Метиленско сино, Nrf2 и митохондријална биогенеза: што е измерено, а што сè уште е претпоставка

Во текстовите за метиленското сино често се појавува една реченица: го активира Nrf2 и создава нови митохондрии. Реченицата звучи како едно тврдење, но содржи два различни концепта, проучувани во различни системи, со различни видови докази. Првиот е сигнална патека, сензор што ги вклучува одбранбените гени. Вториот е програма за изградба, при која клетката создава повеќе митохондријална машинерија. Сигналот може да ја поттикне изградбата, но да се покаже дека сигналот се активирал не е исто што и да се покаже дека градбата е завршена, а повеќе градежен материјал не значи и подобро снабдување со енергија. Оваа статија ги разграничува тие три нешта.

Концептот Nrf2: сензор, а не штит

Nrf2 (нуклеарен фактор 2 поврзан со еритроидниот фактор 2) е транскрипциски фактор, протеин чија задача е да ги вклучува гените. Во состојба на мирување, сензорскиот протеин Keap1 го задржува во цитоплазмата и го предава на клеточната машинерија за отстранување, која постојано го разградува. Кога оксидантите или електрофилите ги модифицираат реактивните цистеини на Keap1, отстранувањето запира. Новосоздадениот Nrf2 се акумулира, преминува во јадрото, се здружува со малите Maf-протеини и се врзува за ДНК-секвенци наречени елементи на антиоксидативниот одговор. Тоа врзување вклучува цела низа одбранбени гени.

Канонските показатели на оваа патека се специфични. NQO1 (NAD(P)H-хинон дехидрогеназа 1) и TrxR1 (тиоредоксин редуктаза 1) се меѓу најсигурните целни гени на Nrf2. HO-1 (хем оксигеназа-1) може силно да се индуцира, но реагира и на други регулатори. Ензимите како SOD и каталазата се дел од антиоксидативната машинерија, но нивните нивоа ги контролираат многу транскрипциски фактори, па зголемувањето на SOD само по себе не докажува дека причината е Nrf2. Доказите најблиски до самиот сигнален настан се акумулација на Nrf2 во јадрото, активирање на ARE-репортер или индукција на канонски цели што исчезнува кога ќе се отстрани Nrf2. Сè друго — пониски нивоа на оксиданти, подобро преживување при стрес, повеќе глутатион — е последователен ефект што може да го предизвикаат многу патеки.

Најраниот резултат со метиленско сино во оваа приказна е поблиску до директните докази на таа скала. Кај фибробласти изложени на наномоларни концентрации на метиленско сино е забележана одложена сенесценција, заедно со поголема содржина на комплекс IV, поголема потрошувачка на кислород и индукција на ензимите од фаза 2, TrxR1 и NQO1, како што е наведено во студијата што прва го поврза метиленското сино со подобрување на митохондријалната функција и одложување на сенесценцијата. TrxR1 и NQO1 се токму канонските цели на Nrf2 што внимателниот читател сака да ги види. Она што студијата не го покажа е самиот сигнален настан: нема мерење на Nrf2 во јадрото, нема ARE-репортер, нема контрола со генетски исклучен Nrf2. Затоа, коректното толкување е дека метиленското сино во овој систем индуцира познати целни гени на Nrf2, што е во согласност со активирање на Nrf2, но не го издвојува Nrf2 како причина. Индукцијата на целен ген е еден чекор по активирањето на прекинувачот.

Концептот на биогенеза: програма со три контролни точки

Митохондријалната биогенеза е програма со која клетката создава поголем митохондријален капацитет. Нејзината учебничка хиерархија минува низ три контролни точки. Прво, коактиваторот PGC-1alpha ја вклучува програмата. Второ, нуклеарните транскрипциски фактори ја поттикнуваат експресијата на митохондријалните гени, вклучувајќи го TFAM, кој ја одржува и реплицира митохондријалната ДНК. Збунувачки е тоа што еден од тие фактори се нарекува NRF1, нуклеарен респираторен фактор 1, и е различен протеин од Nrf2. Трето, клетката завршува со повеќе митохондријални геноми и повеќе респираторна машинерија, што може да се измери преку бројот на копии на mtDNA, активноста на цитрат синтазата или количеството и активноста на респираторните комплекси.

Секоја контролна точка поткрепува тврдење со различна сила од претходната. Повисоко ниво на информациска РНК за PGC-1alpha или TFAM покажува дека е побарано активирање на програмата, а не дека таа е завршена. Повеќе mtDNA или повеќе протеин од комплекс IV покажува повеќе материјал, но и ремоделираните митохондрии може да изгледаат така. Подобрена респирација, поголема потрошувачка на кислород или повисока активност на комплексите покажува дека функцијата се променила, но функцијата може да се подобри и без воопшто да се создадат нови митохондрии. Силното тврдење за биогенеза ги обединува сите три: регулатор, содржина и функција.

Последователната студија на фибробластите го проследи поголемиот дел од тој синџир. Во човечки клетки IMR90 третирани со 100 наномолари метиленско сино, соодносот NAD кон NADH минливо се зголемил во рок од 15 минути и се вратил на почетното ниво во рок од еден ден. По тој минлив енергетски сигнал следувала минлива фосфорилација на енергетскиот сензор AMPK, а потоа индукција на PGC-1alpha и SURF1, протеин потребен за склопување функционален комплекс IV. Активноста на комплекс IV приближно се удвоила, клеточните оксиданти се намалиле за околу 28 проценти, а теломерите се скратувале побавно. Целата низа е изложена во трудот што ја поврзува редокс-активноста на метиленското сино со AMPK и митохондријалната биогенеза.

Два детали во тој труд заслужуваат внимание, бидејќи се токму од оние детали што обично се изоставуваат. Прво, образецот на активирање бил поважен од самото присуство на активација: метиленското сино минливо го вклучувало AMPK, додека референтниот лек AICAR го вклучувал хронично, а минливиот активатор ја одложувал сенесценцијата околу осум пати поефективно. Затоа, тврдењето „метиленското сино го активира AMPK“ е нецелосно; суштинското тврдење е дека го активира AMPK минливо, а споредбата укажува дека хроничното активирање не го постигнува истиот ефект. Второ, метиленското сино не го променило клеточниот циклус, што го исклучува наједноставното алтернативно објаснување: дека клетките едноставно се делеле побавно и поради тоа изгледале помлади.

Истражувањата кај глувци: однесување, геноми и намерно парадоксален поттик

Работата со клеточни култури била проширена на животни од група што проучувала средовечни глувци. По 60 дена орално внесување метиленско сино, третираните глувци задржале поголем дел од физичката издржливост и истражувачкото однесување и покажале помалку однесување слично на анксиозност во споредба со нетретираните остарени глувци. Во мозочното ткиво, експресијата на гените што стареењето ја потиснало — NRF1, TFAM, SOD2 и COX1, подединица на комплекс IV — се вратила кон нивоата кај возрасни глувци, а бројот на копии на mtDNA се зголемил. Тие резултати, однесување заедно со регулатор и количество геноми, се пријавени во студијата на средовечни глувци за метиленското сино и митохондријалната биогенеза во мозокот.

Предложениот поттик е интересниот дел, бидејќи е спротивен на едноставната приказна дека метиленското сино е антиоксидант. Кај третираните глувци е забележано зголемено создавање реактивни кислородни видови во мозочните митохондрии, конкретно водород пероксид. Претпоставката на авторите е дека токму благиот пероксиден сигнал ја активира патеката Nrf2, која потоа ја поттикнува програмата за биогенеза. Во овој модел, метиленското сино е прооксидант во почетниот чекор и антиоксидант во крајниот исход, образец што фармаколозите го нарекуваат хормеза, при кој мал стрес предизвикува одбрана поголема од самиот стрес. Дали тоа зголемување на пероксидот навистина го предизвикува активирањето на Nrf2 не било директно испитано; тоа е претпоставената врска, а не измерена поврзаност.

Придружна студија од истата група го испитала безбедносниот аспект на таа претпоставка во услови на стрес. Во изолирани мозочни митохондрии, метиленското сино го зголемило создавањето водород пероксид дури и при концентрации од само 50 наномолари, но терапевтските концентрации не предизвикале забележливо оштетување на митохондријалната ДНК. Само при 100 микромолари, далеку над терапевтските нивоа, избрани фрагменти на mtDNA покажале оштетување, а комбинацијата од 20 микромолари боја со црвена светлина создала синглетен кислород што широко ја оштетил mtDNA. Тоа е познатото фотосензибилизаторско однесување на бојата, а не нејзиното фармаколошко дејство во отсуство на светлина. Преттретманот дури ги заштитил митохондриите од вентралниот среден мозок од лезии на mtDNA предизвикани од ротенон. Одговорот зависен од дозата и контролите за генотоксичност се детално опишани во студијата за негенотоксичното создавање пероксид под дејство на метиленското сино.

Измерено наспроти претпоставено: како да се чита дијаграмот

Дијаграмот на патеките подолу е изработен за оваа статија за јасно да ја истакне разликата што ја прави текстот. Рамките со полни линии претставуваат чекори со директна експериментална поткрепа во литературата за метиленско сино: редокс-циклирање што го менува NAD/NADH, минлива фосфорилација на AMPK, индукција на PGC-1alpha и SURF1, повисока активност на комплекс IV, индукција на NQO1 и TrxR1, обновена експресија на гените за биогенеза и број на копии на mtDNA во мозокот на глувци, како и зголемување на пероксидот без оштетување на mtDNA при терапевтски дози. Рамките со испрекинати линии ги претставуваат предложените врски: детектирање на пероксидниот сигнал од Keap1, акумулација на Nrf2 во јадрото што ги активира одбранбените гени и причинската стрелка од активирањето на Nrf2 кон програмата за биогенеза. Тие чекори со испрекинати линии се веродостојни, се во согласност со податоците и се дел од стандардната учебничка биологија, но во овие трудови не биле измерени со контролите — Nrf2 во јадрото, ARE-репортери, генетско исклучување на Nrf2 — што би им дале статус на рамки со полни линии.

Кога дијаграмот е пред вас, стануваат видливи три забуни. Прво, NRF1 и Nrf2 се различни протеини со речиси идентични имиња; студијата на глувци го мерела нуклеарниот респираторен фактор 1, регулатор на биогенезата, а не антиоксидативниот транскрипциски фактор, и нивното поистоветување го сведува целиот дијаграм на еден јазол. Второ, генската експресија е почетокот на приказната, а не нејзиниот крај; обновените нивоа на информациска РНК за TFAM или COX1 поткрепуваат барање за биогенеза, додека бројот на копии на mtDNA и активноста на комплекс IV се докази дека барањето е исполнето. Трето, антиоксидативниот исход не докажува дека дејството се одвивало преку Nrf2; намалувањето на оксидантите за 28 проценти во фибробластите и заштитата од ротенон кај глувците се вистински последователни ефекти, но повеќе патеки се спојуваат во нив.

Што би претворило рамка со испрекината линија во рамка со полна линија

Експериментите што недостигаат се стандардни. Мерење на протеинот Nrf2 во јадрото по изложување на метиленско сино, со временско следење усогласено со минливиот сигнал на AMPK, би проверило дали двата огранока навистина се активираат заедно, како што тврди хипотезата за синхронизирано активирање. Репортер управуван од ARE би ја потврдил транскрипциската активност, наместо таа да се заклучува од целните гени. Повторување на мерењата за биогенеза со потисната експресија или со генетски исклучен Nrf2 директно би ја испитало причинската стрелка: ако индукцијата на комплекс IV и зголемувањето на mtDNA се задржат без Nrf2, предложената врска е погрешна, а ефектот се должи само на огранокот AMPK. Кај животните, студија со хронично дозирање и истите три контролни точки — регулатор, содржина, функција — би проверила дали програмата останува активна или се приспособува. Дотогаш, синхронизираното активирање на енергетските и одбранбените патеки останува онака како што го нарекле неговите автори: можен клучен фактор, а не утврден механизам.

Читателите што пристапуваат од пошироката фармакологија можеби ќе го побараат и околниот контекст: како метиленското сино пренесува електрони на митохондријално ниво, што друго прави со митохондриите и клеточната енергија, каде се вклопуваат наодите за сенесценцијата во истражувањата за стареењето, како тврдењата за биогенеза се поврзуваат со когнитивните перформанси и податоците за безбедноста што ги поставуваат границите на секоја дискусија за дозирање. Секој од тие аспекти е посебен концепт со сопствени докази и секој заслужува исто разграничување меѓу измереното и претпоставеното какво што оваа статија направи за Nrf2.