Метиленско сино и автофагија: AMPK, mTOR и експерименти со неврони

Замислете дека спроведувате експеримент со клетки, додавате метиленско сино и забележувате дека протеинската лента наречена LC3-II станува потемна на вашиот блот. Примамливо е да објавите дека соединението „ја засилува автофагијата“ и да продолжите понатаму. Таквото толкување е прерано. Потемна лента LC3-II може да значи дека клетката создава повеќе везикули за расчистување, но може да значи и дека везикулите се натрупуваат затоа што чекорот на разградување е блокиран. Овие две толкувања водат во спротивни насоки, а литературата за метиленското сино кај невроните содржи примери за двата вида докази. Оваа статија разгледува што всушност било мерено, анализа по анализа.

Макроавтофагијата, формата што се проучува тука, е процес на масовно рециклирање во клетката. Мембранска вреќичка наречена фагофор расте околу истрошени протеини и органели, се затвора во автофагозом, се спојува со лизозом, а нејзината содржина се разградува и се ослободува за повторна употреба. Невроните зависат од овој редовен процес бидејќи не се делат и не можат преку делба да го разредат уделот на оштетените делови. Кога рециклирањето застојува, отпадот се натрупува. Кога функционира, клетката ги обновува своите градбени единици во услови на стрес.

Што покажа еден експеримент со хипокампални клетки

Главната студија за индукција користела HT22 хипокампални клетки од глувци, изложени на стрес со лишување од серум во текот на 24 часа — состојба што ги отстранува факторите на раст и трофичните сигнали и ги поттикнува и апоптозата и автофагијата. Истражувачите објавиле дека метиленското сино ја намалило клеточната смрт на дозно зависен начин и дека оваа заштита била придружена со знаци на макроавтофагија.

Наодите од маркерите биле конкретни. Дифузното боење на LC3B се прераспределило во перинуклеарни точки почнувајќи од околу 20 nM метиленско сино, со најсилен одговор на LC3-I и LC3-II близу 1 μM. И LC3B-I и LC3B-II се зголемувале зависно од дозата и времето. Клучно е што тимот отишол чекор подалеку од статичен LC3 блот. Додале 10 μM хлорокин, кој го блокира лизозомското расчистување, и откриле повисоко ниво на LC3-II заедно со стабилизиран p62 во клетките третирани со метиленско сино. Тој образец поддржува лизозомски зависен обрт, а не само натрупување. Покажале и дека хлорокинот делумно го поништил антиапоптотскиот ефект, што ја поврзува заштитата со автофагискиот и лизозомскиот пат во овој модел.

Резултатот за сигнализацијата е делот што најчесто се цитира погрешно. Сигнализацијата преку AMPK, проценета преку фосфорилирана AMPK и нејзината низводна цел, фосфорилирана ACC, се зголемила по 12 и 24 часа на дозно зависен начин. Инхибиторот на AMPK, Compound C, применет во концентрација од 20 μM во последните 4 часа, ги намалил и фосфорилацијата на ACC и активацијата на LC3. Наспроти тоа, кај фосфорилираниот mTOR не била забележана мерлива супресија. Значи, во хипокампалните клетки под стрес, наодот бил индукција поврзана со AMPK преку пат што навидум е независен од mTOR. Истиот образец се појавил и кај живи глувци, кај кои третманот со метиленско сино индуцирал маркери на макроавтофагија во кортексот и хипокампусот.

Индукцијата не значи завршен флукс

Тука е најважна разликата меѓу поимите. Индукција значи дека узводниот механизам создава повеќе автофагозоми. Флукс значи дека содржината го минува целиот пат: издвојување, созревање, спојување со лизозом, разградување, рециклирање. Секое зголемување на LC3-II е тврдење за индукција сè додека тест за флукс не го потврди остатокот од патот.

Стандардниот тест за флукс го мери LC3-II со и без краткотрајна лизозомска блокада, како со бафиломицин A1 или хлорокин. Ако третманот навистина го забрзува создавањето, блокирањето на разградувањето треба дополнително да го зголеми LC3-II. Тандемскиот репортер mCherry-GFP-LC3 додава уште еден увид: структурите светат жолто пред спојувањето со лизозомот, а само црвено откако киселата средина ќе го згасне сигналот на GFP, па повеќе исклучиво црвени точки го поддржуваат напредувањето кон кисели автолизозоми. Намалувањето на протеинот p62 може да го поткрепи обртот на содржината, со напомена дека самата транскрипција на p62 реагира на стрес и треба да се провери на ниво на mRNA.

Следната контролна листа ја поврзува секоја анализа користена во оваа литература со она што го мери и со она што не може самостојно да го докаже. Читателите можат повторно да ја користат за секое идно тврдење за макроавтофагија, вклучително и за аргументите за постење и долговечност што се потпираат на овие маркери.

Забележете една терминолошка замка од која штити табелата. Фосфорилираната ACC е ензимски инхибираната форма. Нејзиното зголемување покажува сигнален одговор на AMPK, а не активација на ACC.

Изразот „инхибицијата на макроавтофагијата ја укинала неврозаштитата“ заслужува иста прецизност. Во моделот HT22 тоа значи дека попречувањето на автофагискиот и лизозомскиот пат ја отстранило предноста за преживување што ја давало метиленското сино при лишување од серум. Тоа ја поддржува автофагијата како неопходна или придонесувачка во таа клеточна култура. Не ја утврдува автофагијата како единствениот заштитен механизам на соединението, не докажува дека хлорокинот дејствува исклучиво преку автофагија, а за зацврстување на причинско-последичното тврдење би била потребна генетска интервенција врз ATG5, ATG7 или ULK1.

Два пата кон истиот механизам

Поедноставена шема помага. Енергетскиот стрес ја зголемува активноста на AMPK, AMPK го активира комплексот ULK1 и автофагијата започнува. Факторите на раст и хранливите материи ја зголемуваат активноста на mTORC1, mTORC1 го инхибира ULK1 и автофагијата останува исклучена. Низводно од ULK1, комплексот Beclin-1 и VPS34 го иницира формирањето на фагофорот, LC3-I се липидира во LC3-II, автофагозомот се затвора, се спојува со лизозомот, а содржината се разградува со обрт на p62.

Дијаграмот го поставува секој наод за метиленското сино на оваа шема: хипокампалниот резултат покрај гранката AMPK, а прогениторниот резултат покрај гранката mTOR.

Оваа рамка ја разрешува привидната неусогласеност со втората студија на Xie. Кај пролиферирачки неврални прогениторни клетки од стаорци, посебен експеримент открил дека 5 μM метиленско сино ја инхибирало пролиферацијата и поттикнало мирување, со намалување на Ki67-позитивните клетки на деновите 1 и 3, додека веќе насочената невронска диференцијација останала непроменета. Таму механизмот се одвивал преку потисната сигнализација на mTOR: намален вкупен mTOR и фосфорилиран mTOR, заедно со пониска експресија на p70S6K и 4EBP1, како и намалена регулација на циклините E1, B1, D1 и D2. Доминантниот фенотип бил мирување на прогениторите, што авторите го поврзале со одложена клеточна сенесценција, а не со спасување на хипокампални клетки под стрес.

Нема противречност меѓу двата труда. AMPK и mTOR се интегратори чувствителни на контекстот, а не фиксни прекинувачи. Клетка слична на неврон, изложена на стрес, може да ја ангажира AMPK без мерлива инхибиција на mTOR, додека прогенитор поттикнат од митогени може да одговори на истото соединение со ограничување на механизмите за раст зависни од mTOR. Типот на клетката, контекстот на стресот, концентрацијата и временската точка одредуваат која гранка доминира. Затоа и митохондријалните енергетски и редокс-ефекти на метиленското сино припаѓаат во истата слика: како што опишува преглед на механизмите на неврозаштита, соединението дејствува како алтернативен преносител на електрони, ангажира антиоксидативна и антиапоптотска сигнализација, ги инхибира MAO и NOS и се поврзува со обновувањето на митохондриите преку биогенеза и автофагија. Автофагијата е една гранка на плејотропниот профил, а не целата приказна.

Што не покажуваат експериментите

Лишувањето од серум моделира трофичен и метаболички стрес во клеточна култура. Не моделира постење на цел организам: глукозата, аминокиселините и солите остануваат во основниот медиум, а однесување поврзано со хранење не постои. Концентрациите во културата од 20 nM до 5 μM не можат аритметички да се претворат во дози за луѓе, бидејќи апсорпцијата, врзувањето за протеини, редокс-состојбата, метаболизмот, натрупувањето во ткивата и времето на изложеност се различни.

Ниту едно испитување кај луѓе не е осмислено за да покаже автофагиски флукс индуциран од метиленско сино кај пациенти. Механистичките докази и понатаму се ограничени на клеточни, ex vivo и животински истражувања, а прегледите сè уште ги опишуваат доказите за пренос во клиничка примена како прелиминарни. Затоа овие студии не покажуваат дека метиленското сино го репродуцира постењето, го продолжува човечкиот животен век преку автофагија или го довршува автофагискиот флукс во човечкиот мозок. Тврдењата за имитирање на постењето и за долговечност бараат сопствени клинички докази, а испитувањата на метиленското сино кај луѓе за други индикации не стануваат испитувања на автофагијата само поради поврзаноста. Истражувањата на модели на нутритивен стрес и долговечност треба да се читаат имајќи ја предвид таа граница.

За следниот труд што ќе го читате, применете ја контролната листа по ред. Прво прашајте која гранка се променила: AMPK, mTOR или ниту една. Потоа прашајте дали резултатот за LC3 бил придружен со тест за флукс или стои самостојно. Потоа проверете дали блокирањето на патот ја отстранило користа и со кој метод. Студија што одговара на сите три прашања има основа за силно механистичко тврдење. Онаа што одговара само на првото покажала сигнал што го дозволува процесот, а остатокот од патот останува немапиран.