Ново метиленско сино и боење на ретикулоцити: посебна боја и метод за живи клетки

Еден студент се подготвува да брои ретикулоцити, нарачува метиленско сино, го меша со крв и не гледа речиси ништо. Негов колега користи шише со ознака ново метиленско сино и добива јасни сини филаменти во дел од еритроцитите. Првиот студент претпоставува дека бојата во второто шише е посвежа или поконцентрирана. Не е ниту едното ниту другото. Таа содржи различна молекула.

Ова е концептуалната грешка зад најголемиот дел од забуните во оваа област. Името сугерира дека новото метиленско сино е подобрена серија метиленско сино. Хемијата покажува нешто друго. Новото метиленско сино N е посебна фенотијазинска боја со сопствен број во Colour Index, сопствена шема на супституција и сопствена стандардизирана улога во хематологијата. Кога оваа разлика ќе стане јасна, остатокот од методот — зошто клетките мора да бидат живи при боењето, што се смета за ретикулоцит, каде се вклопуваат Хајнцовите телца и кога во споредбата се вклучува брилијантното крезилско сино — станува лесно разбирлив.

Краткиот одговор

Новото метиленско сино N, хематолошкиот реагенс, обично се идентификува како Basic Blue 24 во записот на PubChem за ново метиленско сино, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, со формула C18H22ClN3S. Обичното метиленско сино е метилтиониниум хлорид, Basic Blue 9, во неговиот запис на PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, со формула C16H18ClN3S. Во структурна смисла, новото метиленско сино има две метилни групи на прстенот и етиламино странични синџири на местата каде што метиленското сино има диметиламино групи. Таа разлика го менува однесувањето при боење. Во хематолошките текстови обичното метиленско сино се опишува како релативно слаба боја за ретикулоцити, а новото метиленско сино како боја што дава поинтензивно и порамномерно обојување. Оваа споредба е сумирана во темата на ScienceDirect за ново метиленско сино.

Да, новото метиленско сино е суправитална боја. Суправиталното боење значи боење на живи клетки по нивното отстранување од телото и пред фиксација, како што е дефинирано во прегледот на NCBI за принципите на суправиталното боење. И новото метиленско сино и брилијантното крезилско сино припаѓаат во оваа категорија, а стандардот на CLSI за ретикулоцити изречно го опфаќа новото метиленско сино како суправитална боја. Студентите понекогаш го сврстуваат ова со боењето по Романовски на фиксирани размаски. Тој начин на размислување тука не важи. Ако прво ги фиксирате клетките, методот престанува да функционира.

За читателите што ги следат сличните имиња на боите, метилско сино наспроти метиленско сино обработува поинаква и поширока забуна меѓу анјонска триарилметанска боја и катјонското фенотијазинско семејство. Прегледот на лабораториското боење ја поставува суправиталната работа во контекст на методите со фиксирани размаски, а водичот за морфологија на крвните клетки покажува каде процената на ретикулоцитите се вклопува во поширокото диференцијално броење.

Едно предупредување при избор од каталог: постои посебна форма на ново метиленско сино како двојна сол со цинк хлорид, со CAS 6586-05-6. Затоа, во делот за методите треба да се наведат солената форма и добавувачот, а не само вообичаеното име.

Што всушност прави суправиталното боење

Ретикулоцит е млад еритроцит што го изгубил своето јадро, но задржал остаточна рибозомална РНК. Во необоен влажен препарат таа РНК е невидлива. Суправиталната боја влегува во живата клетка и ја таложи или ја агрегира таа РНК во сини гранули и филаменти — ретикулофиламентозниот материјал што се гледа при маслена имерзија. Значи, мрежата е производ на боењето, а не претходно оформен скелет што чека да се обои. Затоа променливите во протоколот — концентрацијата на бојата, пуферот, соодносот крв и боја, температурата и времето — се исто толку важни колку и името на бојата.

Практичната последица е строг редослед на постапките: прво измешајте крв со додаден антикоагуланс со бојата, инкубирајте, па направете размаски и прегледајте ги нефиксирани и без дополнително боење. Фиксацијата пред боењето или дополнително боење што ги прикрива бледите филаменти ја уништува информацијата од која зависи броењето.

Практичен протокол за ретикулоцити со ново метиленско сино

Не постои единствена универзална формулација, па затоа наведете ја употребената. Три документирани варијанти го покажуваат опсегот.

Класичната постапка од типот Брехер користи приближно 0.5 проценти ново метиленско сино со калиум оксалат, измешано во еднакви волумени со добро измешана крв со EDTA и инкубирано околу 10 до 15 минути на собна температура. По нежно повторно мешање, се подготвуваат тенки клиновидни размаски, се сушат на воздух и се прегледуваат нефиксирани со имерзионен објектив 100x. Постапката на NCBI за броење ретикулоцити го опишува овој тек на работа и рамката за броење што се користи со него.

Варијантата на Дејси и Луис користи 1.0 проценти ново метиленско сино во цитратен солен раствор, измешано со 2 до 4 волумени крв и држено на 37 C во текот на 15 до 20 минути пред изработката на размаски. Една неодамнешна примена за хармонизација на постапката CLSI H44 користела поразреден раствор од 0.1 проценти во солен раствор пуфериран со фосфати при pH 7.4, со инкубација на 20 C во текот на 10 минути и без фиксација, како што е наведено во студијата од 2026 за хармонизација на NMB.

Правилата за броење се заеднички за сите варијанти. Една клетка се брои како ретикулоцит кога содржи најмалку две одделни сино обоени гранули или сегменти на филаменти, со што се исклучува изолиран талог од бојата. При рутинска работа избројте најмалку 1,000 еритроцити и пријавете ги ретикулоцитите како процент. При ниски проценти, статистиката бара повеќе клетки. Во прегледот на методологијата CLSI H44 се наведува дека при околу 1 процент ретикулоцити се потребни околу 4,400 клетки за варијацијата во броењето да се сведе на 5 проценти, во прегледот на CLSI H44 на De Gruyter. Окуларниот диск на Милер го прави броењето на голем број клетки практично изводливо. Филтрирајте ја бојата или подгответе свеж раствор, бидејќи талогот имитира грануларни инклузии.

Хајнцови телца во истиот препарат

Истата суправитално обоена размаска може да ги прикаже и Хајнцовите телца, кои се агрегати на оксидиран и денатуриран хемоглобин, а не остаточна РНК. Во препарати со ново метиленско сино тие се појавуваат како тркалезни телца, често поединечни и близу до мембраната, обоени посветлосино од ретикулофиламентозниот материјал. Слабо се зачувуваат при фиксација и дополнително боење, па затоа прегледајте ја нефиксираната размаска. Во еден неодамнешен протокол со 20 микролитри крв со EDTA, 20 микролитри ново метиленско сино од 1 процент и 15 минути инкубација, клетките позитивни на Хајнцови телца биле квантифицирани меѓу 250 еритроцити, во студијата на PMC што ја опишува таа постапка.

Две разлики спречуваат погрешно толкување. Прво, метил виолетовата и кристал виолетовата боја ги обојуваат Хајнцовите телца поинтензивно од новото метиленско сино, како што е наведено во темата на ScienceDirect за Хајнцови телца. Новото метиленско сино е практичен избор кога ретикулоцитите и Хајнцовите телца се проценуваат заедно, но не е најсилната наменска боја за Хајнцови телца. Второ, инклузиите на HbH кај носителство на алфа-таласемија по суправитално боење создаваат бројни ситни точки низ целата клетка, додека класичните Хајнцови телца се помалкубројни, поголеми и често поврзани со мембраната. Талогот од бојата е третиот имитатор: се наоѓа надвор од фокусната рамнина на клетките и варира меѓу видните полиња.

Брилијантно крезилско сино наспроти ново метиленско сино

Двете бои се суправитални бои за ретикулоцити, но стандардизацијата ѝ дава предност на едната. Методот за ретикулоцити CLSI H44-A2, развиен заедно со Меѓународниот совет за стандардизација во хематологијата и наведен на страницата за стандардот CLSI H44, го определува боењето на крв со EDTA со ново метиленско сино како рачен споредбен метод. Класичната хематолошка настава го потврдува ова во однос на изгледот: новото метиленско сино дава поинтензивно и порамномерно боење на филаментите, додека брилијантното крезилско сино покажува поголеми варијации меѓу сериите и примероците.

Тој статус бара појаснување. Насоката на ICSH за евалуација на анализатори ја прифаќа рачната микроскопија со ново метиленско сино како референтен споредбен пристап, но ја опишува како субјективна и релативно непрецизна, при што им дава предност на референтните постапки со проточна цитометрија кога се достапни. Споредба од 2022 на 100 примероци утврдила помало систематско отстапување во однос на користениот анализатор со брилијантно крезилско сино отколку со ново метиленско сино, како што е наведено во споредбата на методите за боење на PMC. Образложеното резиме за студентите е: користете ново метиленско сино како стандардизиран рачен компаратор, проверете го секој локален метод со брилијантно крезилско сино во однос на него или на автоматизирано мерење и очекувајте поголема расеаност на резултатите од рачната микроскопија во двата случаи. Постарата литература за стандардизација исто така препорачувала прочистен Azure B како хемиски почиста алтернатива поради варијациите меѓу комерцијалните серии бои, во студијата на Маршал за Azure B, што објаснува зошто степенот на чистота на реагенсот и натаму се спомнува во дискусиите за методите.

Избегнување на вообичаените грешки

Четири грешки се причина за најголемиот дел од неуспешните препарати. Нарачувањето обично метиленско сино наместо ново метиленско сино N дава слабо боење поради хемијата, а не поради техниката. Фиксирањето или дополнителното боење пред прегледувањето го отстранува суправиталниот сигнал. Броењето на талогот од бојата како гранули го зголемува резултатот, што се спречува со правилото за две гранули и со филтрирана боја. Броењето премалку клетки при ниски проценти на ретикулоцити дава бројка што изгледа прецизна, но има широки граници на доверба. Секоја грешка има ист белег: микроскопистот го обвинува микроскопот за нешто што веќе било одредено во чекорот со реагенсот.