Едноставно боење со метиленско сино наспроти боење по Грам: што може да докаже секој метод

Студент подготвува размаска од култура означена како E. coli, ја прекрива со метиленско сино една минута, ја плакне и ја набљудува низ објективот за маслена имерзија. Сини стапчиња го исполнуваат видното поле. Во лабораторискиот извештај пишува: „Грам-негативни стапчиња идентификувани како E. coli.“ Набљудувањето е точно. Заклучокот не е поткрепен со тој препарат.

Грешката е концептуална, не техничка. Студентот го третирал едноставното боење како да е диференцијален тест. Едноставното боење и боењето по Грам одговараат на различни прашања бидејќи се засноваат на различни принципи на боење. Едното прашува: каков облик е присутен. Другото прашува: како се однесува клеточниот ѕид кога е подложен на тест. Ако ги помешате, правилно обоен препарат ќе доведе до неоправдан извештај.

Оваа споредба јасно ги разграничува двата метода, покажува какви тврдења дозволува секој резултат и одговара на двете прашања што студентите најчесто ги поставуваат: дали метиленското сино може да се користи при боење по Грам и што навистина покажува боењето на E. coli со метиленско сино.

Краткиот одговор

Едноставното боење со метиленско сино ја бои секоја клетка што може да се обои во иста сина боја, па ги открива морфологијата (стапчести, топчести, спирални форми) и распоредот (поединечно, во парови, во синџири), но не кажува ништо за категоријата според Грам. Боењето по Грам додава јод, чекор на обезбојување и контрастна боја, па ги раздвојува бактериите на Грам-позитивни (виолетови) и Грам-негативни (розови или црвени) според тоа како нивните клеточни обвивки ја задржуваат бојата. Сини стапчиња по боење со метиленско сино значат „присутни се стапчести клетки“. Розови стапчиња по целосната постапка по Грам значат „присутни се Грам-негативни стапчиња“. Второто тврдење е посилно бидејќи постапката вклучила дополнителен тест.

За пошироката група методи за боење бактерии со една боја, на која ѝ припаѓа оваа статија, видете го атласот за боење во микроскопијата.

Едноставно боење: една боја, едно прашање

Метиленското сино е базна (катјонска) боја. Неговиот обоен јон носи позитивен полнеж и се врзува за негативно наелектризирани структури во клетката, вклучувајќи нуклеински киселини и кисели површински групи, па клетките изгледаат сини на бледа заднина. OpenStax го опишува овој принцип на позитивно боење во своето поглавје за боење. Самиот катјон на бојата е малиот, рамнински фенотијазински јон детално опишан во референтниот преглед за хемијата на метиленското сино; хлоридниот противјон не го врши боењето.

Стандардниот наставен протокол е намерно едноставен: направете тенка размаска, исушете ја на воздух, фиксирајте ја со топлина, прекријте ја со приближно 1% воден раствор на метиленско сино околу една минута, нежно исплакнете ја со вода, исушете ја со впивање и прегледајте ја со маслена имерзија. Наставен протокол на LibreTexts ја наведува токму оваа постапка со 1% раствор во траење од една минута, со напомена дека некои лаборатории го продолжуваат времето. Нема мордант, нема средство за обезбојување, нема втора боја. Токму тоа отсуство е суштината. Со само една боја и без селективно отстранување, секоја клетка што ја врзува бојата на крајот ја има истата боја.

Кај E. coli, очекуваното видно поле содржи сини стапчиња (бацили), поединечно, во парови или во мали групи. Сината боја потекнува од бојата за боење. Стапчестиот облик потекнува од организмот. Но оваа комбинација не го идентификува организмот, бидејќи многу видови се стапчести и многу стапчести бактерии се бојат сино при едноставно боење. ATCC јасно го наведува ова ограничување на морфологијата во својот водич за микробиолошки култури. Правилен извештај гласи: „забележани се сини бацили“. За сè што е надвор од обликот и распоредот се потребни дополнителни докази.

Боење по Грам: четири реагенси, еден тест на однесување

Боењето по Грам е диференцијално боење. Сите клетки ги подложува на истата низа чекори и се набљудува кои клетки ја задржуваат првата боја, а кои ја губат. Протоколите за боење по Грам на Американското здружение за микробиологија го дефинираат стандардниот редослед од четири чекори: кристал виолет (примарна боја), Грамов јод (мордант), алкохол или мешавина од ацетон и алкохол (средство за обезбојување), а потоа сафранин (контрастна боја).

Стандардниот наставен модел ја објаснува разликата преку структурата на клеточната обвивка. Грам-позитивните клетки имаат дебел пептидогликански ѕид што се дехидрира и го задржува комплексот кристал виолет–јод при плакнењето со алкохол. Грам-негативните клетки имаат тенок пептидогликански слој и надворешна мембрана богата со липиди што средството за обезбојување ја нарушува, па комплексот се измива и клетките потоа го примаат сафранинот. Прегледот за боење по Грам на NCBI Bookshelf го дава ова објаснување поврзано со клеточниот ѕид. Специјалистите додаваат дека целокупната физичка хемија е посложена од самата дебелина на ѕидот, но за толкување во лабораторија важи правилото на однесување: виолетово значи дека бојата е задржана, а розово значи дека е изгубена, па потоа е нанесена контрастна боја.

Илустративни панели. Стилизирани цртежи за споредба на методите, не микрофотографии направени со камера. Боите се поедноставени за да ја објаснат логиката: една боја при едноставно боење, две бои по обезбојувањето во постапката по Грам.

Дали метиленското сино може да се користи при боење по Грам

Ова прашање има две толкувања, за кои се потребни различни одговори.

Прво толкување: дали еднократно прекривање со метиленско сино може да ја замени целата постапка по Грам. Не. Без јод, средство за обезбојување и контрастна боја нема диференцијален чекор, па не се испитува категоријата според Грам. Сино видно поле добиено само со метиленско сино е резултат од едноставно боење, дури и ако шишето стои до реагенсите за боење по Грам. Не го запишувајте како резултат од боење по Грам.

Второ толкување: дали метиленското сино може да го замени сафранинот како контрастна боја во чекор 4. Функционално, може да ги обои обезбоените клетки, а учебничка вежба предвидува виолетови Грам-позитивни клетки и сини Грам-негативни клетки по таква замена. Логиката е исправна бидејќи правилно обезбоените Грам-негативни клетки се речиси безбојни и ќе примат друга катјонска боја. Но тоа не е стандардниот протокол. Протоколите на ASM го наведуваат сафранинот, со прифатени алтернативи како базен фуксин во некои варијанти, но не и метиленско сино. Постои и практичен недостаток: синото потешко се разликува од виолетовото отколку розовото од виолетовото, особено за почетници и особено при ослабено светло од микроскопските ламби. За наставни вежби и за секој резултат што е важен, користете ја контрастната боја наведена во вашиот протокол, обично сафранин, а контрастното боење со метиленско сино третирајте го како демонстрациска варијанта, а не како еквивалентен стандард.

Поврзаното прашање за споредбата на метиленското сино со други опции за боење со една боја е обработено во споредба на едноставните боења на бактерии.

Што докажува боењето на E. coli со метиленско сино, а што не

E. coli е Грам-негативна стапчеста бактерија, но таа реченица обединува факти од неколку методи: морфологија од микроскопија, реакција по Грам од боење по Грам и идентитет од култивирање заедно со биохемиско или молекуларно тестирање. Размаска обоена со метиленско сино придонесува само за првиот дел. Таа утврдува дека во обоениот примерок се присутни стапчести клетки и го покажува нивниот распоред. Не ја утврдува реакцијата по Грам, бидејќи не е спроведен тест со обезбојување. Не го идентификува видот, бидејќи стапчестите бактерии од многу видови изгледаат слично при оваа резолуција.

Токму тука извештаите погрешуваат на предвидлив начин. Авторот внесува претходно знаење („оваа култура би требало да биде E. coli, а E. coli е Грам-негативна“) во записот за набљудувањето, па изгледа дека препаратот го потврдува она што всушност било претпоставено. Појасен извештај ги раздвојува нивоата: „Едноставно боење со метиленско сино: забележани се сини бацили; само морфологија, не е испитувана категоријата според Грам.“ Потоа, ако боењето по Грам е правилно спроведено со контроли: „Боење по Грам: розови стапчиња, во согласност со Грам-негативна реакција.“ Идентитетот на видот се утврдува подоцна, преку постапката за идентификација, а не само според бојата.

Практичен водич за толкување

Користете го ова правило за одлучување при лабораториска работа. Ако сите клетки се во една боја и протоколот користел една боја без средство за обезбојување, сте спровеле едноставно боење. Наведете ги обликот, проценетата големина и распоредот. Застанете тука. Ако протоколот вклучувал кристал виолет, јод, средство за обезбојување и контрастна боја со познати позитивни и негативни контроли, сте спровеле боење по Грам. Наведете ја бојата заедно со морфологијата: виолетови коки во синџири, розови стапчиња и така натаму.

Три грешки се причина за најголемиот дел од забуната. Прво, претерано толкување на сините стапчиња како потврда за E. coli. Второ, заведување на препарат обоен со метиленско сино под насловот „Боење по Грам“ во тетратка, што подоцнежните читатели погрешно ќе го протолкуваат. Трето, непромислена замена на контрастните бои, а потоа споредување на боите меѓу лабораториите како да се користеле исти палети. Секоја грешка има исто решение: наведете го методот што навистина бил спроведен и тврдејте само она што тој метод го испитува.

Едноставното боење го заслужува своето место токму затоа што овозможува ограничени тврдења. Брзо е, толерантно на мали отстапувања и доволно кога прашањето е морфологија: дали нешто е присутно и каков облик има. Кога прашањето е класификација, спроведете го диференцијалниот тест. Синиот препарат ви кажува како изгледаат клетките. Виолетовиот или розовиот препарат ви кажува како се однесуваат нивните ѕидови. Ниту еден препарат, сам по себе, не ви го кажува видот.