Мерење на митохондриските ефекти на метиленското сино: кислород, ATP и мембрански потенцијал

Да претпоставиме дека една лабораторија додава метиленско сино во митохондрии со нарушена респирација и забележува зголемена потрошувачка на кислород. Природно е да се напише дека бојата ја обновила митохондриската функција. Таа реченица може да биде погрешна. Кислородниот флукс, синтезата на ATP и мембранскиот потенцијал се три различни поими. Тие ја делат истата органела како што резервното копирање, синхронизацијата и споделувањето ја делат истата папка во облакот: поврзани се, но се водат според различни правила. Ако едното се помеша со другото, толкувањето е погрешно, дури и кога секое мерење е технички точно.

Метиленското сино ја прави оваа забуна веројатна затоа што учествува во системот што се мери. Тоа е соединение што редокс-циклира, прифаќајќи електрони во претходните делови на патеката и предавајќи ги во подоцнежните, липофилен катјон што се акумулира во енергизирани митохондрии и изразено сино соединение што апсорбира и емитува светлина во истите спектрални подрачја како вообичаените сонди. Едно мерење не може да ги опфати сите овие аспекти. Сигурниот пристап, покажан во митохондриските студии од Будимпешта, е да се мерат кислородниот флукс, стапката на синтеза на ATP, мембранскиот потенцијал и ослободувањето на водороден пероксид, со контроли специфични за бојата во секој чекор.

Респирометријата го мери кислородниот флукс, а не енергетскиот излез

Респирометријата со висока резолуција, било со Oroboros Oxygraph или со анализаторот на екстрацелуларен флукс Seahorse, покажува едно нешто: колку брзо се редуцира кислородот. Таа не покажува колку протони се испумпани по електрон, колкав дел од градиентот е зачуван или дали ATP-синтазата го искористила.

Терминологијата е важна. Кај изолираните митохондрии, супстратот без ADP дава респирација поради протекување, супстратот со заситувачко количество ADP дава капацитет за оксидативна фосфорилација, а титрацијата со раздвојувач дава максимален капацитет за пренос на електрони. Кај интактните клетки, еквивалентите што ги мери Seahorse се базална респирација, респирација поврзана со ATP и чувствителна на олигомицин, протонско протекување, максимална респирација дефинирана со FCCP и немитохондриска потрошувачка на кислород отпорна на ротенон и антимицин. Нарекувањето на резултатите од Seahorse состојба 3 и состојба 4 им припишува прецизност што препаратот не ја поддржува, како што јасно покажува рамката на Agilent Mito Stress Test.

Метиленското сино ја нарушува интуитивната врска меѓу повеќе кислород и повеќе енергија. Во изолирани митохондрии од мозок на морско прасе, бојата во концентрации од 100 nM до 1 uM ја зголемила потрошувачката на кислород во мирување со супстратите глутамат и малат, сукцинат и алфа-глицерофосфат, со зголемување од приближно 64 проценти при алфа-глицерофосфат. Сепак, респирацијата стимулирана со ADP кај здравите митохондрии останала суштински непроменета, според студијата за изолирани мозочни митохондрии. Бидејќи респирацијата поради протекување се зголемила, а флуксот стимулиран со ADP останал ист, пресметаниот сооднос на респираторна контрола се намалува. Тоа намалување не значи дека бојата ги оштетила митохондриите. Тоа значи дека бојата додала редокс-циклус што троши кислород покрај нормалната респирација. Анализа на потрошувачката на кислород со метиленско сино што го прикажува само зголемувањето измерила реална хемиска реакција, но не кажала ништо за зачувувањето на енергијата.

Експериментите за обновување на функцијата ја покажуваат истата разлика во поголем обем. При блокиран комплекс I, кислородниот флукс се обновил приближно трикратно, додека синтезата на ATP се обновила само околу 1.5-кратно. Повеќе кислород стигнал до електродата. Помал дел од него придонел за ATP. За секое тврдење за подобрена оксидативна фосфорилација се потребни и податоците за ATP, идеално изразени како сооднос ATP по кислород, со наведена конвенција за именителот.

Анализите на ATP ја мерат стапката на синтеза, која не може да се замени со содржината

Анализата на ATP одговара на друго прашање: колку ATP се создава во единица време. Кинетичко мерење, било преку луминисценција на луцифераза од светулки следена во текот на неколку минути или преку спрегната анализа со хексокиназа и глукоза-6-фосфат дехидрогеназа, мерена на 340 nm, дава стапка. Еднократно мерење на вкупниот ATP во крајна точка дава содржина, која ја одразува синтезата минус потрошувачката и сама по себе кажува малку за оксидативната фосфорилација.

Групата од Будимпешта го користела спрегнатиот ензимски метод со потисната аденилат киназа и утврдила дека метиленското сино во концентрации од 1 до 2 uM умерено, но значајно го зголемило производството на ATP во митохондрии третирани со ротенон и со антимицин. Тоа е вистинско обновување на функцијата, но е делумно. Студијата за токсичноста на TEGDMA дошла до сличен резултат во различен модел: 5 mM од денталниот мономер TEGDMA ја намалиле респирацијата поврзана со комплекс I од приближно 286 на 28 единици на флукс, а 2 uM од бојата ја обновиле на приближно 86.

Две контроли се задолжителни кога се работи со обоено редокс-соединение. Прво, употребете олигомицин за да утврдите колкав дел од измерената синтеза на ATP зависи од ATP-синтазата. Второ, изведете тест за поврат на додадено познато количество ATP во бесклеточен систем, со комплетниот реагенс и со точните концентрации на бојата што се користат, најмалку 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM и 2 uM. Бојата може да ја апсорбира емитираната светлина, да го инхибира репортерскиот ензим или да ја измени редокс-хемијата на реагенсот, а општите насоки за анализи со луцифераза препорачуваат биохемиски контратестови токму за оваа класа интерференции. Не претпоставувајте дека при 1 uM нема артефакти само затоа што гаснењето на сигналот обично е поизразено при повисоки концентрации.

Сондите за мембрански потенцијал ја мерат распределбата на бојата, а не флуксот

Сафранин O, TMRM и TMRE, родамин 123 и JC-1 се катјони што можат да поминат низ мембраната. Тие се акумулираат во негативно наелектризираниот матрикс според електрохемиската рамнотежа, па вкупната флуоресценција индиректно го покажува потенцијалот преку местоположбата на сондата. Ниту една од нив не мери ATP или електронски флукс.

За секоја сонда постои најсоодветен препарат. Сафранин O е погоден за изолирани митохондрии и пермеабилизирани клетки, обично при околу 2 uM, со ексцитација околу 495 nm и емисија околу 585 nm, во режим на гаснење во кој внесувањето ја менува вкупната флуоресценција. TMRM и TMRE се погодни за интактни клетки при ниско наномоларно внесување, во режим без гаснење, каде што деполаризацијата ја ослободува бојата и митохондриската флуоресценција се намалува; при високо внесување, насоката на сигналот може да се преврти поради самогаснење. JC-1 дава практичен сооднос меѓу зелената и црвената флуоресценција, но зависи од внесувањето и од митохондриската маса, што го прави послаб избор за квантитативна работа од внимателно контролиран TMRM. Овие предности и ограничувања се сумирани во широко користен преглед на сонди за митохондриски мембрански потенцијал.

Метиленското сино предизвикува оптичка интерференција токму при работните концентрации. Неговите апсорпциски подрачја околу 600 до 665 nm се преклопуваат со црвената емисија на сондите, па ефектите на внатрешен филтер, гаснењето и апсорпцијата на ексцитациската светлина се реални можности. Бојата е и втор липофилен катјон чија сопствена распределба се менува со потенцијалот што се мери. Заштитата се состои во повеќекратна проверка и празни примероци: само сонда, само боја, сонда со секоја концентрација на бојата, целосна деполаризација со FCCP како нулта референца и, идеално, втора оптички различна сонда. Студијата за заобиколување на комплекс III го поставила тој преседан, повторувајќи го обновувањето на мембранскиот потенцијал со сафранин O и со TMRM по инхибиција со антимицин и миксотиазол, при што било добиено исто квалитативно обновување. Еден оптички репортер е навестување. Два независни репортери се доказ.

Три препарати, три различни прашања

Изолираните митохондрии, пермеабилизираните клетки и интактните клетки не се заменливи поставки за чувствителност на една анализа. Тие се различни концепти со различни принципи на работа.

Изолираните митохондрии ги зачувуваат синџирот за пренос на електрони, внатрешната мембрана и механизмите во матриксот, а ги отстрануваат плазматската мембрана, цитозолот и мрежната архитектура. Токму тоа отстранување е целта: супстратите, ADP, инхибиторите и концентрациите на бојата се точно дефинирани, што овозможува да се утврди патеката. Цената е губење на природното снабдување со супстрати, сигнализацијата и потребата за енергија.

Пермеабилизираните клетки ги задржуваат митохондриите во голем дел од нивната клеточна архитектура, а пропуштаат егзогени супстрати и ADP низ отворената плазматска мембрана. Тие се соодветна алатка за утврдување дефект во патека на супстрат во клеточен контекст. Прекумерната пермеабилизација ја оштетува надворешната мембрана, а цитозолната регулација се губи со испирањето.

Интактните клетки зачувуваат сè: бариерата на плазматската мембрана, цитозолните редуцирачки агенси, ендогениот транспорт на супстрати, митохондриската мрежа и потребата за ATP. Тие се најблиску до физиологијата и најдалеку од механизмот, бидејќи внесувањето, редукцијата и секвестрацијата на бојата ја обликуваат ефективната изложеност на митохондриите.

Студијата за TEGDMA намерно ги користела сите три нивоа: изолирани мозочни митохондрии за обновување на оксидацијата и потенцијалот со бојата, пермеабилизирани матични клетки од дентална пулпа главно за локализирање на нарушувањето во оксидацијата на супстрати поврзана со комплекс I и интактни матични клетки за физиолошкиот нето-ефект на 2 uM од бојата врз потиснатата потрошувачка на кислород. За читателите што ги споредуваат митохондриските мерења меѓу различни препарати, придружното објаснување за тоа како метиленското сино ги пренесува електроните низ респираторниот синџир ја дава основата за патеките, а водичот за читање студии за респирација со метиленско сино ја опфаќа логиката на дозите и инхибиторите.

Контроли што ги бара една редокс-активна боја

Соединение што редокс-циклира бара подолг список на контроли од обичен инхибитор, бидејќи хемиските реакции на самата боја можат да имитираат биолошки процеси.

За респирометрија, користете комора само со пуфер за проверка на дрейфот, комора со пуфер и боја без биолошки материјал, боја со секој екстрацелуларен редуцирачки агенс присутен во анализата и завршно додавање ротенон и антимицин за да се дефинира немитохондриската потрошувачка на кислород во интактни клетки. Имајте предвид дека редуцираната боја повторно се оксидира со пренесување електрони на кислородот и создавање водороден пероксид. Затоа, празен примерок само со боја, без донор на електрони, ја потценува бесклеточната потрошувачка на кислород што се појавува кога се достапни NADH или NADPH.

За водороден пероксид, дајте предност на калибриран Amplex UltraRed со пероксидаза од рен наместо на неселективни бои DCFDA, проверете со каталаза и тестирајте ја зависноста од осветлувањето, бидејќи бојата е фотосензибилизатор. Студијата за мозочни митохондрии утврдила дека оптоварувањето со пероксид се зголемило повеќе од четирикратно при само 100 nM од бојата, додека елиминацијата се забавила, при што пероксидот се создавал директно од редуцираната боја без супероксиден меѓупроизвод. Деталите за изборот на сонда и контролите за светлина се во придружниот текст за мерење реактивни кислородни видови во експерименти со бои, а поширокото прашање кога пероксидот дејствува како сигнал, а кога како оптоварување, е обработено заедно со клеточната редокс-рамнотежа и тврдењата за антиоксиданси.

За тврдења за патеките, тестирајте ги двете инхибиторни места на комплекс III: антимицин A на местото Qi и миксотиазол на местото Qo, како и крајна точка на комплекс IV со цијанид. Една претходна студија на мозок од глувци пријавила обновување со бојата на респирацијата блокирана со ротенон, но не и на онаа блокирана со антимицин, додека подоцнежната студија со три видови утврдила делумно обновување со двата инхибитора и докази за директна редукција на цитохром c. Сметајте дека заобиколувањето е во согласност со поновите податоци, а не дека е конечно утврдено, бидејќи концентрацијата на бојата, местото на дејство на инхибиторот, состојбата на супстратот и распределбата на бојата ја менуваат набљудуваната патека.

Матрица за избор на анализа

Користете ја оваа табела за да го изберете мерењето според прашањето, а не обратно.

Минималното убедливо тврдење бара истите концентрации на бојата, 100 nM, 300 nM, 1 uM и 2 uM, да се испитаат за кислороден флукс во услови на протекување, ADP, олигомицин и раздвојувач, за стапка на синтеза на ATP, за мембрански потенцијал по можност со две сонди и за калибрирано ослободување пероксид со каталаза и бесклеточни контроли. Прикажете го поврзаниот сет: кислороден флукс, стапка на синтеза на ATP, ATP по кислород, потенцијал и пероксид. Секој од тие броеви сам за себе е мерење што бара значење.