Боење клетки од образ со метиленско сино: што да се набљудува

Ученичка става капка суспензија од клетки од образ на предметно стакло, погледнува низ микроскопот и не гледа речиси ништо. Неколку бледи сенки се движат низ светлото поле. Го дотерува фокусот, потоа го засилува осветлувањето и на крај заклучува дека стаклото е празно. Стаклото не е празно. Клетките се таму. Тие се речиси проѕирни, а токму проѕирноста е проблемот што ова боење треба да го реши.

Вреди да се посочи таа разлика меѓу очекувањето и сликата пред да започне протоколот. Почетниците очекуваат микроскопот да открива детали како што зумот на фотоапаратот открива далечен натпис. Микроскопот со светло поле прави нешто поограничено: покажува разлики во апсорпцијата на светлина. Небоена клетка од образ апсорбира речиси никаква светлина, па создава речиси никаква разлика. Метиленското сино ја додава таа разлика. Се врзува во внатрешноста на клетката, нерамномерно, и ја претвора структурата во контраст. Кога учениците ќе го разберат овој концепт, секој следен чекор станува логична последица, а не само рецепт.

Тука помагаат основни познавања за тоа како едноставните боења додаваат контраст во училишната лабораторија, а потсетувањето на поставувањето микроскоп со светло поле пред боење спречува половина од неуспешните препарати. Хемијата зад бојата е објаснета во воведот во метиленското сино во микроскопијата, кој опишува зошто токму оваа боја толку често се користи во лабораторијата.

Наставниот протокол

Варијантата со влажен препарат подолу е поедноставниот стандарден избор за општата настава. Не бара пламен ниту чекор за фиксација. Варијантата со фиксиран размасок, која се користи во некои универзитетски прирачници, додава сушење на воздух и кратка топлинска фиксација, како во вежбата со размасок од образ на North Central Texas College објавена преку Biology LibreTexts, но топлинската фиксација е вообичаена микробиолошка практика, а не услов за да се видат епителните клетки.

Што ви е потребно: чисти предметни и покривни стакла, стерилни брисеви за еднократна употреба (претпочитани) или нови рамни чепкалки за заби, шишенце со капалка со 0.5 до 1 процентен воден раствор на метиленско сино, дестилирана или дејонизирана вода, впивлива хартија, ракавици и сложен микроскоп со вкупно зголемување од 100x и 400x.

1. Исплакнете ја устата со обична вода. Така се отстрануваат честичките од храна што подоцна се бојат интензивно и го одвлекуваат вниманието од клетките.
2. Секој ученик зема примерок само од сопствениот образ. Нежно протријте ја внатрешната страна на образот со нов стерилен брис. Притискајте, не стругајте. Запрете многу пред да се појави каква било непријатност или крвавење.
3. Со тркалање на брисот нанесете тенок слој преку средината на чисто предметно стакло. Тенкиот слој е најважниот предуслов за јасен препарат. Дебелиот бел нанос по боењето ќе стане неразбирлива сина маса.
4. Додајте една капка метиленско сино врз размасокот. Оставете ја 1 до 3 минути. Една минута е доволна во многу универзитетски протоколи; лабораторискиот прирачник по природни науки на NCERT за IX одделение предвидува околу 3 минути за привремен препарат. Подолго не значи подобро, а предолгото боење е најчестата грешка во времетраењето.
5. Нежно исплакнете со дестилирана вода или впијте го вишокот боја со впивлива хартија, следејќи го локалниот протокол. Заднината треба да стане бледосина, а не темносина.
6. Спуштете го покривното стакло под агол така што прво ќе допре еден раб, а потоа полека спуштете го остатокот. Така се спречува внесување воздушни меурчиња.
7. Почнете со мало зголемување за да ги најдете клетките, проверете ги фокусот и центрирањето, а потоа преминете на 100x и на крај на 400x. При 400x користете само фино фокусирање.

Концентрацијата на бојата заслужува една прецизна напомена. Училишните протоколи најчесто користат околу 1 процентен воден раствор на метиленско сино. Поконцентриран основен раствор или подолга изложеност ја затемнува заднината побрзо од јадрото, со што се превртува контрастот од кој зависи вежбата.

Безбедно ракување со материјалот од образ

Примероците од образ содржат плунка и нормални орални микроорганизми, па секој свеж размасок третирајте го како потенцијално инфективен материјал, иако донорите се здрави соученици. Насоките за биолошка безбедност во наставни лаборатории на Американското здружение за микробиологија ги наведуваат општите принципи: проценете го ризикот пред часот, носете ракавици, заштитете ги очите кога е можно прскање, измијте ги рацете потоа, дезинфицирајте ги работните површини и отстранете го контаминираниот прибор за еднократна употреба според одобрената постапка за биолошки отпад.

Четири правила за часот го покриваат најголемиот дел од ризикот. Еден донор по брис и по предметно стакло, без споделување. Секој зема примерок само од себе, никогаш од соученик. Брисевите и чепкалките за еднократна употреба одат директно во назначениот сад за отпад, никогаш назад на работната површина. Самото метиленско сино остава дамки на кожата и облеката и ги иритира очите, па се применуваат ракавици и вообичаените хигиенски мерки при работа со бои. Не проширувајте ја оваа вежба со одгледување култури од каков било материјал од размасокот и не импровизирајте топлинска фиксација на свеж човечки материјал надвор од училишната безбедносна постапка.

Што да се набљудува и зошто изгледа така

При 100x, барајте широки, рамни, бледосини клетки со неправилни овални или многуаголни контури. Тие лежат поединечно или во лабави слоеви што се преклопуваат. Секоја клетка обично има една потемна сина точка. Таа точка е јадрото. Забележете го и распоредот: плочестите епителни клетки се тенки плочки, а не сфери, поради што нивните рабови изгледаат како испукана глазура, а не како тркалезни балони.

При 400x, јасно се разликуваат три карактеристики. Границата на клетката изгледа како тенка потемна линија што ја опкружува клетката. Цитоплазмата ја исполнува внатрешноста со светла, рамномерна сина боја. Јадрото е потемно и покомпактно, често овално, обично близу до средината, но не секогаш. Побарајте од учениците да ги запишат сите три, како и обликот и зголемувањето, бидејќи работниот лист го бара токму тоа.

Тука е важна една напомена за точноста, која многу работни листови ја прикажуваат погрешно. Видливата граница одговара на подрачјето на плазматската мембрана, но самата мембрана, липиден двослој дебел приближно 7 до 10 нанометри, е далеку под границата на разрешување на училишен микроскоп. Учениците го гледаат оптичкиот раб на клетката заедно со бојата насобрана таму. Истата претпазливост важи и за органелите. Митохондриите, ендоплазматскиот ретикулум, Голџиевите тела и рибозомите не се гледаат во овој препарат. Конвенционален светлосен микроскоп во добри услови може да разликува детали до приближно 0.2 микрометри, како што објаснува прегледот на микроскопските алатки во клеточната биологија на NCBI, а најголемиот дел од ултраструктурата е под или близу до таа граница. Поголемото празно зголемување ја зголемува сликата без да додаде детали.

Зошто јадрото се бои најтемно? Метиленското сино е катјонска боја, позитивно наелектризирана во раствор, и се поврзува со негативно наелектризиран материјал во клетката, пред сè со нуклеински киселини. Хроматинот ја концентрира ДНК во јадрото, па јадрото собира најмногу боја. Цитоплазмата содржи РНК и други наелектризирани молекули, па и таа се бои, но пораспрснато и посветло. Клучната ограда: метиленското сино не е боја специфична за ДНК. Истражувањето за распределбата на метиленското сино при снимање на јадрата опишува поврзување на катјонот со подрачја богати со нуклеински киселини, а постаро квантитативно истражување за врзувањето на метиленското сино во клеточни препарати утврдило дека најголемиот дел од врзаната боја е поврзан со нуклеински киселини. Затоа, темното јадро со светла цитоплазма е образец на контраст, а не молекуларна анализа.

Грешки што учениците ќе ги направат и како да се препознаат

Речиси секој неуспешен препарат спаѓа во еден од пет обрасци. Научете ги учениците да го утврдат проблемот со препаратот наместо слепо да ја повторуваат постапката.

Прекумерното боење ги прави клетките и заднината рамномерно темни, па јадрото се губи во видното поле. Поправете го тоа со пократко време на боење или потемелно плакнење. Недоволното боење остава бледи сенки што исчезнуваат кога ќе се засили светлината; продолжувајте го времето во чекори од триесет секунди. Дебелите размасоци создаваат густи маси што се преклопуваат, во кои не може да се проследи ниту една контура; исправката е механичка: следниот пат нанесете потенок слој, бидејќи никакво плакнење не може да спаси куп клетки. Воздушните меурчиња изгледаат како совршени кругови со остри темни рабови и го одвлекуваат вниманието на почетниците што ги заменуваат со структури; повторно поставете го покривното стакло полека и под агол. Ситните темни точки расфрлани врз или околу клетките обично се нормални орални бактерии, како што забележуваат училишни протоколи, на пример постапката со клетки од образ на Ingrid Science. Тие потврдуваат дека во устата живеат микроорганизми, што може да им остане во сеќавање на учениците, но во оваа вежба не може да им се одреди видот и не треба да се цртаат како делови од клетката. Остатоците од храна и нишките од слуз се бојат нерамномерно и интензивно; претходното плакнење служи за нивно намалување.

Што не може да направи оваа вежба

Ова е образовно набљудување, а не дијагностички тест. Ништо во изгледот на клетките при боење на час не може да дијагностицира инфекција, рак или каква било болест, и статијата не треба да се толкува како да сугерира нешто поинакво. Препаратот ги покажува обликот, границата, цитоплазмата и јадрото при две зголемувања. Не ја покажува ултраструктурата на мембраната, деталите на органелите или молекуларниот идентитет. Јасното наведување на ограничувањето ги штити и науката и учениците: добар резултат е правилно означен цртеж со запишани зголемување и боја, а не заклучок за здравјето.

Ученички работен лист и означени микрофотографии

Двата проектни материјали за оваа страница се означената микрофотографија погоре и работниот лист подолу. Испечатете по еден работен лист за секој ученик или прикажете го со проектор и побарајте учениците да ги прецртаат полињата во тетратките.

Како да се користи на час од 45 минути: десет минути за безбедносни упатства и земање примероци, десет минути за боење и поставување на препаратите, петнаесет минути за набљудување и скицирање при двете зголемувања, десет минути за контролната листа и споредба со означената микрофотографија. Ставките во контролната листа намерно се едноставни и конкретни. Тенок размасок, правилно време на боење, јадро потемно од цитоплазмата, запишано зголемување. Ученик што може да ги потврди сите четири го разбрал концептот што оваа лекција треба да го пренесе: микроскопите прикажуваат разлики, а боите ги создаваат разликите што вреди да се прикажат.