത ഭിത്തിയുള്ള എല്ലാ കോശങ്ങളിൽനിന്നും ചുവന്ന വർണ്ണകം കഴുകിനീക്കുന്നു. കേടുപാടില്ലാത്ത മൈകോബാക്ടീരിയൽ ലിപിഡ് ആവരണമുള്ള കോശങ്ങൾ വർണ്ണകം നിലനിർത്തുന്നു. മുഴുവൻ രീതിയുടെയും നിർണായക ഘട്ടം ഇതാണ്; താഴെ വിശദീകരിക്കുന്നതുപോലെ, നിർവഹണരീതിയോട് ഏറ്റവും സംവേദനക്ഷമമായ ഘട്ടവും ഇതുതന്നെ.

അവസാനമാണ് വർണ്ണവ്യത്യാസം നൽകുന്നത്. നിറം നീക്കിയ കോശങ്ങളുടെ ഏതാണ്ട് നിറമില്ലാത്ത പശ്ചാത്തലത്തിൽ ഇപ്പോൾ സ്ലൈഡിൽ ചുവന്ന ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് കോശങ്ങളുണ്ട്. 0.3 ശതമാനം w/v മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ, ചുവപ്പിൽനിന്ന് പരമാവധി വ്യത്യസ്തമായ നിറത്തിൽ ആ പശ്ചാത്തലത്തെ വീണ്ടും ദൃശ്യമാക്കുന്നു. കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനിംഗ് ഹ്രസ്വമാണ്: ചൂട് ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതിയിൽ സാധാരണയായി 20 മുതൽ 30 സെക്കൻഡ് വരെയും ചില ശീതരീതി പതിപ്പുകളിൽ ഏതാനും മിനിറ്റ് വരെയും. ഈ സമയം പ്രോട്ടോക്കോളിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു; വർണ്ണകത്തിന്റെ സ്വന്തം ഗുണമല്ല അത്.

ഈ വർണ്ണകവും നീല നിറവും തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് എന്തുകൊണ്ട്

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒരു കാറ്റയോണിക് ബേസിക് വർണ്ണകമാണ്. അതായത്, അതിന്റെ നിറമുള്ള അയോണിന് പോസിറ്റീവ് ചാർജുണ്ട്; നിറം നീക്കിയ ബാക്ടീരിയയുടെയും ആതിഥേയ കോശങ്ങളുടെയും അവശിഷ്ടങ്ങളുടെയും നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള ഉപരിതലങ്ങളുമായി അത് ബന്ധിക്കുന്നു. ബേസിക് സ്റ്റെയിനുകളുടെ പിന്നിലുള്ള പൊതുതത്ത്വമായി ഈ ചാർജ് യുക്തിയെ ഓപ്പൺസ്റ്റാക്സ് മൈക്രോബയോളജി വിവരിക്കുന്നു. എന്നാൽ ഇവിടെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് രാസപരമായി പ്രത്യേകതയില്ല. ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റും സാഫ്രനിനും ബേസിക് വർണ്ണകങ്ങളാണ്. തിരഞ്ഞെടുപ്പ് പ്രകാശപരമാണ്, രാസപരമല്ല.

ചുവന്ന ദണ്ഡാകൃതികൾക്ക് വ്യത്യസ്ത വർണ്ണഛായയിലുള്ള പശ്ചാത്തലം ആവശ്യമാണ്; ബ്രൈറ്റ്-ഫീൽഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പിയിൽ ഏറ്റവും പ്രയോജനപ്രദമായ വിധത്തിൽ നീല ചുവപ്പിൽനിന്ന് വേറിട്ടുനിൽക്കുന്നു. സാഫ്രനിൻ അനുയോജ്യമായ കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ ആയിരിക്കില്ല, കാരണം അതിന്റെ അന്തിമ പിങ്ക്-ചുവപ്പ് നിറം നിലനിർത്തിയ കാർബോൾ ഫുക്സിന്റെ നിറത്തോട് വളരെ അടുത്താണ്. അതുവഴി നടപടിക്രമം സൃഷ്ടിച്ച വ്യത്യാസംതന്നെ ഇല്ലാതാകും. ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ് ഇരുണ്ട വയലറ്റ് പശ്ചാത്തലം നൽകും; അത് നേർത്ത ചുവന്ന ബാസില്ലികളിൽനിന്ന് ശ്രദ്ധ തിരിക്കും. ഇവിടെ ചുമതല രാസപ്രക്രിയയല്ല, വർണ്ണവ്യത്യാസമാണെന്നതിന്റെ ഏറ്റവും ശക്തമായ തെളിവ് പകരം ഉപയോഗിക്കാനാകുന്നതാണ്: മലാക്കൈറ്റ് ഗ്രീൻ, ബ്രില്ലിയന്റ് ഗ്രീൻ തുടങ്ങിയ പച്ച കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനുകൾ ചില വെറ്ററിനറി, പരിഷ്കരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോളുകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു; പരിശോധന അപ്പോഴും പ്രവർത്തിക്കുന്നു. വ്യക്തമായി വ്യത്യസ്തമായ ഏത് വർണ്ണഛായയും ഒരേ ചുമതല നിർവഹിക്കുന്നതുകൊണ്ടാണിത്.

ഇതിൽനിന്ന് രണ്ട് പ്രായോഗിക നിഗമനങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നു. ഒന്നാമതായി, സാധാരണ മിശ്രിതവിധിയിൽ pH ക്രമീകരണം നിർദേശിക്കുന്നില്ല. ഈ ലളിതമായ ജലീയ 0.3 ശതമാനം ലായനിയെ ലോഫ്ലറുടെ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ പോലുള്ള ക്ഷാര മിശ്രിതങ്ങളുമായി ആശയക്കുഴപ്പത്തിലാക്കരുത്; അവ മറ്റൊരു സ്റ്റെയിനിംഗ് ആശയത്തിന്റെ ഭാഗമാണ്. രണ്ടാമതായി, അമിതമായി ഉപയോഗിക്കുന്നത് ദോഷകരമാണ്. വളരെ സാന്ദ്രമായ നീല പശ്ചാത്തലം വിരളമായ ബാസില്ലികളെ മറച്ചേക്കാമെന്ന് ഹിസ്റ്റോളജി സാഹിത്യം പ്രത്യേകം മുന്നറിയിപ്പ് നൽകുന്നു. അതിനാൽ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുവദിക്കുന്നതിലും കൂടുതൽ സമയം സ്ലൈഡ് വർണ്ണകത്തിൽ മുക്കിവെക്കുന്നത് ഒരു നേട്ടവുമില്ലാതെ വായനാസൗകര്യം നഷ്ടപ്പെടുത്തുന്നു.

പരിശോധന സാധ്യമാക്കുന്ന ഭിത്തിയുടെ രസതന്ത്രം

ആസിഡ്-ആൽക്കഹോൾ കോശങ്ങളെ വ്യത്യാസപ്പെടുത്തുന്നതിന്റെ കാരണം മൈകോബാക്ടീരിയയുടെ ആവരണത്തിലാണ്. അതിന്റെ ഘടനാപരമായ കേന്ദ്രം മൈകോലിൽ-അറബിനോഗാലാക്ടാൻ-പെപ്റ്റിഡോഗ്ലൈക്കാൻ സമുച്ചയമാണ്: അറബിനോഗാലാക്ടാനുമായി ബന്ധിച്ച പെപ്റ്റിഡോഗ്ലൈക്കാൻ; അറബിനോഗാലാക്ടാന്റെ പുറത്തെ അറ്റങ്ങളിൽ വളരെ നീണ്ട ശൃംഖലയുള്ള മൈകോലിക് ആസിഡുകൾ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. ഇവ അസാധാരണമാംവിധം കുറഞ്ഞ കടന്നുപോകൽ ശേഷിയുള്ള, ലിപിഡ് സമ്പന്നമായ പുറം മൈകോമെംബ്രേൻ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു. മൈകോബാക്ടീരിയയുടെ പുറം മെംബ്രേനെക്കുറിച്ചുള്ള അവലോകനം ഈ ഘടന വിശദീകരിക്കുന്നു. ഈ തടസ്സം രണ്ട് ദിശകളിലും പ്രവർത്തിക്കുന്നു. ഇത് വർണ്ണകം അകത്തേക്ക് കടക്കുന്നതിനെ തടയുന്നു; അതുകൊണ്ടാണ് പ്രവേശനത്തിന് ചൂടോ കൂടുതൽ ശക്തമായ പ്രാഥമിക സ്റ്റെയിനോ ആവശ്യമായത്. വർണ്ണകം പുറത്തെടുക്കുന്നതിനെയും ഇത് തടയുന്നു; അതുകൊണ്ടാണ് കാർബോൾ ഫുക്സിൻ അകത്തുകടന്നാൽ ആസിഡ്-ആൽക്കഹോളിന് അത് നീക്കാൻ കഴിയാത്തത്. സാധാരണ ബാക്ടീരിയയ്ക്ക് ഈ ആവരണമില്ല; അവയിൽനിന്ന് വർണ്ണകം നഷ്ടപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് സ്വഭാവത്തെ ഫുക്സിൻ മൈകോലിക് ആസിഡുമായി രാസപരമായി ബന്ധിക്കുന്നതായി കാണുന്നതിനു പകരം, ഒരു ലിപിഡ് തടസ്സത്തിന്റെ പ്രതിഭാസമായി മനസ്സിലാക്കുന്നതാണ് ഉചിതം.

ഈ രസതന്ത്രം ഒരു സാധാരണ സംശയത്തിനും ഉത്തരം നൽകുന്നു: ഗ്രാം രീതിയിൽ മൈകോബാക്ടീരിയയ്ക്ക് നിറം പിടിക്കുന്നത് ദുർബലവും പ്രവചനാതീതവുമാണ്; ചിലപ്പോൾ മങ്ങിയ, മണികൾപോലെ ഇടവിട്ട രൂപങ്ങളായോ നിറം പിടിക്കാത്ത നിഴൽരൂപങ്ങളായോ അവ കാണപ്പെടുന്നു. അവയുടെ ജലവിരോധിയായ ഭിത്തി ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ് അകത്തേക്ക് കടക്കുന്നത് പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു. ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റെയിനിംഗ് പരിഷ്കരിച്ച ഗ്രാം സ്റ്റെയിനല്ല. ഭിത്തിയുടെ മറ്റൊരു ഗുണത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വ്യത്യസ്തമായ വ്യത്യാസനിർണയ തത്ത്വമാണത്; മറ്റ് രണ്ട് രീതികളെക്കുറിച്ചുള്ള ലളിത സ്റ്റെയിനും ഗ്രാം സ്റ്റെയിനും തമ്മിലുള്ള താരതമ്യം ഇത് വ്യക്തമാക്കുന്നു.

മൂന്ന് രീതികൾ, മൂന്ന് ചോദ്യങ്ങൾ

ഒറ്റ വർണ്ണകം ഉപയോഗിക്കുന്ന ബാക്ടീരിയൽ രീതികളുടെ വിപുലമായ വിഭാഗത്തെക്കുറിച്ച് അറിയാൻ മൈക്രോസ്കോപ്പി സ്റ്റെയിനിംഗ് അറ്റ്ലസ് കാണുക.

നീല പശ്ചാത്തലത്തിലെ ചുവപ്പിന് തെളിയിക്കാൻ കഴിയാത്തത്

ചുവന്ന ദണ്ഡാകൃതികൾ കാണുന്നതിന്റെ അർത്ഥം ആസിഡ്-ആൽക്കഹോൾ പ്രയോഗിച്ചിട്ടും ജീവികൾ കാർബോൾ ഫുക്സിൻ നിലനിർത്തി എന്നാണ്. ഈ കണ്ടെത്തൽ മൈകോബാക്ടീരിയം ട്യൂബർകുലോസിസുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. എന്നാൽ മറ്റ് മൈകോബാക്ടീരിയകളും ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ആണെന്ന് CDC-യുടെ ക്ഷയരോഗ നിർണയ മാർഗനിർദേശം വ്യക്തമായി ചൂണ്ടിക്കാട്ടുന്നു. അതിനാൽ സ്പീഷീസ് തിരിച്ചറിയാൻ നിറമല്ല, കൾച്ചറും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പരിശോധനയും ആവശ്യമാണ്.

നിർവഹണത്തിലെ പിശകുകൾ പ്രധാനമായും രണ്ട് കഴുകൽ ഘട്ടങ്ങളിലാണ് കേന്ദ്രീകരിക്കുന്നത്. ആവശ്യത്തിന് നിറം നീക്കാതിരുന്നാൽ പശ്ചാത്തല വസ്തുക്കൾ ചുവപ്പായി തുടരുകയും തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് വായനയ്ക്ക് ഇടയാക്കുകയും ചെയ്യും. അമിതമായി നിറം നീക്കുന്നത് ദുർബലമായി നിലനിർത്തിയ പ്രാഥമിക സ്റ്റെയിൻ പുറത്തെടുക്കുകയും തെറ്റായ നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുകയും ചെയ്യുന്നു. അമിതമായി പ്രയോഗിച്ച കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ വിരളമായ ബാസില്ലികളെ നീലയിൽ മറയ്ക്കുന്നു. കട്ടിയുള്ള സ്മിയറുകൾ, അടിഞ്ഞുകൂടിയ അഭികാരകങ്ങൾ, മലിനമായ കഴുകൽവെള്ളം എന്നിവയും യഥാർത്ഥ ഘടനകളല്ലാത്ത ദൃശ്യങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.

നിർവഹണം എത്ര കൃത്യമായാലും ജീവികളുടെ എണ്ണമാണ് പരിശോധനയുടെ സംവേദനക്ഷമതയ്ക്ക് പരിധി നിശ്ചയിക്കുന്നത്. പരമ്പരാഗത സ്മിയർ മൈക്രോസ്കോപ്പിക്ക് ഒരു മില്ലിലിറ്റർ കഫത്തിൽ ഏകദേശം 5,000 മുതൽ 10,000 വരെ ബാസില്ലികൾ ആവശ്യമാണ്. കൾച്ചറിലൂടെ സ്ഥിരീകരിച്ച ശ്വാസകോശ ക്ഷയരോഗ കേസുകളിൽ സ്മിയറിന്റെ സംവേദനക്ഷമത ഏകദേശം 45 മുതൽ 80 ശതമാനം വരെയാണെന്ന് മുൻകാല CDC തെളിവ് അവലോകനങ്ങൾ വിലയിരുത്തിയിരുന്നു. അതിനാൽ നെഗറ്റീവ് സ്മിയർ ഒരിക്കലും ക്ഷയരോഗത്തെ തള്ളിക്കളയുന്നില്ല. നിലവിലെ CDC മാർഗനിർദേശം ഓരോ സ്മിയറിനോടൊപ്പവും കൾച്ചർ നടത്തണമെന്ന് നിർദേശിക്കുന്നു. ശ്വാസകോശ ക്ഷയരോഗം സംശയിക്കപ്പെടുകയും ഫലം രോഗപരിചരണത്തിൽ മാറ്റം വരുത്തുകയും ചെയ്യുന്ന സാഹചര്യത്തിൽ, കുറഞ്ഞത് ഒരു ശ്വസനസംബന്ധമായ സാമ്പിളിലെങ്കിലും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പരിശോധന നടത്താനും ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

പ്രായോഗിക പ്രവർത്തനം അംഗീകൃത പ്രോട്ടോക്കോളുകൾക്ക് വിധേയമാണ്

ഈ ലേഖനം ഉൾപ്പെടെയുള്ള പഠനവിവരണങ്ങൾ ക്ലിനിക്കൽ പ്രവർത്തനത്തിന് അനുമതി നൽകുന്നില്ല. ലബോറട്ടറിയിലെ പ്രായോഗിക പ്രവർത്തനങ്ങൾക്ക് നിലവിലെ CDC, APHL, അല്ലെങ്കിൽ CLSI രേഖകൾക്ക് അനുസൃതമായ, ലബോറട്ടറി സാധൂകരിച്ച സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഓപ്പറേറ്റിംഗ് നടപടിക്രമം പിന്തുടരുക. CDC-യുടെ സ്റ്റാക്സ് ശേഖരത്തിലുള്ള ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് സ്റ്റെയിനിംഗ് റഫറൻസ് ഇത്തരം നടപടിക്രമങ്ങൾ അഭികാരകങ്ങളും ഫലവായനകളും എങ്ങനെ നിർദേശിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിക്കുന്നു. ക്ഷയരോഗ സാമ്പിളുകളുമായുള്ള പ്രവർത്തനത്തിന് ജൈവസുരക്ഷാ നിയന്ത്രണം ആവശ്യമാണ്: തയ്യാറാക്കുമ്പോൾ വായുവിൽ തങ്ങിനിൽക്കുന്ന സൂക്ഷ്മകണങ്ങളും തെറിച്ചുവീഴുന്ന തുള്ളികളും ഉണ്ടാകുന്നതിനാൽ സ്മിയറുകൾ ബയോളജിക്കൽ സേഫ്റ്റി കാബിനറ്റിൽ തയ്യാറാക്കുന്നു. ചൂട് ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിച്ച സ്മിയറുകളിൽപ്പോലും ജീവനുള്ള ട്യൂബർക്കിൾ ബാസില്ലികൾ ഉണ്ടായേക്കാമെന്നും അവയെ അപ്പോഴും മലിനമായവയായി കൈകാര്യം ചെയ്യണമെന്നും CDC ലബോറട്ടറി സുരക്ഷാ മാർഗനിർദേശം വ്യക്തമാക്കുന്നു. എം. ലെപ്രെയ്ക്കായി പരിശോധിച്ച കാർബോൾ-ഫുക്സിൻ, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സ്മിയറിനെക്കുറിച്ചുള്ള CDC പബ്ലിക് ഹെൽത്ത് ഇമേജ് ലൈബ്രറി എൻട്രി ക്ഷയരോഗത്തിനപ്പുറമുള്ള ഈ രീതിയുടെ ഉപയോഗപരിധി ഓർമ്മപ്പെടുത്തുന്നു: ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ജീവികളെ അന്വേഷിക്കുന്നിടത്തെല്ലാം ഒരേ നീല പശ്ചാത്തലത്തിലെ ചുവപ്പ് എന്ന വർണ്ണവ്യത്യാസം ഉപകരിക്കുന്നു. ശ്രദ്ധാപൂർവം നടത്തിയ നെഗറ്റീവ് വായനയും രേഖപ്പെടുത്തേണ്ട ഒരു ഫലമാണ്.

പൂർത്തിയായ സ്ലൈഡ് വായിക്കൽ

പ്രാഥമിക പരിശോധനയ്ക്കിടെയാണ് കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനിന്റെ പ്രയോജനം വ്യക്തമാകുന്നത്. കുറഞ്ഞ മാഗ്നിഫിക്കേഷനിൽ സ്ലൈഡ് പരിശോധിക്കുന്ന മൈക്രോസ്കോപ്പിസ്റ്റ് ആദ്യം നീല പശ്ചാത്തലം ഉപയോഗിച്ച് സ്മിയറിന്റെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തുന്നു: കോശങ്ങളുടെ സമമായ വിതരണം, ഫോക്കസ് ചെയ്യാൻ സഹായിക്കുന്ന കേടുപാടില്ലാത്ത ആതിഥേയ കോശങ്ങൾ, കനത്ത അവക്ഷേപത്തിന്റെ അഭാവം. തുടർന്ന് ചുവന്ന സംശയാസ്പദ രൂപങ്ങൾ ശ്രദ്ധയാകർഷിക്കുന്നു; സ്ലൈഡിലെ മറ്റൊന്നും ചുവപ്പല്ലാത്തതുകൊണ്ടുതന്നെ. ഓയിൽ ഇമ്മർഷനിലാണ് സ്ഥിരീകരണം നടക്കുന്നത്. അവിടെ യഥാർത്ഥ ബാസില്ലികൾ ഒരേപോലുള്ള വർണ്ണക അവശിഷ്ടങ്ങളായി കാണപ്പെടാതെ, പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന നേർത്ത ദണ്ഡാകൃതികളായി — ചിലപ്പോൾ അല്പം വളഞ്ഞതോ മണികൾപോലെ ഇടവിട്ടതോ ആയി — കാണപ്പെടുന്നു.

പശ്ചാത്തല സ്റ്റെയിനിംഗ് റിപ്പോർട്ടിന്റെ പദപ്രയോഗവും നിർണയിക്കുന്നു. ചുവന്ന ബാസില്ലികളുള്ള സ്ലൈഡിനെ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ബാസില്ലികളെ കണ്ടതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു; പലപ്പോഴും ലബോറട്ടറിയുടെ സ്കെയിൽ അനുസരിച്ചുള്ള അർധ-പരിമാണാത്മക ഗ്രേഡും നൽകുന്നു. ചുവന്ന ജീവികളൊന്നുമില്ലാത്ത സ്ലൈഡിനെ ആസിഡ്-ഫാസ്റ്റ് ബാസില്ലികളെ കണ്ടില്ല എന്നാണ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നത്; ക്ഷയരോഗത്തിന് നെഗറ്റീവ് എന്ന് ഒരിക്കലും പറയരുത്. ഈ വ്യത്യാസം പ്രധാനമാണ്. കാരണം നീല പശ്ചാത്തലം സ്റ്റെയിൻ പ്രവർത്തിച്ചെന്നും കോശങ്ങൾ കൗണ്ടർസ്റ്റെയിൻ സ്വീകരിച്ചെന്നും ദൃശ്യപരിശോധനയ്ക്കുള്ള സംവിധാനം മതിയായിരുന്നെന്നും തെളിയിക്കുന്നു; എന്നാൽ കണ്ടെത്തൽപരിധിക്കു താഴെയുള്ള ജീവികളെക്കുറിച്ച് അത് ഒന്നും പറയുന്നില്ല. ചുവന്ന രൂപങ്ങളില്ലാത്ത നീല പശ്ചാത്തലം സ്ലൈഡിനെക്കുറിച്ചുള്ള സാധുവായ ഫലമാണ്, രോഗിയെക്കുറിച്ചുള്ള വിധിയല്ല.

ഓരോ ഘട്ടത്തിന്റെയും ചുമതല ഓർത്താൽ റിപ്പോർട്ടുകൾ എഴുതുന്നത് ലളിതമാകും. കാർബോൾ ഫുക്സിൻ സാധ്യതയുള്ള ജീവികളെ കണ്ടെത്തുന്നു. ആസിഡ്-ആൽക്കഹോൾ പരിശോധന നടത്തുന്നു. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഉത്തരം വായിക്കാൻ കഴിയുന്ന രീതിയിലാക്കുക മാത്രമാണ് ചെയ്യുന്നത്: ആസിഡിനെ ചെറുത്ത് വർണ്ണകം നിലനിർത്തിയവ ചുവപ്പ്, അത് നഷ്ടപ്പെട്ടവ നീല. സ്പീഷീസ്, ജീവികളുടെ അളവ്, ക്ലിനിക്കൽ അർത്ഥം തുടങ്ങിയ മറ്റെല്ലാം സ്ലൈഡിനപ്പുറമുള്ള പ്രവർത്തനങ്ങളിൽനിന്നാണ് ലഭിക്കുന്നത്.