Објаснување на алкалното метиленско сино на Лефлер и полихромното метиленско сино

На работната маса за боење може да стојат три шишиња едно до друго, секое означено како некаква варијанта на метиленско сино. На едното пишува водно метиленско сино 1%. На другото — алкално метиленско сино на Лефлер. На третото — полихромно метиленско сино. Зафатен лабораториски работник го зема она што му е најблиску. Размаската потоа се бои премногу бледо, премногу еднообразно сино или во неочекувани виолетови нијанси, а вината за резултатот му се припишува на примерокот.

Ова е проблем со формулацијата, а не со примерокот. Трите раствори содржат сродни боила, но се засноваат на различни концепти на боење. Едниот е обично катјонско боило со речиси неутрална pH. Другиот е истото боило, чие дејство е засилено со алкалија. Третиот веќе воопшто не е единечно боило, туку намерно оксидирана мешавина. Ако го употребите погрешниот, принципот на боење се менува додека работите.

Краткиот одговор

Обичното водно метиленско сино е основната варијанта: околу 1% боило во вода, едноставно катјонско боило за бактериска морфологија и општа микроскопија. Кај алкалното метиленско сино на Лефлер, во алкохолен матичен раствор разреден со вода се додава мало, измерено количество разредена алкалија, што ја зголемува pH и го засилува врзувањето на катјонското боило за киселите бактериски структури. Полихромното метиленско сино е метиленско сино што е намерно созреано со оксидација во алкална средина, па шишето содржи мешавина од деметилирани хомолози (azure A, azure B, azure C), тионин и метиленско виолетово, покрај преостанатото метиленско сино, а таа мешавина ги бои различните структури во различни нијанси.

Ако треба да запомните само една реченица: алкализацијата го менува интензитетот на боењето, додека полихромирањето ги менува боите што се добиваат.

Обично водно метиленско сино: појдовната точка

Наједноставната формулација е метиленско сино растворено во вода, обично со концентрација од 1% w/v, без алкалија и без оксидација. Обоениот хемиски вид е метилтиониниумскиот катјон со хлориден противјон, мало рамно фенотијазинско боило опишано во записот за метиленско сино во PubChem како метилтиониниум хлорид. Како катјон, тој се врзува за фосфатниот скелет на нуклеинските киселини и за киселите групи на бактериските клеточни ѕидови, обојувајќи ги клетките сино на светла заднина.

Неговата предност е предвидливоста. Јадрата и бактериите изгледаат сини. Контрастот е умерен. Слабо видливите организми може да се обојат бледо, што е токму ограничувањето што Лефлер се обидел да го надмине. За пошироката група едноставни бактериски боења на која ѝ припаѓа овој раствор, погледнете преглед на едноставното боење на бактерии. И тука е важно точно да се утврди идентитетот: метилското сино е сосема поинаква молекула, како што е објаснето во метилско сино наспроти метиленско сино, па пребарувањето во каталог само според името на бојата може да ве доведе до погрешна класа боила.

Алкално метиленско сино на Лефлер: истото боило, со засилено дејство

Класичниот рецепт на Лефлер комбинира алкохолен матичен раствор на метиленско сино со разредена алкалија во вода. Верзиите во учебниците наведуваат 0.3 g боило во 30 mL 95% етанол, плус 100 mL 0.01% воден раствор на калиум хидроксид (или, еквивалентно, 30 mL заситен алкохолен раствор на метиленско сино, 100 mL дестилирана вода и 1 mL 1% KOH), со што се добива работен раствор со околу 0.3% боило и изразено алкална pH. Комерцијалните верзии го следат истиот принцип, а каталогот на микробиолошки боила на Thermo Fisher го наведува алкалното метиленско сино на Лефлер покрај полихромната и водната варијанта како одделни каталошки производи со различни намени.

Клучната улога ја има алкалијата. Зголемувањето на pH ги депротонира карбоксилните и фосфатните групи на примерокот, зголемувајќи ја густината на негативно наелектризираните места, додека алкохолниот матичен раствор го одржува боилото целосно растворено, така што до тие места пристигнува во мономерна форма. Резултатот е побрзо и поинтензивно боење на бактериите отколку со неутралното водно боило, со познатите темносини стапчиња и коки во рутинска бактериолошка размаска. Боењето обично трае од една до три минути, по што следува плакнење со вода.

Класичната примена е кај Corynebacterium diphtheriae одгледана на серумска подлога на Лефлер: тенки стапчиња, често со задебелени краеви, со силно обоени метахроматски гранули на Бабеш-Ернст што содржат складиран полифосфат. Поврзувањето на подлогата и боилото е историско, и двете му се припишуваат на истиот бактериолог, а контрастот на гранулите е дијагностичката придобивка. Освен при работа со дифтерија, боилото служи како општо бактериолошко боило за размаски од култури, за морфологијата на Neisseria во клинички размаски и секаде каде што боењето по Грам не е потребно, но обичното водно сино дава премногу блед резултат. Тоа е монохромно боило. Сè што е кисело добива некаква сина нијанса. Кога протоколот бара разликување по боја, самата алкалија не може да го обезбеди тоа.

Едно практично предупредување: алкалните раствори на боила се влошуваат и создаваат талог при складирање и апсорпција на јаглерод диоксид. Лабораториите или подготвуваат умерени количества или го купуваат каталошкиот раствор и го почитуваат неговиот рок на употреба, наместо да продолжат да користат старо шише што веќе остава талог на секое предметно стакло.

Полихромно метиленско сино: едно име, повеќе боила

Полихромното метиленско сино се добива од истото боило, но преку контролирана оксидација во алкална средина, историски наречена созревање или полихромирање. Стареењето во алкална средина, загревањето со карбонат или оксидацијата со агенси како дихромат постепено ги отстрануваат метилните групи од диметиламино-супституентите. Производот е мешавина: преостанато метиленско сино плус azure B (со една изгубена метилна група), azure A и azure C (со понатамошна деметилација), тионин (целосно деметилиран) и оксидативни споредни производи од семејството на метиленското виолетово. Секоја компонента има сопствена нијанса и афинитет кон ткивата, па мешавината бои метахроматски: јадрата, гранулите, муцините и ’рскавицата добиваат различни тонови од сино до црвено-виолетово.

Оваа хемија е истата што стои зад познатите боила за крв. Раните истражувачи откриле дека алкализираното метиленско сино ги бои јадрата на паразитите на маларија во виолетови нијанси, но нивните водни созреани раствори биле нестабилни и создавале талог за неколку дена. Прегледот за тоа како било изумено виолетовото боило за крв опишува како Малаховски и Романовски независно го искористиле овој ефект во 1891, како бил воведен метанолот за да го стабилизира талогот од боилото и да ги фиксира размаските без топлина и како Гимза подоцна ја стандардизирал мешавината со измерено количество azure B плус еозин, со стабилизација со глицерол. Современите боила од типот Гимза потекнуваат директно од полихромното метиленско сино плус еозин, комбинацијата што го создава ефектот на Романовски. За подробности за комбинацијата со еозин и компонентата azure B, видете боила од типот Романовски и интеракцијата меѓу azure B и еозин.

Бидејќи е мешавина, полихромното метиленско сино по својата природа е најмалку стандардизирано од трите. Неговата точна рамнотежа на нијанси зависи од постапката и степенот на оксидација, поради што добавувачите на хистолошки материјали го продаваат како посебен производ со сопствено тестирање на перформансите, а не како остарен раствор на Лефлер. Типичните примени вклучуваат метахроматско прикажување на гранули на мастоцити, муцини и ’рскавица, детали на плазма-клетки и Helicobacter pylori во ткивни пресеци со полихромни методи од типот Гудпастур. Тоа е вистинскиот избор кога целта е разликување по боја, а погрешниот кога протоколот очекува јасна монохромна бактериска силуета.

Споредба на формулациите и намените

Читајте ја табелата како постапка за донесување одлука. Ако примерокот се бои премногу бледо, сменете го пристапот кон pH и земете го растворот на Лефлер. Ако сè се бои, но ништо не се разликува, сменете го концептот на боилото и земете го полихромното. Ако размаска обоена со растворот на Лефлер прекрасно ги прикажува гранулите, но претпоставениот прашува зошто јадрата и цитоплазмата ја имаат истата сина боја, одговорот е дека ниедно алкално монохромно боило не може да ја изврши таа задача. Тоа прашање припаѓа на полихромното семејство и неговите деривати за боење крв.

Избегнување на вообичаените забуни

Две грешки се причина за најголемиот дел од забуната. Првата е растворот на Лефлер да се смета за заменлив со обичното метиленско сино затоа што и двата изгледаат сини во шишето. Тие се разликуваат по pH и интензитетот, а замената со неутрално боило таму каде што е наведен растворот на Лефлер го губи токму контрастот на гранулите околу кој е осмислен протоколот. Втората е секое старо или случајно остарено алкално сино да се смета за полихромно. Неконтролираното стареење создава непозната мешавина со непозната јачина, додека вистинските полихромни раствори се подготвуваат со дефинирани постапки на оксидација и, во линијата на боила за крв, се комбинираат со измерено количество еозин. Историјата тука е поучна: нестабилните водни созреани раствори од 1890-тите им отстапиле место на стабилизирани метанолни формулации токму затоа што неконтролираните мешавини не можеле да се репродуцираат, лекција што вреди да се потсети пред боење дијагностички препарат со раствор од шише со неизвесна старост.

Доследноста во именувањето ја заокружува сликата. Потврдете ги каталошкиот производ (воден, на Лефлер или полихромен), содржината на боилото и предвидената примена на етикетата, наместо да заклучувате според бојата. Трите формулации имаат заеднички хромофорен предок. Немаат заедничка намена.