Зошто метиленското сино се користи како контрастна боја при ацидорезистентно боење

Техничар испитува размаска од спутум по целосната постапка на боење. Црвени стапчиња се истакнуваат на сино поле, а во извештајот се наведува дека се забележани ацидорезистентни бацили. Следниот ден, друго предметно стакло покажува еднолично сино поле без црвени стапчиња и се пријавува како негативно за туберкулоза. Еден од овие извештаи тврди повеќе отколку што може да се заклучи од препаратот, и тоа не е првиот.

Забуната е концептуална. Техничарот ја третирал сината боја како дел од хемијата на откривање, како метиленското сино да помогнало во пронаоѓањето на микобактериите. Не помогнало. До моментот кога метиленското сино ќе го допре предметното стакло, тестот веќе е завршен. Бојата само ја обојува заднината за резултатот да може да се прочита. Оваа статија ја објаснува улогата на метиленското сино во ацидорезистентното боење, зошто се користи сина наместо некоја друга боја и каков заклучок дозволува црвеното на сина заднина.

Краткиот одговор

Ацидорезистентното боење е диференцијален тест заснован на три идеи. Карбол фуксинот, примарната боја, принудно се внесува во секоја клетка, вклучително и во микобактериите со восочна обвивка. Киселинско-алкохолниот раствор, средството за обезбојување, ја отстранува црвената боја од обичните клетки, но не успева да ја извлече од ацидорезистентните. Метиленското сино, контрастната боја, потоа обојува сè од што средството за обезбојување ја отстранило бојата, така што неацидорезистентните клетки, клетките на домаќинот и остатоците изгледаат сини, додека ацидорезистентните бацили остануваат црвени. Контрастната боја обезбедува контраст. Таа нема никаква улога во хемијата што ја прави клетката ацидорезистентна.

Што прави секој чекор

Дијаграмот подолу ја покажува поделбата на улогите. Читајте го одлево надесно како постапка, а долната лента како потсетник дека секоја група методи на боење поставува различно прашање.

Прво доаѓа продирањето. Микобактериите се отпорни на обични водени бои бидејќи нивната обвивка е невообичаено хидрофобна, па протоколот го овозможува влегувањето на бојата со дополнителни средства. Кај методот на Цил-Нилсен, загревањето до појава на пареа го потиснува карбол фуксинот што содржи фенол низ восочниот ѕид. Кај ладниот метод на Кинјун, топлината е заменета со многу посилна формулација на примарната боја, а некои изменети верзии без загревање додаваат сурфактанти. Протоколите за ацидорезистентно боење на Американското здружение за микробиологија ги прикажуваат двете формулации една покрај друга, а разликата во концентрацијата е впечатлива: приближно 0.3 g базен фуксин на 100 mL за методот со загревање, наспроти околу 4 g за ладниот метод.

Второ доаѓа диференцирањето. Киселинско-алкохолниот раствор, најчесто 3 mL концентрирана хлороводородна киселина во 97 mL етанол од 95 проценти, ја измива црвената боја од секоја клетка чиј ѕид не пружа посебна отпорност. Клетките со недопрена микобактериска липидна обвивка ја задржуваат бојата. Ова е чекорот од кој зависи целиот метод и чекорот што е најчувствителен на техниката на изведување, како што е објаснето подолу.

Контрастот доаѓа последен. На предметното стакло сега има црвени ацидорезистентни клетки на речиси безбојна заднина од обезбоени клетки. Метиленското сино со концентрација од 0.3 проценти w/v повторно ја прави таа заднина видлива, во боја што максимално се разликува од црвената. Контрастното боење е кратко, обично 20 до 30 секунди кај методот со загревање и до неколку минути кај некои варијанти на ладниот метод, а времетраењето зависи од протоколот, наместо да биде својство на самата боја.

Зошто токму оваа боја и зошто сина

Метиленското сино е катјонска базна боја, што значи дека неговиот обоен јон носи позитивен полнеж и се врзува за негативно наелектризираните површини на обезбоените бактерии, клетките на домаќинот и остатоците. Микробиологија од OpenStax ја опишува оваа логика на полнежите како општ принцип на базните бои. Но метиленското сино тука не е хемиски единствено. Кристал виолет и сафранин исто така се базни бои. Изборот е оптички, а не хемиски.

На црвените стапчиња им е потребна заднина во контрастна нијанса, а сината се спротивставува на црвената на најкорисен начин за микроскопија во светло поле. Сафранинот би бил лоша контрастна боја бидејќи неговата крајна розово-црвена боја е премногу блиска до задржаниот карбол фуксин, со што се губи токму разликата што ја создала постапката. Кристал виолет би дал темновиолетова заднина што би го одвлекувала вниманието од тенките црвени бацили. Најсилниот доказ дека улогата е контраст, а не хемија, е можноста за замена: зелените контрастни бои, како малахитно зелено и брилијантно зелено, се користат во некои ветеринарни и изменети протоколи, а тестот и понатаму функционира, бидејќи секоја јасно различна нијанса ја врши истата работа.

Од ова произлегуваат две практични последици. Прво, стандардната рецептура не предвидува приспособување на pH; не мешајте го овој обичен воден раствор од 0.3 проценти со алкални формулации како Лефлеровото метиленско сино, кои припаѓаат на поинаков концепт на боење. Второ, претерувањето штети. Хистолошката литература изречно предупредува дека премногу густата сина заднина може да ги прикрие малубројните бацили, па оставањето на бојата врз препаратот подолго отколку што дозволува протоколот ја намалува читливоста без никаква корист.

Хемијата на ѕидот што го овозможува тестот

Причината поради која киселинско-алкохолниот раствор ги разликува клетките лежи во микобактериската обвивка. Нејзиното структурно јадро е комплексот миколил-арабиногалактан-пептидогликан: пептидогликан поврзан со арабиногалактан, чии надворешни краеви носат миколни киселини со многу долги синџири, формирајќи надворешна микомембрана богата со липиди и со невообичаено мала пропустливост. Прегледот на микобактериската надворешна мембрана детално ја опишува оваа архитектура. Бариерата дејствува во двете насоки. Таа се спротивставува на влегувањето на бојата, поради што за продирање е потребна топлина или посилна примарна боја, а се спротивставува и на извлекувањето на бојата, поради што киселинско-алкохолниот раствор не успева да го отстрани карбол фуксинот откако ќе влезе внатре. Обичните бактерии ја немаат оваа обвивка и ја губат бојата. Затоа ацидорезистентноста најдобро се разбира како појава поврзана со липидната бариера, а не како хемиско врзување на фуксинот со миколната киселина.

Оваа хемија објаснува и една честа недоумица: микобактериите се бојат слабо и непредвидливо со Грамовиот метод, понекогаш изгледајќи како бледи форми со зрнест изглед или како необоени контури. Нивниот хидрофобен ѕид го ограничува продирањето на кристал виолет. Ацидорезистентното боење не е изменето Грамово боење. Тоа е поинаков диференцијален принцип заснован на различно својство на ѕидот, како што покажува споредбата на едноставното боење со Грамовото боење за другите два метода.

Три метода, три прашања

За пошироката група методи за боење бактерии со една боја, видете го атласот на боење за микроскопија.

Што не може да докаже црвеното на сина заднина

Црвените стапчиња значат дека организмите го задржале карбол фуксинот при дејство на киселинско-алкохолниот раствор. Тој наод е во согласност со Mycobacterium tuberculosis, но насоките на CDC за дијагностицирање туберкулоза изречно наведуваат дека и други микобактерии се ацидорезистентни, па за идентификација на видот се потребни култура и тестирање на нуклеински киселини, а не боја.

Грешките во техниката главно се јавуваат околу двете испирања. Недоволното обезбојување го остава материјалот во заднината црвен и создава можност за лажно позитивни толкувања. Прекумерното обезбојување ја отстранува слабо задржаната примарна боја и придонесува за лажно негативни резултати. Премногу интензивно нанесената контрастна боја ги затскрива малубројните бацили во сината заднина. Дебелите размаски, таложените реагенси и контаминираната вода за испирање додаваат свои артефакти.

Чувствителноста е ограничена од бројот на организми, без оглед на тоа колку правилно е изведена техниката. За конвенционална микроскопија на размаска се потребни приближно 5,000 до 10,000 бацили на милилитар спутум, а постарите прегледи на доказите од CDC ја проценувале чувствителноста на размаската на околу 45 до 80 проценти кај белодробни случаи потврдени со култура. Затоа негативна размаска никогаш не ја исклучува туберкулозата. Тековните насоки на CDC предвидуваат култура покрај секоја размаска и препорачуваат тестирање со амплификација на нуклеински киселини на најмалку еден респираторен примерок кога се разгледува можноста за белодробна туберкулоза и резултатот би го променил понатамошното постапување.

Практичната работа се води според одобрени протоколи

Образовните описи, вклучително и оваа статија, не претставуваат одобрение за клиничка работа. За практична лабораториска работа, следете ја валидираната стандардна оперативна постапка на лабораторијата, усогласена со тековните документи на CDC, APHL или CLSI; референтниот документ на CDC за ацидорезистентно боење, зачуван во архивата Stacks, покажува како таквите постапки ги утврдуваат реагенсите и начинот на читање на резултатите. Работата со примероци за туберкулоза бара мерки за задржување на биолошкиот материјал: размаските се подготвуваат во кабинет за биолошка безбедност бидејќи подготовката создава аеросоли и прскање, а насоките на CDC за лабораториска безбедност наведуваат дека дури и размаските фиксирани со топлина може да содржат живи туберкулозни бацили и мора и понатаму да се третираат како контаминирани. Записот во Библиотеката на слики за јавно здравје на CDC за размаска обоена со карбол фуксин и метиленско сино, испитувана за M. leprae, е корисен потсетник за примената на методот и надвор од туберкулозата: истиот контраст на црвено врз сино служи секаде каде што се бараат ацидорезистентни организми, а внимателно утврден негативен наод и самиот е резултат што вреди да се запише.

Читање на готовиот препарат

Контрастната боја ја оправдува својата улога при прегледувањето. Микроскопистот што прегледува при мало зголемување најпрво ја користи сината заднина за да го процени квалитетот на размаската: рамномерна распределба на клетките, недопрени клетки на домаќинот за фокусирање, без обилен талог. Црвените структури што би можеле да бидат бацили потоа го привлекуваат погледот токму затоа што ништо друго на препаратот не е црвено. Потврдата се врши со маслена имерзија, каде што вистинските бацили ги покажуваат очекуваните тенки, понекогаш малку закривени или зрнести стапчиња, наместо еднолични остатоци од боја.

Боењето на заднината го одредува и речникот на извештајот. За препарат со црвени бацили се известува дека се забележани ацидорезистентни бацили, често со полуквантитативна оцена според скалата на лабораторијата. За препарат без црвени организми се известува дека не се забележани ацидорезистентни бацили, никогаш дека е негативен за туберкулоза. Разликата е важна бидејќи синото поле докажува дека боењето успеало, клетките ја примиле контрастната боја и оптиката била соодветна, но не кажува ништо за организми под границата на откривање. Сино поле без видливи бацили е валиден резултат за препаратот, а не конечен заклучок за пациентот.

Запомнете ја поделбата на улогите и составувањето на извештаите ќе биде јасно. Карбол фуксинот ги открива потенцијалните бацили. Киселинско-алкохолниот раствор го изведува тестот. Метиленското сино само го прави одговорот читлив: црвените ја задржале бојата при дејство на киселината, сините ја изгубиле. Сè друго — видот, бројноста и клиничкото значење — произлегува од испитувања што одат подалеку од препаратот.