Метиленско сино како анаеробен и кислороден индикатор: што докажува промената на бојата

Техничарка затвора анаеробен сад, ја проверува индикаторската лента со метиленско сино низ капакот и го гледа она што сака да го види. Лентата преминала од сина во бела. Ја евидентира постапката како анаеробна и продолжува со работата. Два дена подоцна на една плоча нема никаков раст, додека затворена епрувета со течна хранлива подлога во истиот сад покажува знаци на изложеност на кислород. Лентата ја кажувала вистината. Техничарката ѝ поставила погрешно прашање.

Забуната произлегува од мешање на поимите. Анаеробниот индикатор со метиленско сино се заснова на редокс-принцип, а не на принцип за проверка на стерилност или за валидација на целиот систем. Кога таа разлика е јасна, лентата станува прецизен и веродостоен инструмент со тесно определена задача.

Принципот: реверзибилен редокс-пар

Раствореното метиленско сино постои во две состојби. Оксидираната форма е познатиот син катјон. Редуцираната форма, наречена леукометиленско сино, е безбојна. При речиси неутрален pH, поедноставената полуреакција е еден син катјон плус еден протон плус два електрона, при што се добива една безбојна леуко-молекула. Формалниот потенцијал е околу плус 11 миливолти во однос на стандардната водородна електрода при pH 7, што го сместува во опсег што многу редукциски системи можат да го достигнат и во кој кислородот може да ја врати реакцијата во спротивна насока.

За редукција е потребен низок локален редокс-потенцијал. Самото отстранување на кислородот не е секогаш доволно. Раните истражувања на анаеробиозата покажале дека метиленското сино во обична вода без кислород ја задржувало бојата ако немало редукциска супстанција и дека мешавини од течна хранлива подлога со декстроза и околу 0.01 проценти боја лесно се обезбојувале при 37 C, додека истата мешавина чувана при 4 C останувала сина еден ден, како што е наведено во експерименти со свежо ткиво и услови за анаеробно култивирање. Температурата, pH, глукозата, аскорбатот, тиогликолатот и микробната редукциска активност заедно одредуваат дали електроните се достапни.

За повторна оксидација е потребен само кислород. Кога воздухот ќе стигне до леуко-формата, таа повторно станува сина. Современите конструирани индикатори го користат токму овој циклус: боја плус редукциско средство плус стабилизирачка матрица, безбојни при ниско ниво на кислород и повторно сини при изложување на воздух, како што е покажано со хибриден кислороден индикатор со метиленско сино, заснован на боја, редукциско средство, површински активна супстанција и глина. Тој прототип користел 0.01 милимоларна боја со 2.0 милимоларен аскорбат или глукоза при pH 11, станувал безбоен при околу 0.5 волуменски проценти кислород и во својата испитна комора разликувал нивоа под 0.1 проценти од нивоа над 0.5 проценти кислород.

Значи, принципот на работа е едноставен. Сината боја значи дека индикаторската зона е оксидирана. Безбојната состојба значи дека индикаторската зона достигнала редукциски услови со ниско ниво на кислород. Промената е реверзибилна, локална и хемиска. Сама по себе не кажува ништо за микробите.

Како функционира индикаторска лента со метиленско сино во анаеробен сад

Индикаторската лента со метиленско сино за анаеробен сад е мала реакциска зона поставена во атмосферата на садот, каде што може да се гледа без садот да се отвори. Комерцијалните форми се разликуваат: хартиени ленти, таблети што се раствораат или навлажнуваат при подготовката и понови хибридни хартии. На некои им е потребна една капка дестилирана вода за да се активира реакциската зона. Други се уреди во сува форма што мора да останат суви. Меродавно е упатството за конкретниот производ, бидејќи хидратацијата, поставувањето и времето на отчитување се дел од хемискиот процес.

Во практиката, предвиденото отчитување е бинарно. Сината боја значи дека кај лентата сè уште има кислород или недоволно редукциски услови. Белата или безбојната состојба значи дека кај лентата се воспоставени анаеробни редокс-услови. Некои комерцијални хартии имаат дополнителен црвен позадински пигмент, па нивната крајна редуцирана состојба е розова наместо бела. Пред да оценувате, знајте која крајна состојба ја предвидува вашиот производ.

Времето се разликува според системот. Во една поставка од типот GasPak, бледнеењето започнало по околу еден час и завршило во рок од неколку часа, додека во контролирана споредба на собна температура на метиленското сино му биле потребни повеќе од шест часа. Редокс-потенцијалот на подлогите во тоа истражување достигнал околу минус 100 миливолти во рок од 60 до 100 минути, многу пред бојата да ја заврши промената, и бил значително под минус 200 миливолти кога лентата станала целосно безбојна. Индикаторот заостанува зад промените во атмосферата. Сина лента во првиот час не докажува неуспех, а бела лента во шестиот час ја опишува состојбата на лентата во шестиот час.

Од истата причина е важно и поставувањето. Држете ја лентата во гасниот простор над содржината, видлива низ капакот, подалеку од агарните површини и хранливите подлоги. Таа ја покажува состојбата во својата непосредна околина. Ако ја поставите рамно до студен ѕид, ја затрупате под плочи или дозволите да се натопи со кондензат, ќе ја покажува таа микросредина наместо средината во садот.

Што открива лентата, а што не

Гледајте на индикаторот со метиленско сино во анаеробниот сад како на еден сензор на едно место. Тој ги утврдува локалните редокс-услови и условите во однос на кислородот во сопствената реакциска зона, кои во голема мера се репрезентативни за гасниот простор ако мешањето и воспоставувањето рамнотежа се соодветни. Сè надвор од тоа е заклучување, а за заклучувањето се потребни посебни докази.

Безбојната лента не утврдува стерилност. Стерилноста е отсуство на живи организми, докажано со валидирана стерилизација и контролни постапки за валидација на култивирањето. Садот може да биде целосно анаеробен, а сепак контаминиран, или целосно стерилен, а сепак аеробен.

Лентата не го валидира секој дел од системот за култивирање. Растворениот кислород во затворена епрувета, кислородот заробен длабоко во агарот, градиентите во пренатрупан сад и протекувањето што се појавува по отчитувањето не може да ги опфати една лента. Експериментите за просторната распределба покажале соседни сини и безбојни зони во ист сад, каде што навлегувањето на кислородот и редукциската активност биле во различна рамнотежа. Една точка не може да потврди состојба во цел волумен.

Лентата не докажува непрекината анаеробиоза. Лента прочитана еднаш при подготовката не кажува ништо за дваесеттиот час. Поновите истражувања за квалитетот на анаеробните услови предупредуваат дека хемиските индикатори ја опишуваат атмосферата во моментот на отчитувањето и може да изгледаат задоволително и покрај мало количество преостанат кислород. Континуираното документирање или документирањето на контролни точки, а не еден поглед на крајната состојба, е она што ја поврзува лентата со инкубацијата.

За хемиските процеси зад промената на бојата, видете како метиленското сино циклично преминува меѓу оксидирана и редуцирана состојба. За поширокото влијание на кислородот врз ракувањето со примероците, видете ја контролата на кислородот при микроскопија и култивирање.

Дијаграм што треба да стои покрај садот

Сликата подолу ја сумира статијата во еден практичен преглед за лабораториската работна маса. Три состојби на истата лента, двете насоки на реакцијата и границата меѓу доказите од индикаторот и валидацијата на системот.

Видови неуспех што ја задржуваат лентата сина или даваат лажно чувство на сигурност

Повеќето неуспеси спаѓаат во пет групи. Секоја има свои карактеристични знаци.

Сад или вреќичка што пропушта постојано ја снабдува реакциската зона со кислород. Лентата останува сина или повторно станува сина по бледнеењето. Проверете ги капакот, заптивката, стегите и површините за заптивање пред да ја обвините хемијата.

Истрошен или неправилно активиран генератор на гас воопшто не го отстранува кислородот. Кај постарите системи што се активираат со вода, отсуството на кондензација по околу 10 до 15 минути и отсуството на загревање на капакот по околу 20 до 40 минути биле рани предупредувања за тој систем. Кесичка со недоволен капацитет во преполнет сад откажува на истиот начин.

Затруен катализатор се однесува само на постарите системи со водород и паладиум, каде што паладиумот овозможува водородот и кислородот да се соединат во вода. Влагата и водородниот сулфид го деградираат. Многу современи кесички воопшто не користат паладиум, па не применувајте ја оваа мерка таму каде што не е соодветна.

Деградирана лента или лента со која неправилно се ракувало откажува без очигледни знаци. Бојата и редукциското средство ја губат реверзибилноста при складирање, што е една од причините за развој на хибридни формулации отпорни на бледнеење од светлина и губење на функцијата при складирање. Отфрлете ги залихите со истечен рок, залихите со необична почетна боја и лентите што биле навлажнети кога требало да останат суви или оставени суви кога требало да се навлажнат.

Градиентот или задоцнетата реакција го доведува во заблуда читателот, а не хемискиот процес. Недоволно измешаниот гасен простор, затворените епрувети со растворен кислород и полутврдите подлоги ги задржуваат сопствените услови подолго отколку што сугерира лентата. Лентите со резазурин преминуваат преку розова во безбојна состојба и често се рекламираат како побрзи, но нивните прагови се специфични за нивната формулација и не важат за метиленското сино.

Контроли и протокол за отчитување што вреди да се примени

Две евтини контроли ги откриваат повеќето погрешни отчитувања. Заедно со поставката, држете свежа контролна лента на собен воздух. Функционална лента со метиленско сино таму останува сина. Некои спакувани индикатори првично се бледи и стануваат сини при отворањето, што само по себе е проверка на функционалноста. И периодично ставајте свежа лента во претходно валидирана анаеробна поставка. Таа треба да ја достигне валидираната крајна редуцирана состојба во времето наведено за производот. Ако која било контрола не се однесува како што се очекува, заменете ја серијата пред да им верувате на отчитувањата од садот.

Протоколот за отчитување произлегува од механизмот. Поставете ја лентата во гасниот простор, на место видливо без отворање на садот, следејќи го упатството за производот во однос на контактот со ѕидот и навлажнувањето. Евидентирајте ги почетната боја, времето кога садот бил затворен и бојата на контролната точка наведена за производот. Кога садот го дозволува тоа, евидентирајте дека индикаторот останал редуциран на определени контролни точки за време на инкубацијата. Евидентирајте ја конечната боја непосредно пред отворањето. Таа боја пред отворањето е крајната состојба за таа постапка. По отворањето, очекувајте повторно посинување и не дозволувајте тоа да го промени толкувањето на претходниот тек.

Ако лентата остане сина по наведеното време, сметајте ја анаеробиозата за непотврдена. Проверувајте ги елементите по ред: затворањето, кесичката, катализаторот ако го има, хидратацијата и рокот на употреба на индикаторот, а потоа неговата функционалност во споредба со контролата на воздух. Дури откако ќе се потврди атмосферата, треба да се толкува растот или отсуството на раст, користејќи поставка за анаеробно култивирање и контроли со организми соодветни за примената.

Лентата го заслужува последниот збор во сопствениот домен. Сина или безбојна, таа одговара на едно прашање за едно место во еден момент. Поставете ѝ го тоа прашање според распоредот, со контроли покрај неа, и таа ќе одговори веродостојно. Прашајте ја за стерилноста, за секоја епрувета или за целата инкубација врз основа на еден поглед, и никаква индикаторска хемија не може да го спаси толкувањето.